海洋多糖水凝胶作为玻璃体填充物的研究解析

1、海洋多糖水凝胶作为玻璃体填充物的研究第一章文献综述1 玻璃体填充物简介1.1 玻璃体概况玻璃体是眼球后部空腔内的一种透明胶状体，占据了超过2/3的眼球体积。玻璃体为视网膜提供适当的支撑，保护周围的眼组织不受机械创伤，使光线能够到达眼球后方的感受器，调节眼内氧含量和眼球形状，同时允许代谢物和其他溶质的扩散运输。据研究i，人玻璃体80%的成分为胶体，20%的成分为液体，而后者随年龄增长比例上升。而其他大多数哺乳动物玻璃体不含液体成分。目前普遍接受的观点是：玻璃体是通过线形的胶原纤维随机排列提供刚性骨架，骨架间充满混杂着高分子的卷曲的透明质酸，透明质酸以其钠盐形式存在。这两种生物大分子以这种方式互相

2、作用使得玻璃体在正常状态下是一种稳定的水凝胶，但在病理状态下，这种水凝胶会发生脱水收缩或机械崩塌。研究人员认为ii，很难将天然玻璃体划分为多组分聚合物材料的一种，既不能定义为高分子共混物或接枝共聚物，也不能称为嵌段共聚物或多项聚合物体系。这是因为目前都还不能确定玻璃体的两种主要成分之间或某一种成分内的相互作用是交联、物理混合还是共价结合。1.2 玻璃体填充物的需求玻璃体对于眼睛的重要性不只是因为其光学性能和机械性能，还因为它在周围组织甚至是整个眼球的疾病和治疗过程中起到的重要作用。有两种情况下需要人工玻璃体来补充或者取代天然玻璃体，来防止失明。首先，玻璃体自身可能因为浑浊、物理崩塌或液化而失去

3、功能。导致玻璃体失去功能的病理原因包括iii-v：发育异常、炎症（感染、创伤或视网膜疾病导致）出血、全身疾病（如癌症、糖尿病等）和组织退变（如年龄增长、近视、遗传性视网膜疾病等）。玻璃体的损伤可能由机械损伤、化学损伤、热损伤或玻璃体异物引起。玻璃体一旦发生崩塌或液化后很容易与视网膜分离，继而由于牵拉作用导致玻璃体出血、视网膜表面损伤甚至脱离。以上所述情况均可能导致患者发生视力严重减退甚至失明。这种情况下，需要一种生物相容性良好且透明的材料来代替病变的玻璃体。然而，对玻璃体病变的治疗还不是玻璃体填充物如此重要的最主要原因。事实上，世界上因为玻璃体病变而失明的人数远少于白内障、角膜功能异常和视网膜

4、疾病。更多情况下，在多种CRD的手术治疗中，最需要一种暂时的或永久的能够注射入玻璃体腔的填充物。视网膜是眼睛的光接收器，是包围玻璃体的三层组织中的一层。这一重要的结构可能因为很多原因受损（通常是发生视网膜脱离），如果不及时治疗或治疗失败很可能导致失明。视网膜脱离是指视网膜结构中的感觉层与后方的视网膜色素上皮层发生分离。玻璃体脱离可能产生对视网膜的牵拉，这一牵拉作用可能使视网膜被撕裂，继而由于液体流入视网膜两层之间使两层分离，发生视网膜脱离。视网膜脱离后，在其后方的液体作用下发生漂浮，视网膜和其上的血管皱褶、浑浊，其光接收器功能丧失，导致视力严重下降。在许多玻璃体视网膜手术中需要玻璃体填充物的参

5、与。向玻璃体腔注射填充物是为了作为辅助手段保持眼球体积和眼内压，或者代替损伤的玻璃体。这种注入的物质应当能够产生眼内压以顶压视网膜使其与脉络膜结合。需要玻璃体填充或补充的情况有如下几类vivii：视网膜复位手术中将视网膜下方的液体排出后，严重脉络膜脱离中液体排出后，玻璃体切除后为了保持眼球的体积和压力，视网膜浅脱离而情况又不适合做巩膜扣带术时，存在玻璃体牵拉时的玻璃体视网膜手术，发生玻璃体崩塌行巩膜扣带术时，眼后部穿透性损伤修复手术，眼球修复后眼压过低时。1.3 理想的玻璃体填充物一个世纪以来，人们进行了众多的尝试，企图找到一种有功能的能够代替天然玻璃体的物质，却发现这并不是简单的工作viii

6、。根据天然玻璃体的特性和目前各种经验，研究人员认为一种理想的玻璃体填充物需要满足以下几个条件：（ 1）无色透明，密度和屈光度等物理性质应当与天然玻璃体相似；（ 2）可储存和灭菌，具有化学和生物学惰性，无毒，这样就不会引起不良生物反应（如炎症，细胞侵入，瘢痕，原骨胶原形成）；（ 3）与玻璃体液和周围组织相容性良好且不影响其生理功能；（ 4）不吸收，不发生生物降解，在玻璃体腔内存留时间尽可能长；（ 5）流变学性能合适且能够维持较长时间，本身不会通过视网膜裂孔，能使视网膜复位且能防止视网膜再脱离；（ 6）具备一定刚性，能使视网膜和脉络膜的紧密结合，且能够抵消视网膜和玻璃体之间的牵拉作用；（ 7）能够

7、允许周围组织代谢物和蛋白等物质在玻璃体内的运输，不影响新陈代谢过程；（ 8）在手术过程中使用高温、低温或激光封闭视网膜裂孔时，依然能够保持透明；（ 9）能通过小的注射器针头进行注射且以上性质都不发生改变，或者能通过小的切口移植；（ 10）最好是亲水性物质，含水量高但不能溶解于水。目前来看，尽管已进行了多年的探索实验，还未能找到满足这一系列复杂要求的材料，成功填充玻璃体。1.4玻璃体填充物的发展1.4.1 目前使用的玻璃体填充物目前使用的玻璃体填充物一般分为以下三类：气体（空气，扩张性气体），液体（平衡盐溶液，全氟化碳液体，半氟烷烃，硅油等）和人工玻璃体胶囊。这些在使用的物质作为玻璃体填充物只是

8、主要满足了机械性能方面的要求，对于理想的长期填充物来说，还有许多方面需要改进。（1）气体1911年Ohmix第一次在视网膜脱离的治疗中采用了注入空气的方法。空气价格低廉且不用移除，在眼内能够被吸收，被液体取代。但是空气在玻璃体腔内的存留时间只有几天x，此外，其屈光指数（1.008）也与天然玻璃体液相差较大。扩张性气体自1970s开始用于玻璃体填充，使用最多的是六氟化硫和全氟丙烷。它们都是无色、无味、无毒的气体，在1993年被美国食品药品监督管理局批准用于充气性视网膜固定术xi。气体主要用于充气性视网膜固定术的手术过程中以及术后的内填充。气体在所有玻璃体填充物中具有最大的表面张力，能够产生良好的

9、填充作用，且能够被人体吸收，被眼内液取代，而不需要二次手术取出。其主要缺点是扩张性气体可能造成眼内压急剧上升，导致视网膜中心动脉闭塞xii；由于密度低于水，不能对下方视网膜产生有效的顶压作用xiii；术后需保持一定的体位以维持其顶压作用xiv；另外还可能导致白内障，以及对角膜内皮造成损伤等xv。（2）全氟化碳液体最早用于玻璃体填充的液体是水和平衡盐溶液xvi。平衡盐溶液粘度较低，存留时间较短，不能产生有效的填充作用。现代使用的液体玻璃体填充物全氟化碳（PFCLs）是1990s开始使用的xviioPFCLs是透明无色无味的液体，且具有能够运输02和CO2的优点xviii。PFCLs可用于CRD的

10、手术中临时展平视网膜，但其毒性限制了它作为玻璃体填充物的应用推广xix。（3）氟化烷烃氟化烷烂（FAs）最早于2000s开始在视网膜玻璃体手术中使用xx。其密度为1.35g/mL,屈光指数为1.3xxi。氟化烷烃主要是在使用硅油效果不理想时做临时内填充物使用。其主要缺点是可能发生乳化，引起白内障，以及导致视网膜前膜产生xxii-xxiv。（4）硅油硅油（SO）从1960s开始被用作玻璃体填充物，但直到1994年才通过美国食品药品管理局的认证xxv。它与硅胶类似，但分子链更短，也没有化学交联，故呈液态。硅油是一种疏水物质，具比重约为0.97g/mL,屈光指数为1.4。硅油可以用于CRD后的短期或

11、长期填充，它也是目前唯一一种可用于长期玻璃体填充的眼内填充物ix。有几种不同粘度的硅油，其相关性质也有差异，目前临床上用的主要是1000和5000厘池的硅油xxvi。硅油表面张力较高，毒性较低，且透光性较好，便于移除。但也存在诸多缺点：首先硅油表面张力还是小于气体和平衡盐溶液，手术中容易通过视网膜裂孔进入视网膜下ix，其次硅油是一种疏水性液体，注入玻璃体腔后与视网膜接触效果不良，再次，虽然透明性较好，但屈光度与天然玻璃体相差还是较大xxvii，第四，可能导致角膜病变和白内障等并发症xxviii，另外还存在乳化问题，需二次手术取出。5）人工玻璃体胶囊人工玻璃体胶囊主要由球囊、引流管和引流阀三部分

12、组成，球囊由硅橡胶薄膜制成，引流管主要起到连接球囊与引流阀的作用。球囊部分可通过微创切口植入眼内，其内部可以加注流动介质，使球囊形成玻璃体形状填充眼球，注入的物质可选择生理盐溶液、硅油等。人工玻璃体胶囊可减少硅油诱导的硅油乳化、青光眼、角膜变性等并发症，避免水凝胶在眼内降解吸收过快等弊端。但其缺点是，人工玻璃体胶囊填充流动介质后形成的球囊并不具有天然玻璃体的屈光性能和粘弹性能，手术造成的创伤较大，容易引起较严重的术后炎症反应，且亲水性、通透性较差，会影响眼内物质的交换和运输，长期填充可能造成眼内营养代谢紊乱xxix。1.4.2聚合玻璃体填充物研究现在使用的玻璃体填充物的缺点和局限性促使人们寻找

13、各种材料作为理想的人工玻璃体。使用合成的聚合物来补充或代替玻璃体的研究始于二十世纪50年代。目前，半合成的（如修饰的天然高分子）和完全合成的多种聚合物都已被尝试用来作为玻璃体填充物。1.4.2.1 半合成聚合物一些天然高分子的水溶性衍生物可以以水溶液形式注射入玻璃体腔，但是会很快被排出。尽管他们并不能作为长期的玻璃体填充物，但其中一些已经发展成为临时使用的粘弹性物质，在眼前节或后节手术中均起到良好的辅助作用。（1）多糖考虑到透明质酸钠本身是天然玻璃体的重要组分，人们尝试用其代替玻璃体。透明质酸钠相容性良好，但只能在眼内存留较短时间，且对视网膜的顶压效果不理想，不是合适的玻璃体填充物。后来人们试

14、图使用甲醛或乙烯砜共价交联透明质酸以降低其水溶性，使其在眼内的存留时间能够延长xxx。结果该交联透明质酸存留时间有所增加，但仍然因为粘着性较差容易通过视网膜裂孔进入视网膜下方。Kishimotoxxxi尝试了使用葡聚糖、海藻酸、硫酸软骨素、树胶、甲基纤维素和羧甲基纤维素代替玻璃体，结果表明尽管炎症反应在两周内消失，但一个月后过半数的术眼玻璃体变得不透明。Morixxxii将硫酸软骨素或海藻酸钠注入大白兔玻璃体腔，开始过半玻璃体变得不透明，但在一个月内恢复，视网膜有轻微损伤，随后Mori将海藻酸钠用于临床，它没有引起术后炎症反应，但不能使视网膜复位。Wilhelmus等xxx间将竣甲基纤维素钠溶

15、液注入四只大白兔眼内，具表现出良好的相容性，但未见存留时间的报道。Fernandez-Vigoxxxiv向兔眼注射羟丙基甲基纤维素溶液（HPMC）（粘度6000cSt，Mw=86kDa）。HPMC植入10w后完全消失，因此，HPMC溶液不适合做长期玻璃体填充和封闭视网膜裂孔。然而，考虑到HPMC良好的相容性，这个团队尝试改变了HPMC的分子量进行进一步实验，使用粘度6000cSt，Mw=120kDa的HPMC，结果表明其半衰期为38天，仍不适合做长期填充。（2）明胶阿玛斯特丹大学的一个研究团队制备了一种改性的明胶，称作“聚明胶肽”，他们尝试用其作为玻璃体填充物。这种物质是通过将明胶热降解制得，

16、之前被用作血浆代用品，未见引起过敏或有抗原性的报道，其水溶液在室温下稳定，屈光指数与天然玻璃体非常接近。在注入120只兔子玻璃体腔后，未见明显不良反应，但10天内77.5%的聚明胶肽已经被降解掉，表明其不适合作为永久性填充物。然而在人视网膜脱离手术中使用聚明胶肽，发现术后没有不良反应，且大部分视网膜成功复位。研究者称其可以作短期应用，但随后未见相关报道。1.4.2.2 合成聚合物（1）聚1-乙烯基-2-吡咯烷酮聚1-乙烯-2-吡咯烷酮（PVP）是最早被用于代替玻璃体的人工合成的聚合物。1954年Scuderi向兔眼中注射不同剂量的PVP，没有不良组织学反应，但是术后玻璃体变得不透明。最近Chi

17、rila使用丁二烯二醇（DVG）交联1-乙烯-2比咯烷酮（VP）单体得到了一种透明（RI=1.3390）水凝胶，密度、粘弹性等也与人玻璃体接近，这种交联PVP水凝胶植入动物眼内后没有观察到对视网膜的损伤，但是发生了玻璃体混浊。另外，这种多聚物由于噬菌作用发生生物了降解。他还将PVP与2-羟乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）使用DVG或己二烯醚（DAE）聚合形成水凝胶，植入兔眼，这种水凝胶透明、不溶于水、机械强度与天然玻璃体相近，植入后除了暂时玻璃体浑浊外，没有不良反应。然而，注射过程通过一根非常小的针头，使这种聚合水凝胶碎裂，机械性能下降。另外，所有的术眼都能观察到炎症细胞和含有小粒材料的空泡，表面

18、材料存在被吞噬的现象。（2）聚丙烯酰胺丙烯酰胺是一种有毒且致癌的化合物，然而它的聚合物并没有毒性，且在多种生物环境下表现出较好的生物相容性。Mullerxxxvxxxvi报道了使用聚丙烯酰胺（PAA）作为兔玻璃体填充物的研究，他们讲单体加入引发剂在玻璃体腔内直接聚合，没有使用交联剂，所有病例术后第一天都能观察到刺激反应，但很快消失，在多数动物中3个月时聚合物未发生降解且保持透明。最近丙烯酰胺和双丙烯酰胱胺（BAC）用二硫化物交联剂交联，用来作为玻璃体填充物，二硫化物交联剂的使用使残留的单体被除去，得到高纯度的聚合物，植入时可以在眼内原位形成凝胶，不会造成碎裂，引起粘弹性质和机械性质的下降xxx

19、vii-xxxix这些结果表明PAA作为玻璃体填充物进一步研究的潜力，但是丙烯酰胺多聚物降解过程中产生的丙烯酰胺单体对机体的毒副作用仍是需要考虑的重要方面。（3）聚甲基丙烯酸甘油酯Refojoxlxli第一次将聚甲基丙烯酸甘油酯（PGMA）注入玻璃体腔，作为玻璃体填充物。球形的脱水PGMA通过兔眼玻璃体腔上一个小切口植入，植入物原位吸水膨胀，可达到干态体积的32倍，这种凝胶生物相容性较好好，7个月的观察时间内无炎症，无并发症，但是PGMA因为植入过程创口较大，不适合作玻璃体填充，另外，吸水达到最大体积的过程较慢，即时顶压作用差。随后Hogen-Esch等冈i合成了一种可注射PGMA水凝胶。这种

20、胶可以吸收盐溶液达96%，吸水膨胀后保持柔软透明。植入兔眼后无并发症，效果良好，但是，注射时凝胶发生碎裂，没有进一步的研究。（4）聚乙烯醇聚乙烯醇（PVA）通常通过在聚乙酸乙烯酯（PVAc）的甲醇或乙醇溶液中添加氢氧化钠皂化得到。最终游离的乙酸基的数量决定了PVA的水溶性。在水溶液中可以使用交联剂交联PVA得到不溶于水的凝胶。Yamauchi及其团队对交联的PVA凝胶用于玻璃体填充进行了多年的探索xliii,xlivo他们用丫射线照射7%的PVA溶液形成凝胶，这种凝胶可经高压灭菌，吸水后含水量可达99%，注入兔眼后，短期内没有炎症反应和其他并发症，随后报道显示部分术眼出现炎症和玻璃体混浊，但也

21、可能是因为个体差异。此外，Yamauchi等还将PVA与硫酸软骨素混合，这一混合物吸水量更大，透明性也更好，但生物相容性较差。PVA可能是一种合适的玻璃体填充物，但是其存留时间目前还没有确切的研究过。2010年Leone使用不同量的三偏磷酸钠（TSTMP）作为交联剂得到PVA水凝胶。全面测试了这种材料的性质，包括透光率，含水量，流变学性质和体外毒性评价。分子在凝胶中的扩散行为也通过构建溶液模型进行了评价。各种测试表明这种凝胶（TSTMP:PVA为1:8）能够满足玻璃体填充物的要求。但是进一步的研究还要进行，包括存留时间，机械性能和使视网膜复位的能力。（5）聚丙烯酸羟乙酯聚丙烯酸羟乙酯（PHEA

22、）凝胶由环氧丙烯酸酯交联丙烯酸羟乙酯得到xlv,这种凝胶可经高压灭菌，透明性好，粘度高，不吸收，可注射，且相容性良好。但在注入前房和玻璃体腔后，在前房引起了纤维增生，在凝胶周围形成薄膜，在玻璃体腔，引起了暂时的混浊，纤维膜增生，脉络膜视网膜萎缩，表明其在眼内相容性较差，不能用作玻璃体填充物。（6）聚甲基丙烯酰胺基甲氧基乙酸酯近年来，研究者合成了一系列的聚甲基丙烯酰胺基甲氧基乙酸酯（MAGME）多聚物用于玻璃体填充xlvixlvii，最终一种均聚物（PMAGME）被用来进行体内实验，这种凝胶透明，可注射，可高压灭菌，粘性好，充分溶胀后含水量超过99%，注射过程中凝胶发生部分碎裂，但可以忽略，但是

23、术后反应较为严重，包括视网膜脱离，炎症和一定程度的视神经损伤。这种毒性反应的原因还不清楚，可能是聚合物本身，更可能是残留的丙烯酰胺。结果表明PMAGME凝胶对眼后节毒性较大，不能用于玻璃体填充。对PMAGME的研究首次提示了在选择一种聚合物作为玻璃体填充物时，首先在体外对材料进行毒性评价的重要性。2 甲壳素与壳聚糖及其衍生物在眼科领域的应用2.1 甲壳素、壳聚糖及其衍生物简介2.1.1 甲壳素和壳聚糖概述甲壳素(Chitin,CT)是广泛分布在自然界甲壳纲动物的甲壳中、以及真菌和植物细胞壁中的一种天然有机高分子多糖xlviiixlix，最早由法国研究人员从霉菌中发现。自然界天然存在的有机物高分

24、子中，CT的蕴藏量仅次于纤维素，位居第二位，年产量可达1X1011吨。CT是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖通过3-1,4糖昔键连接而成的多糖1 ，分子量大，水溶性差。其结构式为：壳聚糖(CTS)是甲壳素在碱性条件下水解脱去部分N-乙酰基得到的li,通常来说，CT脱乙酰度达到55%以上就可称为CTS。CTS是最重要的CT脱乙酰化衍生物，其结构式为：CT固体为白色半透明片状，由于分子间强烈的氢键作用，不能溶于水、稀酸、稀碱等溶剂，也不能溶于常见的有机溶剂。而CTS的溶解性能优于甲壳素。CT具有良好的理化性质，能拉丝、成膜、制粒等，而且具有活泼基团，能进行化学接枝、能与多种物质结合、没有

25、毒性、生物相容性良好，此外，丰富的资源、简单的制备方法和低廉的价格也是其优势，使CT在许多领域得到广泛应用，其应用领域包括食品、医药、新材料、印染、水处理、化妆品等等lii，前景十分广阔。CTS是目前发现的唯一一种带有正电荷的天然多糖，同样具有优良的理化性质和生物相容性，同时溶解性能较甲壳素显著改善，应用范围得到扩展，已经引起人们的重视，在食品工业、化工环保、生化工程等许多方面具有广泛的用途。此外，CTS还具有良好的生物相容性，在体内与大分子亲和力高，在医药领域应用广泛，已经用于组织工程中的软骨组织工程liii、骨组织工程liv、皮肤组织工程lv、神经组织工程lvi、角膜组织工程lvii等多个

26、方面。2.1.2 甲壳素和壳聚糖衍生物CT和CTS及其降解产物寡糖和单糖都是天然无毒的产品，随着分子量的改变，其理化性质和功能活性也有所不同。但是CT和CTS都不溶于水，大大限制了其应用范围，不过，CTS每个糖单元的C2上都带有-NH2基团，C6上带有-OH，可以利用这一特点进行分子设计，通过控制化学反应条件衍生得到具有不同性质、功能和用途的新产品，这些衍生反应主要涉及到CT与CTS的酰基化、烷基化、羟基化、醚化、酯化和羧甲基化等。(1)羧甲基壳聚糖羧甲基壳聚糖(Carboxymethylchitosan，CM-CTS)是CTS通过羧甲基化反应制备的一种水溶性衍生物，一般通过在强碱性条件下氯乙

27、酸与CTS反应制得，是CT及CTS衍生物中最受关注，研究最多的一种。CTS分子中的活性羟基和游离氨基在都可以被竣甲基基团取代，相应的会生产。-竣甲基壳聚糖，N-竣甲基壳聚糖和N,O-竣甲基壳聚糖lviiio羧甲基的引入使CTS的二级结构发生变化，使其拥有强极性的羧酸盐结构，因此，与CTS相比，CMCTS的水溶性更好lix。CMCTS是一种两性多糖，具有许多优良性能，如抗菌性、保湿性、对金属离子的络合能力等，因此能够用来增强免疫力、用作化妆品的保湿剂、制备微量元素补剂等，在多个领域得以应用。此外，CMCTS还表现出优异的生物安全性和可降解性lx，在止血、抑菌、降血脂、修复创伤、防癌抑癌等方面的具

28、有独到的作用，得到广泛研究和应用。(2)羟丙基壳聚糖碱化壳聚糖与环氧丙烷反应，在CTS分子上接枝羟丙基基团，就可以得到羟丙基壳聚糖(hydroxypropylchitosan，HPCTS)lxi。经过接枝的CTS分子的空间构象发生了变化，分子间和分子内存在的氢键作用被削弱，水溶性大大提高，反应活性也得到改善，拓展了CTS的应用范围。HPCTS作为CTS的重要衍生物，除了具有吸湿保湿性、乳化性、成膜性、抗菌性等良好的生理活性，还具有生理适应性、可完全分解性等优良特性，被化学界、生物学界、医学界众多研究人员所关注lxiilxiii。有研究证实，HPCTS能够预防和治疗骨关节炎，其效果优于传统的透明

29、质酸药物lxiv；HPCTS能作为外敷药物，与其他药品共混后可治疗皮肤溃疡等炎症lxv;可将HPCTS与其他活性物质共混后浇注到胶原蛋白膜上制成能够对表皮细胞生长具有促进作用的活性膜lxvi。HPCTS的醋酸盐还被用在纤维细胞生长剂的载体，用于药物控释体系lxvii。此外，高分子量的HPCTS还具有良好的抗凝血作用lxviii。3）羟乙基甲壳素环氧乙烷或氯乙醇与碱性甲壳素在碱性介质中反应可以制得羟乙基甲壳素（Hydroxyethylchitin,HE-CT）lxix，它是CT的又一种重要衍生物。HE-CT在工业上具有广泛的用途，可用作乳胶稳定剂、织物洗涤剂、纺织上浆剂等lxx。另外HE-CT中

30、的乙酰氨基还能被一种酶选择性水解lx刈，可以用Remazol辉蓝R标记后用于溶菌酶活性的比色测定lxxii。（4）酰化甲壳素酰化甲壳素（Acylchitin，AC-CT）是CT通过高氯酸醋酐反应体系进行酰化反应制得的lxxiii。AC-CT的C3和C6位点上的酰基改变了甲壳素的结构，使其能够溶解在强酸等有机溶剂中。AC-CT可纺性高，其制成的纤维抗张强度和断裂伸长率也高于甲壳素纤维，是一种良好的制备纤维的原材料lxxiv。（5）小分子单糖壳寡糖和氨基葡萄糖单糖分子量低，结构明确，生理活性得到广泛研究。氨基葡萄糖可以用来治疗骨关节炎，有利于人体胶原蛋白合成；能够改善微血管循环，对抗生素药剂的注射

31、起到促进功能；可以用于糖尿病患者，起到营养补充剂的作用，此外还能够刺激婴儿肠道中益生菌的增生。故可以依据结构对寡糖和单糖进行改造，在其分子上连接药物、活性多肽、氨基酸等，研制出新型食品或药物lxxv。2.2 甲壳素与壳聚糖及其衍生物在眼科的应用多项研究表明，CT、CTS及其衍生物对眼组织无毒性无刺激，在眼部的安全性较好，用于眼部不会引起不良反应。Felt等lxxvi在角膜表面局部施用CTS,荧光素钠染色后观察发现CTS对角膜无刺激性，相容性良好；魏菁等lxxvii将医用CTS注入家兔前房，以生理盐溶液为对照，实验表明两者引起的反应相似；Dicolo等lxxviii将含CTS的植入物植入眼内，术

32、后未观察到对结膜、角膜的明显刺激症状，角膜内皮、晶状体上皮和视网膜等结构的病理切片观察无明显异常；赵国燕lxxix以CTS为原料，通过化学改性和酶解法制备了多种衍生物，细胞毒性检测显示这些CTS衍生物材料对角膜基质细胞和角膜上皮细胞均无毒性。此外，CT与CTS及其衍生物具有良好的物理特性，且化学性质比较稳定，光学性能良好，用于眼部对视力没有妨碍作用，在眼科生物医用材料方面具有良好的应用前景，目前其应用主要集中在以下几个方面：（1）人工泪液甲壳素类物质具有良好的生物安全性，兼有消炎、抑菌、止血的作用，因此用作泪液替代品可以有效缓解干眼症症状，同时对抑菌也可以起到一定的作用。王爱勤等lxxx通过临

33、床研究发现，以CTS原料制备人工泪液，将其应用于无泪液、结膜炎和干燥性角结膜炎的临床治疗时，治疗效果远优于传统的甲基纤维素原料的人工泪液。（2）医用粘弹剂经理化及生物学性质分析，分子量约70万Da的医用水溶性CTS动力粘度在850mP/s以上，化学性质比较稳定。而且水溶性CTS可在体内降解吸收，便于注入，无需取出即可消除，与角膜和房水渗透压接近，生物相容性良好，基本能够达到国际上眼科粘弹剂的相关标准。李由等lxxxi对白内障患者进行手术时以眼科惯用的粘弹剂透明质酸钠为对照，使用了水溶性CTS作为粘弹剂，术后测定了矫正视力、裂隙灯检查了前房反应、跟踪了眼压变化以及角膜内皮细胞密度变化等。检查结果

34、表明水溶性CTS组和透明质酸钠组无显著性差异。（3）可吸收手术缝线甲壳素纤维组织耐受性好，能加快创口愈合，兼具较好的抗菌消炎作用lxxxii，制成缝合线可进行常规消毒，具有适当的强度和柔韧性，方便缝合打结，在体内可降解吸收，且原料来源广泛，价格低廉，国外已形成商品。Goosenlxxxiii研究发现，CT缝线对于感染组织、尿液以及消化酶的耐受性较传统的肠线和PGA线的相关性能为优。（4）防术后粘连泪道粘膜粘连是激光治疗泪道阻塞的常见并发症，往往会造成手术失败。水溶性CTS能够促进上皮细胞的生长，同时却能够显著抑制成纤维细胞的生长，因此能够减少或避免胶质纤维形成，起到预防粘连的作用，同时水溶性C

35、TS还具有凝固血液和抑菌的作用，能够减少出血，降低感染几率，可用于防止泪道粘膜粘连。苏颖等lxxxiv在激光泪道成形术后将水溶性CTS注入泪道，与注入生理盐溶液的病例为对照，结果表明，两组比较有显著性差异，证明水溶性CTS能够有效预防术后泪道粘膜粘连，增加手术成功率。（5）抑制青光眼滤过术后纤维增生目前滤过性手术仍是治疗青光眼的主要方式，但滤过性手术后常见的并发症就是纤维组织增生和瘢痕粘连，这也是造成手术失败的重要因素之一。CTS能够抑制纤维组织增生，抑制瘢痕的形成，可以用来维持滤过通道，避免滤过泡发生瘢痕化。李洁等lxxxv对兔眼进行非穿透性滤过手术，随后将CTS膜植入巩膜瓣下，发现CTS具

36、有良好的眼内相容性，能够有效抑制纤维增生，维持滤过泡，起到较好的降低眼压的作用。（6）滴眼液滴眼液有效成分在眼内的吸收利用率很大部分由药物浓度、渗透性和停留时间决定。实验发现，水溶性CTS可有效增加药物在眼球表面的存留时间，使眼球表面维持较高的药物浓度水平，以提高药物的渗透性和利用效率。黄虹等lxxxvi以水溶性CTS为增稠剂改良氯霉素滴眼液，发现加入水溶性CTS后，氯霉素溶液张力无明显变化，稳定性也未受影响，而粘度有所提高，使药物在角膜表面能够长时间附着且保持一定浓度。（7）药物缓释CTS具有较好的亲水性，在酸性介质中能够膨胀成为胶状，从而起到防止药物扩散的作用，因此可载入药物，辅助药物在体

37、内的缓释。DeCampos等lxxxvii将CTS制成纳米颗粒，并以该颗粒为载体，研究了环孢霉素A在眼内的传递，环孢霉素A是一种良好的免疫抑制剂，但在房水中浓度高于一定水平时可对角膜上皮造成损伤，且对多种器官具有毒性。将载有环孢霉素A的CTS纳米颗粒用于兔眼48h内眼表组织均检测到有效药物浓度，而内眼结构和血液中环孢霉素A水平极低。（8）人工角膜支架材料CTS生物相容性好，可降解，可以加工成多孔组织工程支架。这种组织工程材料可以供细胞贴附生长，用于细胞移植和组织再生。高兴爽等lxxxviii用羟丙基壳聚糖与硫酸软骨素和明胶共混制备膜片，该共混膜透明性高、亲水性和离子透过性好，机械性能也较强，兔

38、眼前房植入显示该膜片在前房未引起明显炎症反应和免疫排斥，植入两个月时基本吸收。在该膜片上培养兔角膜内皮细胞，细胞生长状况良好，表明该膜片内皮细胞相容性优良，可以用来构建组织工程角膜内皮。(9)角膜接触镜CTS透氧率可达7X10-11cm2/s,其溶于乙酸后可与二氧化锂、二羟基乙烯氧化硫共混制备一种可塑性膜。该膜吸水性强，柔软性好，强度高，透氧性好，可用于制作隐形眼镜lxxxixxc。3 交联剂交联剂是一种具有多个末端，在每个末端有相同或不同的活性基团的分子。它们可通过共价键与其它分子上活性基团结合，如羟基、巯基、氨基等，从而产生交联作用。交联反应在研究蛋白质亚基结构、功能和相互作用中是一种非常

39、有效的手段，同时对于生物高分子材料的化学固定处理、提高其稳定性和持久性也起到良好的作用，是目前功能高分子材料研究应用中及其重要的一个方面xci。根据其来源的不同，生物学研究中常用的交联剂可以分为两类：化学交联剂和生物交联剂。前者是通过化学合成制备的，后者一般是从生物材料中提取。3.1 化学交联剂常用来修饰天然生物高分子的交联剂有戊二醛(glutaraldehyde)xcii、甲醛(formaldehyde)xciii、环氧化合物(polyepoxycompound)xciv、碳二亚胺(carbodiimide)xcv等。然而这些化学合成交联剂也具有一些缺点。首先，因为这些交联剂是人工化学合成得

40、到的，通常表现出较高的细胞毒性和较差的生物相容性xcvi-xcviii这使得经其交联处理的材料在用于有机体后，可能对受体组织的正常生长和代谢造成很大影响，从而对创口的愈合以及组织相关功能的恢复产生不利影响；其次，经某些化学交联剂交联的生物材料，如戊二醛和环氧化合物，植入有机体后易发生钙化现象，使植入物变得脆性较大、容易碎裂，机械性能大大削弱，从而影响植入材料在受体内的功能和寿命。由于上述化学交联剂存在的种种缺陷，学者们目前的工作主要集中在两个方面，一是努力寻找方法降低现有交联剂的毒性，提高其生物相容性，另一方面，也在积极研究开发毒性更小、生物安全性更高的新型生物交联剂。3.2 生物交联剂生物交

41、联剂主要包括两类，一类是由自然界生物体中提取得到的，另一类是将自然界存在的一些已知具有良好安全性的生物材料进行化学修饰而得到的。前者中目前得到广泛应用的有京尼平(Genipin),它是由桅子或杜仲里提取得到的xc冈。京尼平的化学结构中存在多个活性基团，如羟基、竣基等c,可以交联蛋白质、CTS、明胶和胶原等，形成性质稳定的交联产物，制备生物材料，且作为新型生物交联剂，其毒性远低于一般的化学交联剂ciciio然而，在使用京尼平对生物制品进行交联时，还存在以下缺陷：一是交联时会形成生蓝色物质，造成生物制品外观和色泽的改变。京尼平具有多个活性基团，一方面使其具有良好的交联性能，但另一方面，京尼平与蛋白

42、质和氨基酸反应能够自发进行例，产物是一种呈深蓝色的多聚体civ,虽然这种多聚体可以作为食用染料，但对某些生物制品，尤其是眼科生物材料而言，透明性和颜色是产品品质的重要方面，京尼平的使用大大受限。二是京尼平与人工合成的化学交联剂相比虽然具有毒性低、细胞相容性好的特点，但其低毒特性只表现在特异性种属和细胞中，对其他细胞，如牛软骨细胞cv、猪软骨细胞cvi、L929成纤维细胞cvii和PC12细胞cviii等在浓度较低时仍有明显毒性，甚至能引起人和小鼠肝癌细胞凋亡网。此外，京尼平虽然已经实现了商品化，但价格依然很高，这对它的推广应用在某种程度上也起到了制约作用。随着生物医用材料产业的兴起和发展，研究

43、开发既具有良好的生物相容性又价格低廉的生物交联剂具有重要的社会和经济价值cx。经化学修饰天然材料的到的生物交联剂既能保持其原料具有的优良生物学性能，又能发挥交联剂的功能，这一类生物交联剂的研究与应用日益受到重视，已经成为新的研究热点。有文献指出，单糖、二糖和多聚糖被氧化后能够成为较理想的天然生物交联剂cxi-cxiiio3.3 新型生物交联剂一氧化海藻酸钠3.3.1 海藻酸钠简介海藻酸钠(sodiumalginate,SA)是一种亲水性的天然高分子聚合物。它在自然界中储量丰富，通常从褐藻中提取得到cxivcxv,是一种良好的海洋生物资源，其安全性也已得到FTO和WHO等机构的认可，SA由P-D

44、-甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸以1-4键连接而成的线性多糖cxvi,两种糖单元具有不同的立体构象，其理化性质也不尽相同，故随着两种糖单元在分子中所占比例和位置的变化，SA的粘度、凝胶性等理化性质也有所不同cxviicxviiio3.3.2 海藻酸钠的应用SA具有优良的增稠性、凝胶性、和成膜性，兼具毒性低、生物相容性良好、可降解的特点，在多种工业中有着广泛的应用。（1）在食品工业中的应用SA于1944年开始应用于食品工业，1983年经过严格的生物学和毒理学研究和试验，正式获得FDA批准直接作为食品成分。其特殊的理化性质能够帮助改变食品的结构和性质，添加入食品后可以起到凝胶化、增稠、乳化、增强食

45、品稳定性的作用。并且SA作为一种食用纤维，对多种疾病还能起到预防和辅助治疗的作用。（2）在医药行业的应用SA具有低毒性、生物相容好且价格低廉等特点，因此被广泛应用于生物医药领域，可应用在组织工程领域填充或修复受损组织或器官cxix，用在药物中作为药物控释辅料cxx,cxxi，用作粘合剂制备肠溶胶囊cxxii，此外还可以制成注射液、软膏、用作止血剂等。（3）在其他工业中的应用SA具有较强的对金属离子的螯合和吸附性能cxxiii，可以在水处理中作为净化剂；SA具有易着色的特性，故可以用于纺织印花中，使产品色彩更鲜艳，手感更柔软cxxiv；此外还可以用于食品保鲜、洗涤剂的制造、橡胶工业中的浓缩剂等等

46、。由于SA优异的性能，随着提取工艺的不断改善，其应用领域还将不断拓宽。3.3.3 改性海藻酸钠作为生物交联剂最近有报道指出，高碘酸钠可以氧化SA，将其1,4-葡聚糖单元的C2-C3键打断，将1,2-二羟基转变为双醛基，得到氧化海藻酸钠（OSA）cxxv。戊二醛（glutaraldehyde,GA）对天然生物材料的交联活性来自于其双醛基基团与生物材料上的氨基的结合，而OSA具有与GA相似的活性基团，因此可能取代GA，成为理想的安全无毒的生物交联剂。4 本论文的提出和研究意义玻璃体疾病或视网膜脱离等玻璃体视网膜疾病会导致视力严重受损或失明等后果，严重影响着人类的健康。玻璃体-视网膜手术是目前治疗玻

47、璃体疾病和CRD的有效方法。玻璃体-视网膜手术中需要玻璃体填充物的参与，以保持眼球体积与压力，或者代替损伤的玻璃体，这种注入的物质应当能够产生眼内压以顶压视网膜使其与脉络膜结合。理想的玻璃体填充物需要无色透明、具有与天然玻璃体相当的密度和屈光指数、可储存灭菌，此外还应当具有良好的生物安全性，不能引起严重的过敏反应、组织炎症反应、致癌反应和其他队机体不利的反应。长期以来，研究人员进行了大量的探索实验，但目前还未能找到满足上述一系列复杂要求的具有功能的玻璃体填充物。目前临床上使用的玻璃体填充物主要有气体、全氟化碳液体、平衡盐溶液、硅油和人工玻璃体胶囊。气体主要用于充气性视网膜固定术和术后内填充，其

48、主要缺点是扩张性气体可能引起眼压急剧升高，导致视网膜中心动脉闭塞；由于密度低于玻璃体，在下方视网膜裂孔的情况下，不能产生有效的顶压作用；术后一段时间病人必须保持特殊的体位；另外还可能导致白内障和角膜内皮损伤等。平衡盐溶液粘度较低，存留时间较短，不能产生有效的填充作用。全氟化碳液体可用于CRD的手术中临时展平视网膜，但其毒性限制了它的应用。硅油可以用于CRD后的短期或长期填充，它也是目前唯一一种可用于长期玻璃体填充的眼内填充物，但它在手术中容易通过视网膜上的裂孔进入视网膜下方；屈光度与天然玻璃体相比有较大差别；可能导致角膜病变等并发症；另外存在乳化问题，需二次手术取出。人工玻璃体胶囊是最近面世的

49、一种新型玻璃体填充物，其屈光性能和粘弹性能与天然玻璃体相差较大，且手术造成的创口较大，术后容易引起较严重的炎症反应等机体不良反应。现在使用的玻璃体填充物的缺点和局限性促使研究人员继续寻找各种材料作为理想的人工玻璃体，水凝胶因其良好的光学特性和生物安全性，被认为是最有前景的玻璃体填充物。HPCTS是CTS接枝羟丙基基团得到的一种水溶性衍生物，具有良好的生物安全性、抑菌性、低免疫原性、且能够促进创伤愈合，已广泛引用于生物医药领域，但纯的HPCTS存在易溶于水、易降解吸收、机械强度较差等缺点，一般采用化学交联的方式对其进行改性，但一般使用的交联剂通常具有较高的毒性，不能大量用于医用生物材料的交联处理

50、。SA是天然生物材料纤维素的衍生物，可被高碘酸钠氧化得到OSA,可能取代GA，作为生物交联剂，但其生物安全性还需要进行系统的评价。因此，本文使用高碘酸钠对SA进行氧化，得到OSA，并研究了其理化性质、对多糖的交联性能和生物安全性。然后使用OSA作为交联剂交联HPCTS制备水凝胶，研究了这种水凝胶的相关理化性质、光学性能、流变学性能、生物相容性和生物降解性以及在眼部的组织安全性，并进行了玻璃体替换实验，考察其作为玻璃体填充物的可行性，为玻璃体填充物的研究提供了新的方向，为甲壳素类在眼科的应用开辟了新的思路。第二章氧化海藻酸钠的制备和性质研究海藻酸钠(SA)是从褐藻中提取得到的一种天然线性阴离子型

51、高分子化合物，具有顺二醇结构。其无毒，无味，水溶性、成膜性和生物安全性良好，可生物降解性，而且对光、热都具有良好的稳定性，已被广泛应用到食品、医药等工业的各个方面cxxvicxxvii。本章旨在使用高碘酸钠氧化SA糖环中的顺二醇结构，在SA结构中引入醛基这一新的活性基团，制备氧化海藻酸钠(OSA),并通过改变高碘酸钠的用量得到不同氧化度的氧化产物，研究其基本理化性质和交联能力，并系统评价其全性，以期其作为一种安全有效的生物交联剂，用于交联壳聚糖类，改善其水溶性、力学性质和降解特性，使其在眼科得到更好的应用。1 材料和方法1.1 实验材料和试剂1.2 主要仪器设备1.3 氧化海藻酸钠的制备及基本

52、性质测定1.3.1 氧化海藻酸钠的制备将SA溶于蒸馏水中配成2%的溶液，加入按比例配制好的高碘酸钠水溶液，室温条件下避光磁力搅拌反应24h,加入过量乙二醇终止反应半小时,95%乙醇沉淀反应产物，过滤，无水乙醇脱水，真空干燥得到OSA。重复以上步骤，调整高碘酸钠溶液浓度制备不同氧化度的OSA产物cxxviii。1.3.2 氧化海藻酸钠红外光谱表征取不同氧化度OSA干燥至恒重，以SA为对照，经溴化钾共混后压片，使用傅里叶变换红外光谱仪测定其红外谱图（Fouriertransforminfraredspectroscopy,FTIR）,使用omnic-32软件分析谱图。1.3.3 氧化海藻酸钠水分测

53、定将称量瓶干燥至重量恒定，称量，其质量记录为Woo精确称取OSA2g放入称量瓶，称量样品和称量瓶的总质量，记录为Wi。将干燥箱温度设定为105C,放入样品干燥3h后取出放入干燥器中冷却至室温后称重。再在105c下继续干燥3h,于干燥器中冷却后称重。重复以上步骤，直到两次称重结果小于0.002g为止，认为样品已包重，这时样品和称量瓶的总质量记录为W2。水分（）计算公式如下:水分（）_W 1 -W 2-W 1 -W 01001.3.4 氧化海藻酸钠灰分测定将培竭洗净烘干，放入马弗炉中，将温度设定为550C,灼烧30min,待温度降至100c后将培竭取出，放入干燥器中冷却至室温并称重，重复灼烧、称重

54、，直到两次质量差小于0.001g。将几种OSA样品烘干至包重，分别精密称取2-3g,置于已恒重的培竭中，培竭质量记为Wo,培竭和干燥样品的总质量记Wi。于电炉上加热，待样品完全碳化后，移至马弗炉中，设定温度为580C,灼烧灰化4h,温度降至100c时取出，于干燥器中冷却至室温并称重。再次放入马弗炉中灼烧1h,冷却至室温后称重。反复灼烧样品至两次称重质量差小于0.001g,认为样品已包重，此时样品残法和培竭的总质量记为W2o灰分（）计算公式如下:灰分（%）_W 2 -W 0=W1 -W 01001.3.5 氧化海藻酸钠旋转粘度测定取几种氧化度的OSA于105c烘干至恒重，然后分别称取1.0g,溶

55、解在蒸储水中配成1%的溶液，置于100mL烧杯中，用旋转粘度仪，测定旋转粘度。取多组不同转速，获得多组数据取平均值。1.3.6 氧化海藻酸钠氧化度测定采用盐酸羟胺法，其原理为，盐酸羟胺与醛基发生西佛碱反应，该反应为定量的反应，反应过程中释放盐酸，用NaOH滴定生成的盐酸，可得醛基含量,其反应式如下:R-CHO+NH20H-HCl-R-CH=NOH+HCl+H2O将0.5gOSA样品溶解于25mL蒸储水中，使用NaOH调节其pH到5.0。配制0.72mol/L的NH20H-HCl溶液20mL,用HCl调节pH至U5.0。将上述两种溶液混合，40c水浴下搅拌反应4h0用NaOH标准溶液滴定反应产生的盐酸。以相同浓度的SA溶液作为对照。OSA氧化度计算公式如下：MNaOH(VcVb)/2D.O.(%)=()义100%m/211其中MNaOH为NaOH标准液的浓度(mol/L)m为OSA样品干品的质量(g)211为OSA糖单元的平均相对分子量Vc为OSA样品与盐酸羟胺反应物消耗NaOH的体积(L)Vb为SA与盐酸羟胺反应物消耗NaOH的体积(L)1.4 氧化海藻酸钠的交联性能评价1.4.1 氧化海藻酸钠交联羟丙基壳聚糖将羟丙基壳聚糖(