质粒构建流程

1、. 质粒构建流程 一、引物设计 1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。 3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)， 4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。 5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。 6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。

2、一般选择三个保护碱基。 7）引物设计完成，送公司合成。 二、目的片段获取 1. RNA提取 试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒 离心柱型（裂解液RL 4、漂洗液RW -20保存） 准备：冰盒、4预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套 操作步骤： 1）将1000l裂解液RL加入细胞中，混合5min。 2）加200l氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。 3）4，12000rpm离心10min。 4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550l） 5）加入1倍体积（550l）70%乙醇，混匀 6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4，10000rpm离心45s 7）弃废液，重套收集

3、管，加500l去蛋白液RE，12000rpm离心45s 8）弃废液，重套收集管，加700l去漂洗液RW，12000rpm离心60s 9）弃废液，重套收集管，加500l去漂洗液RW，12000rpm离心60s 10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min 11）吸附柱放入新EP管，加50l RNase free water于膜上，室温放置2min 12）4，12000rpm离心60s 13）点样：5l RNA+ 1l 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。 14）-20保存 2. RNA反转录 试剂盒：TaKaRa primescrip

4、t RT reagent kit with gDNA eraser（-20保存） 准备：冰盒，取出解冻，为酶不可取出，预冷离心管 操作步骤： 1）基因组DNA去除（10l体系） 5×gDNA eraser buffer 2l gDNA eraser 1l 精选范本. Total RNA 4l(可根据RNA浓度调整) RNase free water 3l PCR仪中进行，程序：42，2min4 注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入 2）反转录反应（20l体系） 5×primerScript buffer 2 4l primerScript RT enzy

5、me mix I 1l RT primer mix 1l RNase free water 4l 1）反应液 10l PCR仪：37，15min85，5s4 注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中 3）1.5mlEP管收集，-20长期保存 3. PCR扩增 高保真酶primerstar扩增，50l体系如下： 5×PS buffer 10l PCR程序：dNTP 4l 5min 95 dH2O 32.5l 30s 95 Primerstar 0.5l 35cycle 30s 56 cDNA 1l(可变) 1min 72R-primer 1l 10min 72 F-prime

6、r 1l 延伸时间，循环数。注：可根据不同基因调节退货温度， 点样：5l PCR产物+ 1l 6×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，15min 4. PCR产物纯化 1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带） 试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01 将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积buffer CP，混匀。 转移至HiBind MicroElution DNA 柱（套收集管），室温离心10000g，1min。 弃废液，加700l DNA wash buffer（含乙醇）到

7、柱子，室温离心10000g，1min。 弃废液，重复 弃废液，空管离心13000g，1min 柱子放入新EP管，加10-20l Elution buffer到膜上，室温孵育3-5min，离心10000g，1min 电泳检测 2）割胶回收（产物电泳结果含杂带） 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。 加等体积（1g=1ml）binding buffer（XP2）,60金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min 溶液加入离心柱，离心10000g，1min，废液倒回再离一次 弃废液，加300l binding buffer（XP2），离心10000g，1m

8、in 弃废液，加700l SPW washing buffer，离心10000g，1min 重复 空管离心13000g，2min，弃废液，柱子转移到新EP管 精选范本. 加入30-50l elution buffer于膜上，室温孵育1min，离心13000g，1min 电泳检测 三、双酶切 30l 反应体系如下： Vector1l PCR纯化产物 15l 1M/L/K bufferl 10×M/L/K buffer 3l 3dH2O 13l 3dH2O 10l 酶A 1l 酶A 1l 酶B 1l 酶B 1l 反应条件：takara酶30水浴1h65金属浴10min终止反应 注：buf

9、fer类别依使用的酶具体选择，见附表 四、连接 1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2l 2）酶切产物液相纯化 3）20l 连接体系（皆可） PCR产物 5l 6.3l PCR产物 pcDNA3.1 2l l 0.7pcDNA3.1 10×T4buffer 2l 2l T4buffer 10× T4 ligase 1l l T4 ligase 13dH2O 10l 3dH2O l 10 PCR仪中进行：22，30min4冰箱过夜 注：连接产物-20可长期保存 五、转化 准备：碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42 1）将

10、感受态细胞置于冰上，待其融化 2）超净工作台中，将连接产物10l 加入100l 感受态细胞，或质粒1-3l 加入100l 感受态细胞 3）轻混匀，冰浴30min 4）热击水浴42，45s，冰浴1min 5）加900l LB空培养基，摇菌150rpm，37，1h 6）浓缩离心13000rpm，1min，上清液留约200l 重悬菌体，部分涂板（50-100l ） 7）完全吸收后，37倒置培养12-16h 六、菌落PCR 1）以rTaq酶50l 体系配制PCR反应液，每个PCR管分装15l，体系如下： 3dH2O 35.7l PCR程序： 95 5min 95 30s 精选范本 56 30s 35c

11、ycle 72 1min 10min 72. 10×buffer 5l MgCl2 3l l 4dNTP l 0.3rTaq l 1R-primer l 1 F-primer 个菌。10，再在新板划板（注意编号）每板挑2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下， 。37倒置培养12-16h新划的板 产物，记录含目的条带的菌落号备用。3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR 测序七、 摇菌1. 个较好的以供摇菌PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-31） 抗性液体培养基）三角瓶中分装10ml LB2 枪头挑起选择的菌落打到培养基中l 3）用10 12-16h250rpm摇菌4）37。 送样2. 箘液

12、，送华大基因测序每瓶取1ml 比对3. 将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。 （注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试） 八、菌种保存 菌种比对成功，则可保存菌种备用。 l 80%灭菌甘油。1.5mlEP管，加2001）超净工作台中取 l 箘液，轻混匀。再加入8002） 管即可）2）液氮冻存。（一个基因冻3 质粒提取九、 菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。 AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep 试剂盒： 操作步骤： 1min10000g，取1）3-5ml箘液，室温下离心

13、 重悬菌落，混匀l solution I/ RNase A 2）弃上清，加250 5min），倒置轻混匀，孵育2min。（整个裂解反应不超过）3加250l solution II ，立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。加入250l solution III4） 10min室温离心13000g，5） ，1min)HiBind miniprep column(有套管，室温离心10000g）6上清液小心转入 1min10000g，室温离心弃废液，加7）500l buffer HB 步78）选择性步骤：重复第 2min13000g）9弃废液，空管室温离心， 精选范本. 10）柱子转入新EP管，加30-

14、50l elution buffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min 11）室温离心13000g，1min 12）提取的质粒-20保存备用 精选范本. 附： 感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）： 1. 菌种活化 1）用接种环直接取冻存的E.coli/ DH5菌种，在LB平板上划线，37倒置培养16h 2）挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中，摇菌37，250rpm，12-16h 3）取1ml箘液加入到100ml LB液体培养基，摇菌37，250rpm，3h 0.5（0.3-0.4） OD）检测箘液46002. 感受态制备 准备：0.1M CaCl灭菌，50ml离心管灭菌，冰水

15、，1.5ml离心管冰上预冷，离心机4预冷。 2步骤： 1）将箘液用50ml离心管分装，调平，4离心3000rpm，8min 10ml重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管 0.1M CaCl）2弃上清，2 3）冰上放置一段时间，4离心2500rpm，8min 10ml重悬，4冰箱过夜沉淀 0.1M CaCl弃上清，4）2 5）上清液取出8ml，剩2ml，加670l 80%甘油（箘液：80%甘油=3:1），轻混匀 6）1.5mlEP管分装，每管分装100l ，液氮冻存。 精选范本. 试剂配制： 1. 琼脂糖凝胶（1.2%） 琼脂糖粉 0.6g 1×TAE 50ml 微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1l gold view核酸染料，混匀，倒板 2. 电泳缓冲液TAE（50×） 2mol/L tris-碱 242g 1