大肠杆菌培养感受态制备质粒转化及鉴定

1、大肠杆菌的培养培养基配制：（液体培养基）取的烧杯，加入适量的一蒸水（V），称取胰蛋白胨酵母提取物倒入烧杯中加入磁子搅拌，至完全溶解用调，定容至分装后高压蒸汽灭菌（固体培养基）在液体培养基的基础上加入琼脂糖：液体培养基一琼脂糖（用水先溶解）在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解分装后高压灭菌抗生素的加入温度要求：高压灭菌后，将融化的固体培养基置与。的水浴中，待培养基温度降到。时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。注意事项：电炉子温度不要太高，烧杯直接加热时电炉子上要加石棉网高压灭菌时，瓶盖上要插上针头，防止灭菌时瓶盖喷出2定倒平板：培养皿要提前进行灭菌、烘干，在超净工作台里

2、，打开酒精灯，在酒精灯的火焰旁进行操作，倒完后做好标记3定接种（平板划线分离法）：接种环挑取大肠杆菌进行接种：图式：注意：每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。4定37恒温培养箱培养：接种好的培养皿正置15分钟，然后倒置放入培养箱过夜培养倒置培养原因：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸汽的形式蒸发，倒置培养皿则会使水蒸汽凝结成水滴留在盖上。如果正方，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。大肠杆菌感受态的制备及转化感受态：细菌处于容易吸收外源的状态叫感受态。转化：是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。一、

3、制备：步骤从大肠杆菌a的培养平板上挑取一个单菌落接于液体培养基的试管中，7振荡培养过夜。以1的%接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中C振荡培养将菌液转移到离心管中，冰上放置回收细胞以便培养液流尽c悬浮沉淀0离心倒出培养液，将管倒置用冰冷的立即放在冰上保温C,用冰冷的0.1分装细胞，每，离心，回收细胞悬浮细胞（务必放冰上）M一份。此细胞为感受态细胞。、转化：步骤：在|J新鲜配制的感受态细胞中加入质粒|JWn混匀同时做以下对照管（受体菌对照：JI感受态细菌JI无菌水质粒对照：Ji溶液ja质粒）冰上放置将管放到I循环水浴热冲击取出，迅速冰浴每管加J液体培养基，C慢摇复苏取J已转化的感受态细胞或对

4、照样品，各分别涂在含有或不含有氨苄青霉素的培养皿中待吸干菌液后，倒置培养皿，于C培养过夜次日在含氨苄青霉素的培养皿上长的菌落即为含有质粒的大肠杆菌（即转化成功）质粒的提取溶液：TOC o 1-5 h z溶液I:葡萄糖、（）、溶液II:、溶液III：醋酸钾（）：、冰醋酸：5:步骤：在锥形瓶中加入液体培养基，向培养基中加入氨苄青霉素挑取单菌落接种于锥形瓶中，培养过夜次日，取培养物于管中，离心吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥将细菌沉淀悬浮于溶液I中，充分混匀，室温放置加溶液11（新鲜配制），盖紧管皿，轻柔混匀混合物，冰上放置加入预冷的溶液III,盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置离心，将上清转移至另

5、一管向上清中加入等体积的氯仿（去蛋白），反复混匀，离心，将上清转移至另一管向上清中加入倍体积的无水乙醇，混匀后，室温放置，离心，倒去上清液，把管倒扣在吸水纸上，吸干液体用乙醇洗涤质粒沉淀，震荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥加入缓冲液或无菌水，溶解，C保存3溶注意事项：在混匀时，不能剧烈震荡，动作一定要轻柔。氯仿抽提完，转移上清时，一定不要吸到中间蛋白层，宁少勿多。质粒的鉴定琼脂糖凝胶电泳检测步骤：1制溶备琼脂糖凝胶电泳：在锥形瓶中加入X缓冲液，称取琼脂糖放入锥形瓶中，置微波炉中，中火加热至完全熔化，取出摇匀，则为的琼脂糖凝胶。待琼脂糖凝胶冷却至。时，加入溴化乙锭（）3.取有机玻璃内槽

6、，洗净晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好，一定要封严，放好梳子将冷到0琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）目视凝胶凝固后，再过半个小时，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内，加入X缓冲液至电泳槽中，加至液面刚没过胶板约加样：将（染料）与被测混合，用移液枪将样品加入到梳子孔中，对照滴在最下面的孔电泳：接通电源，调节电压、电流8加观察结果：在将胶板放在紫外灯下，连接电脑，拍照。TOC o 1-5 h z氨苄青霉素（）（）溶解氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至m分装成小份于C贮存。常以的终浓度添加于生长培养基。羧苄青霉素（）（）溶解羧苄

7、青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至。分装成小份于C贮存。常以的终浓度添加于生长培养基。甲氧西林（）（）溶解甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至。分装成小份于C贮存。常以终浓度与氨苄青霉素一起添加于生长培养基。卡那霉素（）（）溶解卡那霉素于足量的水中，最后定容至。分装成小份于C贮存。常以的终浓度添加于生长培养基。氯霉素（）（）溶解氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至m分装成小份于C贮存。常以的终浓度添加于生长培养基。链霉素（）（）溶解链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至。分装成小份于C贮存。常以的终浓度添加于生长培养基。萘啶酮酸（中alidix）i（c5magc）/imdl溶解萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定