常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍

1、常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍(2011-04-23 11:01:29)转载 标签： 分子生物学 细胞生物学 常用实用技术 基本实验室技术 生物学实验 教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用 的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定 性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的 条件下(适宜的温室度及离子强度等)可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核 酸序列及探针( probe ),待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的

2、基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记 的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性 质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交( solid-phase hybridization )是将变性的 DNA 固定于固体基质(硝酸纤维素 膜或尼龙滤膜)上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交( dot hybridization ) 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或 RNA 探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶

3、消化或凝胶电永 分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可 以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且 特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交( blotting hybridization ) Southern 印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的 DNA 片段，将凝胶上的 DNA 变 性并在原位将单链 DNA 片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定， 再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检 测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量 分析、

4、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交：由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚 乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定 mRNA 分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程 度。 差异杂交（ differential hybridization ） 是将基因组文库的重组噬菌体 DNA 转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同 cDNA 探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的 DNA 杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的

5、基因。适用于基因组 不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复 杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5左 右），价值不大。 cDNA 微点隈杂交（cDNA microarray hybridization ） 是指将cDNA克隆或cDNA的PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上 （如：尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不同 DNA 探针与微点阵上的 DNA 进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信 息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品 问世。

6、其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。 寡核苷酸微点隈杂交( oligonucleotide microarray hybridization ) 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共价结合于支持物表面，与平均长 度为20-5Ont的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应 用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度 mRNA 的检测，以 区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择 性剪接。但有工作量较大、成本较高、速度较慢等弱点。 液相杂交( solution hbridization ) 指使

7、变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链(探针)在溶液中保温， 使之形成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交 双链分开，然后结膈后在杂妆分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。 递减杂交( subtractive hybridizatio ) 是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取mRNA (或逆转录成的cDNA)，在一 定的条件下以过量的驱动 mRNA或cDNA与测试的单链cDNA或mRNA进行液相杂交， 通过羟基磷灰石柱层析筛选除去两者间同源的杂交体。经多轮杂交策选、除去两者之 间相同的基因成分，保留特异表达的目的基因或工基因片段。以后者筛选cDN

8、A 文库， 可获得特异表达的目的基因 cDNA 全长序列。 核酸原位杂交 用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞级或组织切片中核酸进行复性杂交并对其 实行检测的方法，称为核酸原位杂交( nucleic acid hybridization in situ )。用来检测 DNA在细胞核或染色休上的分布，与细胞内RNA进行杂交以研究该组织细胞中特定基 因表达水闰；还用于细胞、组织中有无特异性菌、病毒检测的研究。 该法的优点是特异性高，可精确定位；能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而 不受同一组织中其他成分的影响；不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的 靶序列有极高的敏感性；并可完整地保持

9、组织与细胞的形态。因此被广泛应用于医学 生物学的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特异基因整合部物色检测等研究。 近年来由定性发展到定量，方法更为完善。 DNA 分子克隆技术（也称基因克隆技术） 在体外将 DNA 分子片段与载体 DNA 片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中 DNA 分子克隆（或基因克隆）。其基本步骤包括：制备目的基因一将目的基因与载体用限制 性内切酶切割和连接，制成 DNA重组-导入宿主细胞-筛选、鉴定-扩增和表达。载 体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的 DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些

10、与亲本分 子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA 片段不 同，有两种 DNA库，一种是基因组文库（genomic library ），另一种是cDNA库。 载体 所谓载体是指携带靶 DNA 片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细 菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人 工改造拼接而成。最常用的质粒是 pBR322 。 噬菌体（ phaeg ） 噬菌体是感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型。 用野生型入噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线

11、性双链DNA,基因组约为50kb，最常 用的哓菌体为入DNA及其衍生系列。 黏性质粒（cosmid ）是由质粒与噬菌体入DNA组成的一种4-6kb的环状杂种DNA。 表达型载体 将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列 组成了表达型载体。 基因库的建造 含有某种生物体全部基历的随机片段的重组 DNA 克隆群体，其含有感光趣的基因片段 的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的 克隆经过纯化和扩增，可用于进 一步的研。其主步骤包括：（ 1）构建基因库迅速的 载体；（2）DNA片段的制备；（3） DNA片段与载体DNA的连接；（4）包装和接种

12、。 cDNA 库的建造 是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自 mRNA制备的cDNA。cDNA库包括某特定细 胞的全部 cDNA 克隆的文库，不含内含子。 特异基因的筛选 常用的方法有：（ 1）克隆筛选即探针筛选法； （2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质 来筛选目的基因；（ 3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因； （4）免疫沉淀 法，进行特异基因的筛选。 核酸序列测定 DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析 （测序，sequencing ）是分子生物 学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需 进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限

13、制性内切酶图谱，分析基 因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病 机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前 最常用的方法有 Maxam-Gilbert 的化学降解少和 Sanger 的双脱氧法等，近年来已有 DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5端标记核素，然后用专 一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供 测读序列和进行比较。一般能读出 200-250 个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链 终止剂，如：2，3-双脱氧核苷三磷酸 ddNTP（如ddTTP、ddTTP、ddG

14、TP和ddCTP 中的一种）掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入 4种正常的dNTP的混合物分成四 组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA 片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补 原则，可推算出模板 DNA 分子的序列。 化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的 寡核苷酸引物及高质量的 DNA聚合酶，便随着 M13噬菌体载体的发明和运用，合成的 引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。基脱氧法的自动激光荧光 测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。至于RNA测序

15、现大多采用将 mRNA逆转录成cDNA后同测序，然后反推 RNA序列 聚合酶链反应技术 聚合酶链反应技术简称 PCR技术，是一种利用 DNA变性和复性原理在体外进行特定的 DNA片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列(甚至少到1个拷贝)。在模板 DNA、 引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用 极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反 应分三步：变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模 板，这样经过九小时的循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，这样经过数上 时的循环后，可得到大量复制的特异

16、性DNA片段。反应条件一般为 94 C变性30秒， 55 C退火30秒，70-72 C延伸30-60秒，共进行30次循环左右，最后再延伸 72 C 5 分钟，4 C冷却终止反应。 1. 逆转录PCR(RT-PCR)用来扩增RNA的方法。 2. 竞争逆转录 PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT- PCR)低丰度RNA定量的好方法。 3多重PCR (multiples PCR )在同一 PCR体系中加入多对引物可用于基天长度很长, 发生多处缺失的觳狻丁鐾荒0宓募父銮颉？br 4多种PCR可同时加入多套

17、以生物素标记的引物起进手PCR反应。 5. 反向PCR (iverse polymerase chain reaction)对一个已知的 DNA片段两侧的未知序 列进行扩增和研究。 6. 不对称PCR在扩增循环中引入不同引物浓度，以得到单链DNA并进行列测定，以了 解目的基因的序列。 7. 锚定 P C R（ anchored polymerase chain reaction ）帮助克服序列未知或序列未全知 带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内 切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。 8. 着色互补试验或荧光 PCR

18、（ color complementation assay or fluorescent PCR）原理 是用不同荧光染粒，分别标记于不同寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA片段，反应 完毕后，利用分子筛选去多余的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一DNA 区 带荧光染料颜色的组合，如果某一 DNA 区带荧光染色料颜色的组合，如果某一 DNA 区带缺失，则会缺乏相应的颜色。 9. 双温 PCR（two-temperature PCR ）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。 一般常用温度是94-95 C和46-47 C。可以提高反应的速度和特异性。 上述这些PCR技术的应用：（1） PCR

19、技术扩增特定序列为基础，采用多种方法进行 检测，女口 PCR-RFLP、PCR-SSCP从已克隆的双链 DNA中产生特异性序列作为分子探针; （2）通过选择性扩增 cDNA 中产生特异性序列作为分子探针；（ 2）通过选择性扩增 cDNA中的特殊片段，产生针对尚未克隆的基因的探针；（ 3）从微量mRNA中产生 cDNA 文库;（ 4）产生大量用于序列分析的 DNA;（ 5）分析 基因突变;（ 6）做染 色体步移。 10. 原位PCR技术：PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的 DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织 细胞特征相联系，这

20、是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于 其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。而 原位PCR （In situ PCR,简称IS PCR），它可使扩增的特定 DNA片段在分离细胞和组 织切片中定位，从而弥补了 PCR和原位杂交的不足，具有良好的应用前景。目前，已 有多种设计的原位PCR扩增仪系统问世，使操作简便，软件灵活，已成为拉增固定细 胞和石蜡包埋组织中特定 DNA和RNA序列的有用工具。 IS PCR的技术特点 （1）既具有 PCR 的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2）测到低 于 2 个拷贝量的细胞内特定 DNA 序

21、列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原 病毒 DNA；（ 3）有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；（4 ） 可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定与区别。 IS PCR 的基本方法 IS-PCR是PCR和原位杂交两种技术的绫事，实质是一种将靶DNA或RNA在原位扩增 后再进行原位杂交的技术，操作程序基本兼有两种技术的所有过程，首先在适当处理 的细胞和组织切片上滴加 PCR反应液，然后把载玻片放入热循环仪中进行扩增，最后 通过标记的探针进行原位杂交检测扩增产物。 初步应用 有关原位PCR技术应用成功的第一篇报道是对感染绵羊中枢神经系统visna病毒在绵 羊脉络从一细

22、胞中检查，通过 PCR扩增，仅用150碱基对的短探针就可通过 ISH检查 到了细胞内的visna病毒。从开始在试管内细胞行 PCR扩增后再涂片做ISH（原位杂交） 检查，已发展到用福尔马林固定、石蜡切片的常规病理组织方法做原位PCR检查。有 传统的标记探针的原位 PCR法（间接法），也有将标记物先标记PCR的引物，让标记 物扩增后再行ISH检查的直接法。因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能获得统一， 也即未能比较出哪一种方法最可靠简便，各家报道的原位PCR技术中，在标本处理和 种类上尚不同（细胞悬液、涂片、组织切片等），想检测的靶核酸也不同（病毒或体 细胞的DNA或mRNA），扩增的方法上有

23、不同（单引物、多引物），最后显示的方法 也不同（直接法、间接法）。这些还都有待在今后的工作中积累经验，以求一致。 原位PCR应用的课题，目前正片于开始阶段，还很局限，对人体 B细胞淋巴瘤中Ig单 拷贝基因重组的检查以及对人体外周血中单核细胞 HLA-DQ 不同亚型的测定，归纳起 来，主要应用于两方面；（ 1）检测外源怀基因片段，集中在病毒感染的检查上，如 HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、 易位的染色体、 Ig 的 mRNA 片段、癌基因片段等。 基因转染技术 将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本 问题的研

24、究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。目 前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转 基因动物等研究。本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒 方法的基因转染( transfection )技术。 基因运载系统 将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概 括为两大类：非病毒辣方法和病毒方法。 1.基因转移的非病毒方法 直接注射法 将含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入DNA燕进行 表达，在肌细胞中，基因表达可持续数月。 磷酸钙共沉淀法 将氯化钙、 DNA 和磷酸盐缓冲液混

25、合，形成磷酸钙微沉淀 ，附着于 细胞膜并经过细胞内吞作用耐是入细胞质。该方法的转化效率通常很低。 脂质体染法 指质体能在体内或体外提供运载外源性遗传物质进入细胞的载体。脂质体 介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用。 受体介导的基因转移 依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因。受体介导的基因 转移方法是在质粒 DNA 和某种特异的多肽(配体)之间形成复合体，而这种多肽能为 细胞表面的肥体所识别。如若将 DNA在体内运送至肝内，可以选将 DNA和能与肝细 胞受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶联，以便通过细胞内吞过程而被摄入，这种 DNA 大部分被肝脏所摄取。应用该方法转移的外源基因在活体内的

26、表达持续时间较短， 在评估实际应用前影上还在一些问题。 显微注射法 在显微镜下，将 DNA 经同细胞玻璃针地接注入细胞，该法适合于各种培养 生长的细胞，但需要一定的设备和操作用支巧。 电穿孔法 利用脉冲场将 DNA 导入培养细胞。 微粒子轰击法（基因枪）近几年发展较快的转移方法。使用高能微粒子轰击将 DNA 导 入培胞或活的哺乳动物组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA,将这些微弹加强 速到很的速度轰击细胞。实验结果表明，用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、 胃和乳腺等细胞中表达。 胚胎干细胞法 胚胎干细胞是从受精卵开始分裂至 4 个国胞阶段未分化和具有多种潜能 的生殖细胞，能在体外培养

27、，可作为正面细胞，制备转基因动物，以研究基因定向整 合或基因剔险及基因及能。 精子载体法 最近发现用精子和NDA-剂孵育，可捕获得 DNA。通过受精过程，将外源 性基因导入受精卵，可捕获得物物，大大间化了转基因动物的制备过程。 2.基因转移的病毒的方法 病毒作为基因转移的是基因递送有有并工具，病毒载体的优点有：（1）在转化的细胞 中传播重组的 DNA 分子作为稳定的遗传成分；（ 2）在可能将有有制陷的或突变的基 因置于病毒调节信号的控制下以进行研究；（3）能将克隆的基因作为病毒微染色体的 一部分 ，并能进分离；（ 4）转移效率较高。其主要缺点是病毒载体对外源基因的最 大容纳量只有 2500bp

28、 。目前常用的病毒载体有下列几种。 逆转录病毒载体 逆转录病毒辣为 RNA 病毒，它们的基因组编码在一条单链RNA 他妇 上，病毒进入细胞通过逆转录作用，病毒RNA即转变为双链DNA分子，DNA进入细 胞核并整合在细胞染色体中，这种整合的病毒称为原病毒。在原病毒的两端各有一长 末端重复序列（ LTR）,LTR 内侧还有为复制所必需的其他顺序，包括包装信号。目前 常用的逆转病毒载体有 CMV和SV。 DNA 病毒载体 主要有腺病毒相关病毒载体，腺端正毒载体，疱疹病毒载体。对 DNA 病毒载体的研究是当前基因基因治疗研究中的重点领域。 常用的基因转染技术 将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方

29、法，基因转技术则是将纯化的含有靶 基因的质粒 DNA 送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法有多种，根据不同的细胞， 贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的 因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA 的纯度、靶细胞的生长状态等，下 面重点介绍向几种常用的转染技术： 靶细胞的准备 被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染 效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬 液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的 60% 为宜，转染当日，在转 染前 4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前

30、 4 小时换一次新鲜培 养液。 靶基因质粒DNA的准备 用于转染的质粒 DNA必须无蛋白质，无 RNA和其了化学物质 的污染， OD260/280 比值应在 1.8以上。应用酚 -氯仿抽提法制备的质粒 DNA 一般难 以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。 具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转 染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后 48 小时，靶基因即在 细胞内表达。根据不同的实验目的， 48 小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如 若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标 志选用相应

31、的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素( hygromycin )和 新霉素( neomycin )。 转基因动物的建立和应用 转基因动物是以实验方法交源基因导入宿主受精卵或早期胚胎细胞染色体基因组内， 使其稳定整合和遗传给后代动物。它主要采用显微注射法、逆转录病毒载体感染法、 精子载体法、电转移法与胚胎干细胞法。 转基因动物模型的建立，推动了肿瘤在分子水平上的研究，它使人们认识到激活的原 癌基因的异常表达及功能失常，是肿瘤发生的初阶段。将癌基因与特定细胞的调控序 列连在一起，可使癌基因在特定细胞中表达，研究靶细胞对不同癌基因的易感性，阐 明某一癌基因对特定细胞生长、分化及功能的影响

32、；它还可以研究多种基因的协同作 用，有助于对多步骤致癌机进行深和的探讨。 转基因小鼠不但用以研究癌基因的功能，还可以通过使某一基因功能丢失(如用基因 剔除技术)研究抑癌基因在肿瘤发一中的作用。另外，转基因小鼠对致癌原的测试， 为肿瘤的预防，治疗及发现新的致癌物质都提供了有价值研究工具。 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类 细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测， 1985 以前，利用 Southern 印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检 测的突变，只能应用复杂费时的 DNA 序列测定

33、分析法。多聚酶链反应( polymerase chain reaction,PCR )技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足 的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于 PCR 的基础之上， 并且由 PCR 衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高， 分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性 ( single-strand comformational polymorphism,SSCP )和异源双链分析法 ( heteroduplex analysis,HA )。下面分别介绍几种 PCR 衍生技术及经典突

34、变检测方法， 可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子 依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶 上的移动速度改变。其基本原理为单链 DNA 在中性条件下会形成二级结构，这种二级 结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的 迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法 检测小于 200bp 的 PCR 产物时，突变检出率可达 70 -95，片段大于 400bp 时，检 出率仅为50 %左右，该法可能会存在

35、 1 %的假阳性率。应用 PCR-SSCP法应注意电泳 的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准 确位点，还需通过序列分析来确定。 Sarkar 等认为对于大于 200bp 的片段，用其 RNA 分子来做SSCP会提高其录敏度。应用 PCR-SSCP佥测点突变已见报道于人类大部分的 肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包 括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第 5-8 外显子即可发现 85%以上的 p53 基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因 突变研究的筛选工作。 异源双链分析法(

36、HA) HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。 由于突变和野生型 DNA形成的异源杂合双链 DNA在其错配处会形成一突起，在非变 性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与 SSCP相似，所 不同的是SSCP分离的是单链DNA, HA法分离的是双链DNA,也只适合于小片段的分 析。但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出 率提高到近 100%。 突变体富集PCR法(mutant-enriched PCR )本法的基本原理是利用 ras基因家族某个 密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的Bst

37、NI位点， 第13密古巴子有Bgin位点。用链续二次的巢式 PCR来扩增包括K-ras第12、13密 码子的 DNA 片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的 DNA 片段，野生 型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得 到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法( denaturing gradinent electrophoresis,DGGE ) DGGE 法分析 PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100%，检测片段可达 1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链 DNA在变性梯度凝胶中进行到与 DNA 变性湿

38、度一致的凝胶位置时， DNA 发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的 DNA 链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程 而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置， 合成的PCR引物最好在5末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点 区的突变。在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法(温 度梯度凝胶电泳 temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE )。DGGE和 TGGE均 有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。

39、化学切割错配法( chemical cleavage of mismatch,CCM )CCM 为在 Maxam-Gilbert 测 序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与 DNA 测序相仿。 其基本原理为将待测含 DNA片段与相应的野生型 DNA片段或DNA和RNA片段混俣变 性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的 T能 被四氧化饿切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。该法检出率很高，也是检 片段最长的方法，已有报功检测了 1.7kb 片段，如果同时对正、反义链进行分析，检 出率可达 100。应用荧光检测系统可增强敏感度，可检测到 1

40、0 个细胞中的 1 个突变 细胞。该法中的化学试剂有毒，又发展了碳二亚胺检测法( catodiimide,CDI ),CDI 为 无毒物质，也可检测大片段 DNA 的点突变。 等位基因特异性寡核苷酸分析法( allele-specific oligonucleotide,ASO ) ASO 为一种以 杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡 核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增 的样品 DNA 杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照， 如出现阳性杂交带，则表运河样品中存在与该ASO探针相应的

41、点突变，ASO需严格控 制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。目前已有商品化的检测盒检测部分 癌基因 ASO 突变。 DNA芯片技术(DNA chip)DNA芯片技术是90年代后发展的一项 DNA分析新技术， 它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和 DNA 合成等先进技术。 可用于基因定位、 DNA 测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。在基因突变检测方面 DNA芯片也有广阔的前景，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块 集成电路板上，彼此之间重叠 1 个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的 正常DNA和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在

42、1个碱基的差异，正 常和突变的 DNA 将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种 DNA 分 子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有 很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。 连接酶链反应( ligase chain reaction,LCR ) 与其他核酸扩增技术比较，其最大特点为 可准确区分基因序列中单个基因突变，由 Landegree 于 1988 年首次应用于镰刀奖细胞 贫血的分子诊断。LCR是以DNA连接酶将某一 DNA链的5-磷酸与另一相邻链 3-羟 基连接为基础，应用两对互补的引物，双链 DNA 经加热变性后，两对引

43、物分别与模板 复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的 5- 磷酸与 3- 羟基形成磷 酸二酯二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的 碱基存在突变则不能连接和扩增。LCR产物检测最初是通过这 32p标记上游引物3未 端，经变性凝胶电泳分离后放射自显影加以鉴定，其检测敏感性达到 200 个靶分子。 也可设计1个横跨两引物的检测探针，用它与LCR产物进行杂交检测。近年有应用荧 光素、地高辛等非核素标记方法。 Batt 在 1994 年发展了一种更为简的方法，好微孔板 夹心杂交法。由于 LCR 的快速、特蛋和敏感的特性，以及能检测单个碱基突变的能力， 因此被

44、应用于肿瘤基因突变的分子诊断，并与PCR结合用以提高其敏感性。 等位基因特异性扩增法(Allele-specific amplification,ASA )ASA于1989年建立，是 PCR技术应用的发展，也称扩增阻碍突变系统(amplificatio n refractory mutatio n system,ARMS )、等位基因特性 PCR( allele-specific PCR,ASPCR )等，用于对已知突 变基因进行检测。该法通过设计两个 5 端引物，一个与正常 DNA 互补，一个与突变 DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3端引物进行两个平行 PCR,吸 有与突变D

45、NA完互补的引物才可延伸并得到 PCR扩增产物。如果错配位于引物的3 端则导致PCR不能延伸，则称为 ARMS。ARMS和ASPCR借鉴多重PCR原理，可在同 一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。 ASA 法的检出率依赖于反应条件的 优化和可能发生的引物与靶 DNA有氏配时错配延伸，特别是当错配碱基为G: T时， 这时可通过调整实验条件如引物靶DNA， Taq DNA 聚合酶的浓度等来得高瓜在特异性。 在反应体系中加入甲酰胺也可减少非特异性扩增。还可通过在引物 3 端的第二个碱基 引入一个错配碱基，使之与模板之间形成双重错配以阻止错误延伸。 RNA酶A切割法(RNase A cleav

46、age)在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA： RNA或RNA： DNA中的错配碱基可被 RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分 离。当 RNA 探针上错配的碱基为嘌呤时， RNaseA 在错配处的切割效率很低，甚至不 切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。故如果仅分析被检DNA 的一个条 链，突变检出率只有 30，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70。该法需 要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确 定突变位点。于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。 染色体原位杂交( In situ hybridizati

47、on of chromosome )染色体发现距今已有 150 多 年的历史，染色体检测被广泛用于动、植物及人类的细胞遗传学研究，随着染色体分 技术和分子生物学技术的发展。染色体研究范围也不断扩大，特别是用于肿瘤分子诊 断。肿瘤细胞的染色体变化是一非常普遍的现象，可分为原发和继发两类。在肿瘤形 成的生物学基础方面，原发性的染色体变化与引起肿瘤的直接原因有关，肿瘤细胞中 可以发现各种形式的染色体畸变，如缺失、重复、易位、重排、单体断裂及核内复制 等；继发性变化主要是肿瘤细胞核型的改变。染色体的检测对于肿瘤的诊断、鉴别诊 断、生物学行为判别等方面都重要意义。染色体的检测方法进展很快，检测的精确率

48、也不断提高，这里主要介绍荧光原位杂交和PRINS 法 荧光原位杂交技术( fluorescent in situ hybridiaation,FISH )创建于 1986 年。 1969 年 Gall 和 Pardue 首先应用核素标记核苷酸制备探针，通过放射自显影检测杂交信号。应 用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百 碱基的单拷贝靶核苷酸序列，敏感性虽高，但定位不够精确。FISH 具有探针稳定、操 作安全，可快速、多色显示多个不同探针的杂交信号等优点。FISH 的灵敏感与探针标 记方法和检测仪器性能有关，探针标记时掺入的修饰核苷酸比例直接影响杂交信号强 度。FISH探针一般采用

49、随机引物法或切口翻译法，如将PCR技术引入FISH探针标记, 可使其灵敏度提高到0.25kb。应用慢扫描CCD配合影像处理理软件，增强信噪比，有 利于检测微弱信号，如应用 TSA系统(tyramide signal amplification )能将杂交信号 再放大 1000 倍，可用于单拷贝基因的定位。 FISH 分辨率大约为 1-3Mb, 如果应用强变 性剂处理染色体，让 DNA 分子从蛋白质中分离出来，使双 DNA 完全伸展并粘附在玻 片上，经引处理后，分辨率可达1-2kb。还可采用对分裂中期染色体进行显微解剖 (microdissect )法以提高分辨率。 FISH 的另一个特点是可以

50、联合庆用地高辛、生物 素等多种标记系统， 在一次杂交中可检测多种探针在染色体上的位置及探针间的相互 关系，即多色 FISH 或多靶 FISH。 FISH 技术已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、 易位重排及缺失等的检测，在肿瘤诊断和鉴别诊断、预后和治疗监控等方面都有重要 意义。 Klch等于1989年发明了染色体上寡核苷酸引物原位DNA合成技术(oligo nucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS ),并成功地用于染色体特异a卫星 DNA标记。其 基本原理是用非标记的寡核苷酸引物同染色体上靶序列特异性地杂交，在 DNA 聚合酶 作用下，当引物延

51、伸时，掺入标记的核革酸可直接或间接地检量标记位点。 PRINS技 术的优点是不需克隆基因作探针，且由于杂交反应在前，标记在后，故非特异怀背景 低。缺点是信号弱，灵敏度低，为克服这一制眯， Terkelsen 等建立了重复引物原位标 记技术(repeated PRINS )，重复进行PRINS反应，使信号号强度明显提高。基于 FISH 的原理，发展了多色原位经物标记( multicolor PRINS ) ,可测定二个以上靶序列 在 DNA 分子上的相互的位置，且特异性比 FISH 还高 DNA 序列分析( DNA sequencing ) 应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都 需用序列

52、分析才能确定突变类型及突变位置，其效率可以达到 100 。现在的测序方 法已与经典的方法有了很大的不同，其基本原理虽仍是双脱氧终止法，但自动化程度 大为提高，操作更简便，测序时间也大大缩短。随着PCR 技术与测序联合使用，不需 经过M13亚克隆步骤，故称为直接测序法(direct sequencing,DS )。DS法测序的模 板主主要来源于 PCR,应用不对称PCR( asymmetric PCR )和基因组扩增转录同步测 序法( genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS )等，使单链产物大 大增加。近年来，PCR循环测序法

53、的建立，使模板扩增与同步进行，引物用四种不同 前颜色的荧光标记，使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行， 大大提高了测邓的自动化程度。目前PE公司推同出的DNA自动测序仪已发展到96泳 道，并仍在不断改进。这些高度自动化的测序方法是经较理想的基因突变分析技术， 但其昂贵的费用其使用范围，所以对一些小样本或为了某些特定目的的样本分析，仍 进行经典的手工测序。 突变基因的检测方法多种多样，特别是PCR技术诞生后，许多检测技术都是在PCR基 础上衍生的。由于PCR扩增南非要的模板量少，使对肿瘤的突变分析可以精确到单细 胞，如霍奇金病的 R-S 细胞的单细胞基因突变分析。另外，应用显微

54、解剖法 ( microdissection )可在组织切片上较精确地挑选需检测的靶点，其优点是可克服肿 瘤组只中间质或癌周组织的混杂，提高准确性。除上述介绍的方法外，还有多种方法 也用于基因突变的分子检测，如对未知突变基因进行分析的酶促切割错配法(enzyme mismatc cleavage,EMC )、切割片段长度多态性( cleavage fragment length polymor phism,CEFLP) 、双脱氧指纹图谱法( dideoxy finger printing,ddF )、错配接合蛋白质 截短测试法( protein truncation test,PTT )等。对已

55、知突变基因进行分析 的有引物延 伸法( primer extension,PEX )、寡核苷酸链接检测法( oligonucleotide ligation assay,OLA)、毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE )等方法。 细胞生物学实验方法与技术 当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1)真核 细胞基因结构及其表达调控； 2)细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3)细胞生长、 分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究； 4) 细胞工程，包括基因工 程及体细胞核移植的研究。 一、细胞培养常用方法 1 、细胞原代培养(

56、 primay culture ) 又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、 或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们 的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源 组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒 性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。 前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。 细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。2、细胞的传代培养 当 细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营

57、养耗竭而影响 生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传 代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。 二、器官培养方法 器官培养( organ culture )是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体 外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组 织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。 器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢 金属网格法及 Wolff 培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。 三、放射自显影术测定 放射

58、自显影术( autoradiography )是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作 用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密 接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。 现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组 织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学 各领域被广泛应用。 四、染色体分析技术 染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗 传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细 丝高度螺旋化

59、凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到 最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分 析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1)为临床诊断提供新手段； 2)研究不 育和习惯性流产发生的遗传基础； 3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿 出生（先天愚型）； 4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合 DNA 重组技术可以将基因定位于染色体的具体区带上。 五、电镜技术 早在 1940 年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜，但因分辨率低无实用价值。 1965 年英国剑桥科学仪器有限公司开始生产出商品扫描电镜，其以显著优点广泛用于 生物学、医学、物理学、化学、电子学及勘探、冶金、国防、公安、机械与轻工业等 诸多领域，并已成为非常有用的研究工具。 电镜主要特点： 1）景深大，较光学显微镜大几百倍； 2）图像富有立体感，是一个具 有真实感的三维结构立体图象； 3）图像放大范围大，光学显微镜有效放大