不同产地大豆SOD的提取及活性比较-精选文档

1、不同产地大豆SOD勺提取及活性比较1引言sot生物体内一种非常重要的金属酶，广泛存在于各种生物体中。同时也是一种重要的抗氧化剂，它的作用底物是超氧阴离子？O2-,催化超氧阴离子发生歧化反应，从而清除？O2-自由基1,2。目前SOCE在多个领域中被应用，比如医疗保健3、食品工业4、以及植物抗逆5等。植物来源SOD勺分离纯化68主要工艺流程为：植物-精制-超滤浓缩-冷冻干燥-产品。SOD勺活性测定方法一般分直接测定法和间接测定法9-11。常见的直接测定方法有EPRi、脉冲辐解法、超氧化钾法等。常见的间接测定方法有黄嘌呤氧化酶法、细胞色素法、邻苯三酚自氧化法、微量邻苯三酚自氧化法、黄喋吟氧化酶-NB

2、T法、NBT光还原法等。邻苯三酚自氧化法的主要原理为：在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，并产生？O2,在SO%在下，自氧化反应受到抑制。该法所用试剂和仪器比较普通，测试方便，灵敏度高，是目前应用最广泛的一种测试方法，但对温度、pH值、邻苯三酚浓度、SOD寺测液存放时间等诸因素比较敏感，因此测定时要严格控制这些因素1214。笔者提取了大豆中的SODI,然后利用改良的邻苯三酚自氧化法对大豆的SOD!活性进行了测定，对测定过程中的各个条件进行了探索，建立了大豆SOD!测定最佳方法，并对不同产地大豆的SOD舌性进行了比较，使SODfc规模化生产的同时更具针对性。2材料与方法2.1 材料和仪器本实验

3、所使用的大豆样品来源于9个产地，分别为：广东（广州）、北京、江苏（动台）、黑龙江（佳木斯）、黑龙江（牡丹江）、福建（厦门）、广西（柳州）、湖北（武汉）、湖南（长沙）。对应的编号分别为19。实验材料：Trisbase（国药集团化学试剂XX公司，优级纯）；其余试剂均为分析纯。A液：称取1.2114gTris和37.2mgEDTA?2N0g于62.4mL0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸储水定容至100mLB液：4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。实验仪器：紫外可见分光光度计（UEG1008016上海美谱达仪器XX公司）；微型酸度计（PHSJ-3F,上海精科）；高速离心机（TGL-20M长沙平凡仪器仪

4、表XX公司）；超纯水系统（Aquaplore3s,颐洋企业发展XX公司）。2.250 D酶提取与处理2.2.1 粗酶液的提取将大豆种子洗净淋干，于pH值为7.8的PBS缓冲液中浸泡10ho清洗后加入4c三倍体积的预冷缓冲液，在冰上匀浆。匀浆后加入一定量的缓冲液，在超声波清洗机中超声，使细胞破碎，得到粗酶液。2.2.250 D粗酶液的处理热变性：分别取一定体积的粗酶液，放入60的水浴锅中分别保温10、15、20min，在5000r/min、4的离心条件下离心15min去除沉淀，测定上清液中酶活力及蛋白含量，筛选热变性的最佳时间。丙酮沉淀：取一定体积的酶液，置于冰浴中，缓慢加入-20预冷的丙酮，搅

5、拌10min,4c下静置5h,待其自然沉淀后，4C、5000r/min离心15min弃去上清液，收集沉淀，用缓冲液溶解沉淀，4、5000r/min离心15min后测定上清液酶活力和蛋白含量。2.3酶活性与浓度的测定2.3.1 酶活力的测定邻苯三酚自氧化速率测定严格控制在25进行。于15mL比色管中用微量移液器依次加入A液2.35mL蒸储水2.015mLB液0.35mL加入B液后立即混合并倾入比色皿，于325nm处测吸光值，共测4次，即取开始后30s和90s时的吸光值，二者之差即为邻苯三酚自氧化速率4A325本试验确定A325值为0.060。测定样液和SODB液抑制邻苯三酚自氧化速率时样品的加入

6、顺序如表1所示，分别加入一定量样液或酶液使邻苯三酚自氧化速率约为0.5倍A325,即325为0.030。2.3.2 蛋白质浓度的测定采用紫外分光光度法测蛋白质浓度，利用在280nm及260nm下的光吸收值计算蛋白质的浓度，公式如下：蛋白质浓度（mg/mD=1.45XA280-0.74XA260式中：A280是蛋白质溶液在280nm下测得的光吸收值；A260是蛋白质溶液在260nm下测得的光吸收值。2.3.3SOD的定性分析采用紫外分光光度法：分离后的酶液与Cu/Zn-SOD标品分别在200400nm处进行紫外光谱扫描，根据样品与标品的紫外图谱比较，对提取物质进行定性，同时根据其最大吸收峰的波长

7、来判断SOD勺类型。2.4SOD酶提取条件的优化2.4.1超声时间的优化分别对匀浆超声波处理1min，2min，3min，4min，5min后，使用紫外分光光度法测定蛋白的浓度，并用改良的?苯三酚自氧化方法测定酶的活力。2.4.2热变性时间的优化取三份100mL粗酶液，60条件下对其进行热处理，时间分别为10min、15min、20min，边加热边用玻璃棒轻轻搅拌，加热完成后，迅速放入4冰浴冷却30min，然后在5000r/min、4下离心15min，取上清液，分别测酶活和蛋白质含量。2.4.3丙酮用量的优化取热变性以后的酶液，置入4冰浴中，分别加入1.0倍、1.5倍、2.0倍体积的-20预冷

8、丙酮进行沉淀。丙酮要缓慢加入，并用玻璃棒轻轻搅拌，以防止丙酮局部过量以及溶液产生大量的热量而使蛋白质变性。2.5不同产地大豆的SODB的提取与比较利用上述提取方法对全国9个产地的大豆进行SOD!的提取及酶活的测定。3.2.3丙酮加入量对酶活的影响检测结果如表3，当丙酮加入量为1.5倍时酶活收率与比活力最高，因此本实验将丙酮加入量定为1.5倍体积。3.3SOD活性的测定优化331A液pH值对邻苯三酚自氧化速率的影响检测结果如表4所示。从表中数据可以看出，邻苯三酚自氧化速率随pH的升高而增大，在pH值在88.4范围内，曲线几乎不变，斜率较低，pH变化对邻苯三酚自氧化速率的影响不大。当pH值超出此范

9、围时，曲线斜率变大，微小的pH变化都会显著影响邻苯三酚自氧化速率。本实验A液最佳PH值定为8.2o3.3.2邻苯三酚加入量对测量的影响4讨论及结论大豆样品经粗提取和热变性、丙酮沉淀后的蛋白质紫外光谱如图1(b)所示。由图1可以看出Cu/Zn-SOD标准品图1(a)与样品图谱的走势、峰形及出峰位置基本一致，可确定提取物质为SOD图形的差异是由于Cu/Zn-SOD的来源不同，标准品来源于牛血细胞，出峰位置在258nm处，而待测样品来源于大豆，出峰位置在260nm。SOD勺测活方法有很多，在这些方法中，邻苯三酚自氧化法仪器简单、测试方便，因而是使用较普遍的一种方法。目前采用的邻苯三酚测活方法有两种，

10、一种是经典的邻苯三酚自氧化法，另一种是改进的微量邻苯三酚自氧化法。本文SOD舌性的测定采用后者，该方法以修改的Marldund方法广泛用于食品中SOD舌性测定，方法灵敏，操作简易，易于推广。超声波实验的结果显示，最佳的超声波时间是4min。因为在一定的条件下，超声波时间过短不能使细胞破碎，因而其中的酶不能完全溶出；因为大多数酶也是蛋白质，如果超声波时间过长就会破坏蛋白的结构，酶也就会失去活力。故超声波时间应该严格控制。热变性试验可以去除一定量的杂质蛋白，热变性的过程中不需要接触有机溶剂，在节省成本的同时，减少了对环境和人体的危害，增加了工作的安全性，所以热变性法是去除杂蛋白的一种高效、简便、安全的方法。丙酮沉淀方法的优势在于丙酮本身为易挥发的有机溶剂，离心除去上清后沉淀，避免了透析等一系列的繁琐步骤，可以直接干燥而得到最终的