宏基因组测序技术检测方法

1、因组测序技术检测标准简介：因组测序介绍因组学是以环境样品中的微主物群体基因组为研究对象，通过现代基因组 技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、 进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物 研究方法。随着高通量测序技术的发展，为因组学研究提供了新的理想研究方法。 高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接 对环境中所有微生物进行测疗;。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种 群结构、进化关系等。LI前乂可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对 因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介

2、绍。一、16s DNA/18s DNA/ITS 测序16SDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，通过对样品中16SDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。U前，普遍使用Roche 454 平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16SDNA序列比较相似，读长短的 话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的 避免此类问题。二、因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体, 然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及 其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以

3、进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不 单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。样品处理：因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品 采集遵照样品采集规（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取：因组核酸提取主要有两种方法:膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液,灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取 后用 NanoDrop ND-1000 测定，260/280 = 1.8-2.0,260/230= 1.8-2.0,电泳检测DNA应是完整的一条带。测序 Sequen

4、cing1) 16S/18S 测序：Sanger 测序：用于低通量的16S/18S DNA测序，提取因组后，首先通过PCR将16S/18S丿了; 列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选， 选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或 ABI 3730进行毛细管电泳测序。山于其测序准确率比较高，而通量非常低,现通常用做二代测序结果的验证。454 Platform：454 平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System 和 454 GS Junior System = 454 GS FLX+ System 测序读长可以

5、达到 600-1000bp,通量 450-700M, GS Junior System 测序读长在400bp左右,通量在35MoLibrary Preparation Amplify ribosomal RNA targets from sampled usingfusion primers.Sequencing Amplified rRNA amplicons proceed directly inlo cmPCR and soquencing using the GS FLX* System (XLR70 Sequencing Kil only) or GS Junior SystemDa

6、ta Analysis Utilize a variety of free and commercial software packages to assess microbiol populotion diversity ond make comparisons. GS Amplicon Variant Analyzer (AVA) sofuvare GS Reference Mapper software Public motagcnomic analysis toolsFigure 2: Workflow of a nbosoml rNA ampliconsequencing exper

7、iment LOrary preparation using a direciio-nal primer common to al species enables mterrogatwn of more in a single sequencing rw. For detailed mfonnion.www.my4S.文库构建：用fusion Primer扩增核糖体RNA,将已扩增的rRNA直接做乳液PCR,在GSFLX+和GS Junior系统上进行测序。测序深度：数据分析：使用免费的软件包对微生物的种群多样性进行鉴定，并进行比较。1. MEGAN： 一个因组分析工具，可以在大量的测序数据中

8、对测序结果进行聚类 分析。2. MG-RAST：用于注释因组样品的全自动软件。3. IMG/M :基于因组序列微生物群体的功能性。4. CAMERA：致力于微生物生态学研究。5. CARMA：可以通过未拼接的序列来进行物种组成和微生物的遗传潜力的研究。6. GALAXY：用于高等真核生物的研究，例如昆虫等。7. Greengenes： 16S rRNA的数据库，可以用来做16S rRNA的比对。8. QIIME：针对454测序数据的因组分析。9. The Ribosome Database Project (RDP)：针对焦磷酸测序的分析方法。Miseq Platform：Miseq 平台读长

9、可以是 2X250bp 或 2X300bp。使用 Miseq Reagent Kit V2 可以产出7.5-8.5Gb的数据，使用Miseq Reagent Kit V3可以产出13.2-15Gb的数据。z Figure 1:16S Amplicon Sequencing WorkflowDesign and order region of interest-specific primersGenerate template library by PCRNormalize and pool librariesand sequencing on the MiSoq systemView data

10、 using the Metagenomics 16S rRNAWorkflow in MiSeq Reporter or AmpliconViewer in BaseSpace16S ampkn sequencing e a dGnonsrat9d protocol for the MlSoq system, indudr sam0e preparation, sequencing, and autcmated data analyas vsith on-rtstrunem software for reMZng results.文库构建：根据感兴趣的片段设计引物，通过PCR扩增出片段做为模

11、板构建文库。使用 Nextera XT Sample Prep Kit构建文库，按照试剂盒说明书操作。将建好的文库归 一化处理并将其混到一起。在Miseq系统里自动进行成簇反应，进而完成测序。 文库检验：用Agilent 2100检测文库大小片段是否与预期一致。文库片段是否集中。测序深度：16S rRNA测序深度应至少在50,000条reads以上，以保证较好的覆盖度。数据分析：对微生物生态进行定量观察Greengenes： 16S rRNA基因数据库和分析工具；因组分析工具：MEGAN核糖体数据库il划(RDP)Ion Torrent Platform：Ion Torrent 平台主要有两个

12、测序系统：Ion PGM System 和 Ion Proton System Ion PGM有两种读长,200bp和400bp, Ion PGM主要应用三种芯片,Ion 314 Chip, Ion 316 Chip和Ion 318 Chip,最多数据产出可以达到2Gb。Ion Proton读长为200bp, 最多数据产出可达到10Gb。文库构建：使用 Ion Plus Fragment Library Kit 为 16S rRNA 扩增产物加上 barcode 标签， 共有96个barcode可以选择。加上标签后使用Ion PGM Template 0T2 200 Kit 在Ion OneT

13、ouc* DL System上进行乳液PCR,完成文库构建。测序时根据需要 不同的读长选择不同的测序试剂盒。测序深度：对于人体肠道微生物16S rRNA测序，对于检测高丰度的样品，每个样品至 少要测10000条reads,而对于检测低丰度的样品，则需要1,000,000以上的reads 数。2)全因组测序 Whole-metagenomics SequencingRoche 454 platform:文库构建：提取因组DNA,总量不低于10ug,且样品DNA应相对完整。使用GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit构建文库，按照说明书进行相应操作

14、。 文库检验：DNA reads数与微球的比例在8%左右，可以达到比较理想的测序结果。 测序深度：每个样品应至少保证10,000条以上的reads数。Hiseq platform:Hiseq平台主要有Hiseq 2000和Hiseq 2500两个测序系统。Hiseq 2000测序 读长是2X100bp Paired-end测序，一次运行通量可达600Gb以上，Hiseq 2500有 两种运行模式：快速运行和高通量，快速运行可以达到2X150bp,产生最多180Gb 的数据，高通量读长在2X125bp,数据产出在600Gb以上。文库构建：将提取的因组DNA用Covaris M220片段化后，使用Truseq DNAXT/LT Sample Prep Kit (illumina)按照protocol进行文库构建，DNA起始投入量应在lug以上。 文库检验：将建好的因组文库