2019-2020年高中生物12基因工程的基本操作程序难点剖析新选修3

1、019-2020 年高中生物 12 基因工程的基本操作程序难点剖析新人教版选知识巧学一、目的基因的获取基因操作的第一步， 是取得人们所需要的特定基因，也就是目的基因。例如，前面提到的苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因， 还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子的储藏蛋白 的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等，都是目的基因。1. 从基因文库中获取目的基因要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，犹如大海捞针，是十分不易的。科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，概括地说，主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA 中直接分离基因；另一条是人工合成基因。将某种生物体内的 DNA 全部提取出来，选用适

2、当的限制酶，将 DNA 切成一定范围大小的 DNA 片段，然后，将这些 DNA 片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受 体菌都含有了一段不同的 DNA 片段。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRN 反转录产生的多种互补 DNA 也叫 cDNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA 文库。知识拓展直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的 DNA 切成许多片段，将这些片

3、段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源 DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的 DNA 片段分离出来。如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用上述方法获得。用“鸟枪法”获取目的基因的缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的 DNA 片段，不能直接用于基因的扩增和表达， 因此，在获取真核细胞中的 目的基因时，一般是用人工合成基因的方法。2. 利用 PCF 技术扩增目的基因20 世纪 80 年代以后，随着 DNA 核苷酸序列分析技术的发展，人们

4、已经可以通过DNA 序列自动测序仪对提取出来的基因进行核苷酸序列分析，并且通过一种扩增DNA 的新技术（也叫 PCR 技术），使目的基因片段在短时间内成百万倍地扩增。上述新技术的出现大大简化了 基因工程的操作技术。难点剖析PCR 扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR 反应包括以下几个主要过程：第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA 聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等） 加热至 9095C,使双链 DNA 模板两条链之间的氢键打开， 变成单链DNA 作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至5560C,使

5、两种引物分别与模板DNA 链 3端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至 7075C,在耐高温的 DNA 聚合酶催化作用下，将与模板 互补的单个核苷酸加到引物所提供的 3 OH 上，使 DNA 链延伸，产生一条与模板链互补的 DNA 链。上述三步反应完成后， 一个 DNA 分子就变成了两个 DNA 分子，随着重复次数的增多，DNA 分子就以 2n的形式增加。PCR 的反应过程都是在 PCRT增仪中完成的。知识拓展目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用， 还需要有其他控制元件， 如启动子、 终止 子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由：（1）生物之间进行基因交流，只有

6、使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基 因的表达。（2） 通过 cDNA 文库获得的目的基因没有启动子， 只将编码序列导入受体生物中无法转 录。（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记。（ 4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等。（ 5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识 存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。二、 基因表达载体的构建将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的 DNA 重新组合的过程。如果以质粒作为运载体， 首先要用一定的限制酶切割质粒， 使质粒出现一个

7、切口，露出黏性末端。然 后用同一种限制酶切断目的基因， 使其产生相同的黏性末端。 将切下的目的基因的片段插入 到质粒的切口处，再加入适量的 DNA 连接酶，质粒的黏性末端与目的基因DNA 片段的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，形成了一个重组 DNA 分子。例如，人的胰岛素基因就是通过这种方式与大肠杆菌中的质粒DNA 分子结合，形成重组 DNA 分子（也叫重组质粒）的。除了目的基因，构建基因表达载体，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。疑点突破在构建基因表达载体时，主要考虑以下几方面的因素：（1） 基因的特点： 如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物， 因为动物中内含子的

8、剪接系统与植物的不同， 植物不能将动物基因的内含子剪切掉， 只能用 该基因的cDNA 基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的 蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体内加上 的，而细菌无这些细胞器。（2） 要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子是一段有特殊结构的DNA 片段，位 于基因的首端，它是 RNA 聚合酶识别和结合的部位。启动子有强有弱，选择强启动子可以增 加转录活性，使基因产物量增多。 如果希望基因在生物的某个组织表达， 如只在植物种子中 表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（ 3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择

9、出真正的转基因生物。三、 将目的基因导入受体细胞目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA 分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。 目的基因进入受体细胞内， 并且在受体细胞内维持稳定和表 达的过程，称为转化。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵 母菌和动植物细胞等。用人工的方法使体外重组的 DNA 分子转移到受体细胞，主要是借鉴细 菌或病毒侵染细胞的途径。1.将目的基因导入植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法。知识拓展农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti 质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双

10、子叶植物中。据不完全统计，约有93 属 643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。 裸子植物对该菌也敏感。 当这些植物被该菌侵染后会诱发 肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。 根瘤农杆菌具有趋化性， 即植物的受伤组 织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。 研究证明， 主要酚类诱导物 为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮， 这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成， 通常不存在于 单子叶植物中， 这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。 近年来还发现一些中性糖， 如 L 阿拉伯糖、 D 木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根

11、瘤农杆菌的趋化 物，又可以作为农杆菌中 Ti 质粒上 Vir区（毒性区）基因的诱导物，使 Vir 区基因活化， 导致 TDNA 勺加工和转移，从而侵染植物细胞。需要注意的是农杆菌中不同的菌株， 侵染能力有差别， 在基因工程中需要加以选择使用。 利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时， 是需要加上述酚类物质勺， 同时单子叶植物种 类不同，农杆菌侵染进行遗传转化勺效果也有很大差异。2. 将目勺基因导入动物细胞：显微注射法。3. 将目勺基因导入微生物细胞： 如果运载体是质粒， 受体细胞是细菌， 一般是将细菌用 氯化钙处理， 以增大细菌细胞壁勺通透性， 使含有目勺基因勺重组质粒进入受体细胞。 目勺 基

12、因导入受体细胞后， 就可以随着受体细胞勺繁殖而复制， 由于细菌繁殖勺速度非常快， 在 很短勺时间内就能够获得大量勺目勺基因。四、目勺基因勺检测与鉴定以上步骤完成以后，在全部受体细胞中，真正能够摄入重组DNA 分子勺受体细胞是很少勺。因此，必须通过一定勺手段对受体细胞中是否导入了目勺基因进行检测。要点提示大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源 DNA 组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后， 就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否 获得了目的基因。1. 检测转基因生物染色体的 DNA 上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物 中稳定遗传的关键。2. 检

13、测目的基因是否转录出了 mRNA 这是检测目的基因是否发挥功能的第一步。3. 检测目的基因是否翻译成了蛋白质。重组的 DNA 分子进入受体细胞后， 受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。 例如， 科学家最初做抗虫棉试验时， 虽然已经检测出棉的植株中含有抗虫 的基因，但让棉铃虫食用棉的叶片时， 棉铃虫并没有被杀死， 这说明抗虫基因还不能在高等 植物中表达。 科学家在研究的基础上， 又一次对棉植株中的抗虫基因进行了修饰， 然后再让 棉铃虫食用棉的叶片， 结果食用的第二天棉铃虫就中毒死亡了。 这说明抗虫基因在棉植株中 得到了表达。辨析比较 目的基因的检测与鉴定内容和方法的比较

14、类型步骤检测内容方法结果显示分第一步目的基因是否进入受体细胞DNA 分子杂交是否成功显子（DNA 和 DNA 之间）示出杂交带检第二步目的基因是否转录出 mRNA分子杂交技术（DNA 和 mRNA 是否成功显测之间）示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原抗体杂交是否成功显示出杂交带个体 包括抗虫、抗病的接种实验， 以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与水平 天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等鉴定问题探究问题 1 构建基因文库是获取目的基因的唯一方式吗？探究： 构建基因文库是获取目的基因的方法之一， 并不是唯一的方式。 如果所需要的目 的基因序列已知，就可以通过 PCF 方式

15、从含有该基因的生物的 DNA 中直接获得，也可以通过 反转录，用 PCR方式从 mRNA 中获得，不一定要构建基因文库。问题 2 为何要构建基因表达载体？探究：由于单独的 DNA 片段一一目的基因是不能稳定遗传的，因此若要使目的基因在受体细胞中保持稳定和表达， 就需要将目的基因与相应载体结合， 形成重组结构， 即基因表达 载体。 以保证目的基因导入相应受体细胞后， 一方面能稳定存在并遗传；另一方面，能表达 和发挥作用。基因表达载体的组成必须要有目的基因、启动子、终止子和标记基因等。典题热题例 1 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是（）1将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码

16、毒素蛋白的 DNA序列注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的 DNA 序列，与质粒重组，构建成基因表达载体，导入细菌，用该细菌感 染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒素蛋白的 DNA 序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A.B.C. D.解析： 本题考查了基因工程的步骤。 培育抗虫棉时， 是从苏云金芽孢杆菌中提取目的基 因，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养。将目的基因与质 粒重组后， 注射到棉的子房内， 并进入受精卵，这种方法也是可行的。 将毒素蛋白注射到棉 的受精卵中或将编码毒素蛋白的DNA 序列注射到棉的受精卵中，都不是导入目的基因的方法。答案： C巧解提

17、示用人工的方法使体外重组的 DNA 分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞 的途径。注意题干关键词是目的基因和体细胞。例 2 下列技术不是依据 DNA 分子杂交原理的是（）A. 用 DNA 分子探针诊断疾病B. 检测目的基因是否导入受体细胞C. 快速灵敏地检测饮用水中病毒的含量D. 目的基因与载体结合构建基因表达载体解析： 本题考查基因工程的应用。 解答本题时应从以下几方面分析： （1）基因诊断是用 放射性同位素、荧光分子等标记的 DNA 分子作探针，利用 DNA 分子杂交原理，鉴定被测标本 上的遗传信息，达到检测疾病的目的。（2）检测目的基因是否导入受体细胞可采用DNA 分子杂交技

18、术来进行，将转基因生物的目的基因标记作探针，与受体基因组 DNA 杂交，根据杂交带的显示情况来确定。（3 ）使用一个特定的 DNA 片段制成探针，与被检测的病毒DNA 杂交,可以把饮用水中的病毒检测出来。（4）目的基因与载体结合形成重组DNA 分子利用的原理是基因重组，而不进行 DNA 分子杂交。答案： D深化升华DNA 分子杂交的基础是具有互补碱基序列的 DNA 分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区，目的基因与载体结合形成重组 DNA 分子利用的原理是基因重组， 而不是 DNA 分子杂交。例 3 下列获取目的基因的方法中，需要模板链的是 （）1从基因文库中获取目的基因利用PC

19、R 技术扩增目的基因反转录法通过 DNA合成仪利用化学方法人工合成A.B.C.D.解析：PCR 利用的是 DNA 复制的原理，即将双链 DNA 之间的氢键打开，变成单链 DNA， 作为聚合反应的模板。反转录法则是以目的基因转录成的信使RNA 为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链的 DNA则均不需要模板。答案：D拓展延伸从基因文库中直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。“鸟枪法”的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的 DNA 切成许多片段，从中找出含有目的基因的 细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA 片段分离出来。因此不需要模板。例如，许多

20、抗虫、抗病毒的基因都可以用上述方法获得。例 4 基因工程是在 DNA 分子水平上进行设计“施工”的，在基因操作的基本步骤中， 不进行碱基互补配对的步骤是()A. 人工合成目的基因B. 目的基因与运载体结合C. 将目的基因导入受体细胞D. 目的基因的监测和表达解析：目的基因的合成、 监测和表达以及与运载体结合都发生碱基配对行为。将目的基因导入受体细胞没有碱基配对行为。答案：C拓展延伸目前人工合成基因的方法主要有两条途径。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA 为模板，反转录成互补的单链 DNA 然后在酶的作用下合成双链DNA 从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出

21、相应的信使 RNA 序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学的方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。2019-2020 年高中生物 13 基因工程的应用难点剖析新人教版选修 3知识巧学一、植物基因工程硕果累累1. 抗虫转基因植物(1) 杀虫基因种类：Bt 毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝 集素基因等。(2) 成果：抗虫植物，如棉、玉米、马铃薯和番茄等。学法一得植物基因工程的成果都由两方面组成：一是外源基因来源；二是外源基因的表达成果。 虽然教材内容繁多，但是，我们在学习时，只要抓住上述主线，就能轻松掌握这部分内容。2. 抗病转基因植物(1)

22、植物的病原微生物：病毒、真菌和细菌等。（ 2）抗病基因种类1抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因和病毒复制酶基因。2抗真菌基因：几丁质酶基因和抗毒素合成基因。3成果：烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦、辣椒和番茄等。3. 其他抗逆转基因植物（1）抗逆基因：调节细胞渗透压的基因，使作物抗盐碱、抗干旱；鱼的抗冻蛋白基因 使作物耐寒；抗除草剂基因，使作物抗除草剂。（ 2）成果：烟草、大豆、番茄、玉米等。4. 利用转基因改良植物的品质（1） 优良基因：必需氨基酸的蛋白质编码基因、控制番茄果实成熟的基因和植物花青 素代谢有关的基因。（2） 成果：转基因玉米、转基因延熟番茄和转基因矮牵牛。深化升华 转基

23、因生物与目的基因的关系转基因生物抗虫棉抗真菌立枯丝核菌的烟草目的基因 Bt 毒蛋白基因 几丁质酶基因和抗毒素合成基 因调节细胞渗透压的基因目的基因从何来 苏云金芽孢杆菌抗盐碱和干旱作物耐寒的番茄抗冻蛋白基因鱼抗除草剂大豆抗除草剂基因增强甜味的水果降低乳糖的奶牛甜味基因肠乳糖酶基因生产胰岛素的工程菌人胰岛素基因人动物基因工程的成果就是由两方面组成： 一是外源基因， 如生长激素基因、 肠乳糖酶基 因、药用蛋白基因、 抗原决定基因等；二是外源基因在动物体内的表达成果，如动物生长速 率加快、转基因鲤鱼、乳腺生物发生器、没有免疫反应的克隆猪器官。1. 用于提高动物生长速度（1） 生长基因：外源生长激素基

24、因。（2） 成果：转基因绵羊、转基因鲤鱼。2. 用于改善畜产品的品质（1） 优良基因：肠乳糖酶基因。（2） 成果：转基因牛乳糖含量少。3. 用转基因动物生产药物 （1）基因来源：药用蛋白基因乳腺蛋白基因启动子。（ 2）成果：乳腺生物反应器。4. 用转基因动物作器官移植的供体（1） 器官供体：抑制或除去抗原决定基因。（2） 成果：利用克隆技术培育没有免疫排斥反应的猪器官。联想发散 基因技术的突破使科学家们得以用传统育种专家难以想象的方式改良农作物。例如，基因技术可以使农作物自己释放出杀虫剂， 可以使农作物种植在旱地或盐碱地上， 或者生产出 营养更丰富的食品。科学家们还在开发可以生产出能够防病的疫

25、苗和食品的农作物。基因技术也使开发农作物新品种的时间大为缩短。 利用传统的育种方法， 需要七八年时 间才能培育出一个新的植物品种， 基因工程技术使研究人员可以将任何一种基因注入到一种 植物中，从而培育出一种全新的农作物品种，时间则缩短一半。5. 基因工程药品异军突起基因工程药物，是重组D.A的表达产物。广义地说，凡是在药物生产过程中涉及利用 基因工程的，都可以称为基因工程药物。在这方面的研究具有十分诱人的前景。基因工程药物研究的开发重点从蛋白质类药物， 如胰岛素、 人生长激素、 促红细胞生成 素等大分子蛋白质， 转移到了寻找较小分子的药物上。 这是因为蛋白质的分子一般都比较大， 不容易穿过细胞

26、膜， 因而影响其药理作用的发挥， 而小分子药物在这方面就具有明显的优越 性。另一方面对疾病的治疗思路也开阔了， 从单纯的用药发展到用基因工程技术或基因本身 作为治疗手段。知识拓展 现在，还有一个需要引起大家注意的问题，就是许多过去被征服的传染病， 由于细菌产生了耐药性，又卷土重来。其中最值得注意的是结核病。据世界卫生组织报道， 现已出现全球肺结核病危机。 本来即将被消灭的结核病又死灰复燃， 而且出现了多种耐药结 核病。据统计，全世界现有 17.22亿人感染了结核病菌，每年有 900 万新结核病人，约 300 万人死于结核病，相当于每 10 秒钟就有一人死于结核病。科学家还指出，在今后的一段时

27、间里， 会有数以百计的感染细菌性疾病的人将无药可治，同时病毒性疾病日益增多， 防不胜 防。不过， 与此同时，科学家们也探索了对付这些疾病的办法，他们在人体、昆虫和植物种 子中找到一些小分子的抗微生物多肽，它们的相对分子质量小于4 000 ，仅由 30 多个氨基酸组成， 具有强烈的广谱杀伤病原微生物的活力， 对细菌、 病菌和真菌等病原微生物能产生 较强的杀伤作用， 有可能成为新一代的“超级抗生素”。 除了用它来开发新的抗生素外， 这 类小分子多肽还可以在农业上用于培育抗病作物的新品种。四、基因治疗曙光初照 随着人类对基因研究的不断深入， 发现许多疾病是由于基因结构与功能发生改变所引起 的。科学家

28、将不仅能发现有缺陷的基因， 而且还能掌握如何进行基因诊断、 修复、 治疗和预 防，这是生物技术发展的前沿。这项成果将给人类的健康和生活带来不可估量的利益。所谓基因治疗是指用基因工程的技术方法， 将正常基因转入病患者的细胞中， 以取代病 变基因，从而表达所缺乏的产物， 或者通过关闭或降低异常表达的基因等途径， 达到治疗某 些遗传病的目的。目前，已发现的遗传病有6 500 多种，其中由单基因缺陷引起的就有约3000 多种。因此，遗传病是基因治疗的主要对象。第一例基因治疗是 1990 年在美国进行的。当时，两个 4 岁和 9 岁的小女孩由于体内腺 苷脱氨酶缺乏而患了严重的联合免疫缺陷症。科学家对她们

29、进行了基因治疗并取得了成功。 这一开创性的工作标志着基因治疗已经从实验研究过渡到临床实验。1991 年，我国首例 B型血友病的基因治疗临床实验也获得了成功。基因治疗的最新进展是有望将基因枪技术用于基因治疗。其方法是将特定的D.A用改进的基因枪技术导入小鼠的肌肉、肝脏、脾、肠道和皮肤，获得成功的表达。这一成功预示 着人们未来可能利用基因枪传送药物到人体内的特定部位，以取代传统的接种疫苗， 并用基因枪技术来治疗遗传病。目前，科学家们正在研究的是胎儿基因疗法。 如果现在的实验疗效得到进一步确证的话， 就有可能将胎儿基因疗法扩大到其他遗传病， 以防止出生患遗传病症的新生儿， 从而从根本 上提高后代的健

30、康水平。问题探究问题 1动物乳腺生物反应器有何优点？探究：动物乳房之所以能作为反应器是因为它是一种高度分化的专门化腺体，质的能力非常强，尤其是一些经过长期的遗传改良，专门产奶的乳用动物品种。这种反应器有四大优点：（1）产量高，易获得目标产品； （ 2）目标产品质量好，因为乳 腺组织具有一整套全面对蛋白质进行合成和加工的能力；（ 3）产品成本低；（4）从奶牛中提取产品，操作简单。合成蛋白问题 2 利用基因工程如何实现动物乳腺生物反应器的操作过程？ 探究：操作过程大致归纳为： 获取目的基因T构建基因表达载体T显微注射导入哺乳动物受精卵中T形成胚胎T将胚胎送入母体动物T发育成转基因动物（只有在产下的雌性个体中，转入的基因才能表达） 。典题热题例 1