霉菌试验简明教程-实验部分

1、霉菌试验培训教程空军装备环境与可靠性试验中心霉菌试验培训教程空军装备环境与可靠性试验中心霉菌试验培训教程空军装备环境与可靠性试验中心 实验一 霉菌试验室常用的器皿微生物学实验室所用的玻璃皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、 洗涤和包装方法均有一定的要求。一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧 灼而不破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方 法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。试管微生物学实验所用的玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样在塞棉花塞时，管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口

2、，不然， 微生物容易从棉花与管口进入试管而造成污染。棉塞可用棉花塞、试管帽，橡胶塞等。试管的大小常选用中试管(约 13 15 100 150mm)。玻璃吸管(又称移液管)霉菌试验室一般要准备1、 5、 10ml 的刻度玻璃吸管，与化学实验室所用的不同，其刻度指示的容量往往包括管尖的液体体积，亦即使用时要注意将所吸液体吹尽，故有时称为“吹出”吸培养皿常用的培养皿，皿底直径90mm，高15mm。培养皿一般为玻璃皿盖。在培养皿内倒入适量培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种以及微生物计数等。三角烧瓶与烧杯三角烧瓶有100、 250、 500、 1000ml 等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和摇

3、瓶发酵等。常的烧杯有50、 100、 250、 500、 1000ml 等，用来配制培养基和药品。载玻片与盖玻片普通载玻片大小为75 25mm， 用于微生物涂片、染色， 作形态观察等。盖玻片为18 18mm。双层瓶由内外两个玻璃瓶组成，内层小锥形瓶盛放香柏油，供油镜头观察微生物时使用，外层瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。滴瓶 用来装各种染料、生理盐水等。接种工具接种工具有接种环、接种针、接种钩、接种铲、玻璃涂布器等。接种环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复烧灼，又易冷却。容量瓶常见的容量瓶有100、 250、 500、 1000ml 等不同的大小，常用来定容溶液体积。二

4、、玻璃器皿的清洗方法清洁的玻璃器皿是实验室得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。新玻璃器皿的洗涤方法新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2%的盐酸或洗涤液。浸泡后用自来水冲洗干净。使用过的玻璃器皿的洗涤方法(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。玻璃器皿经洗涤后，内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全冼净，若挂有水珠，则还需要洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗

5、。装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。长有霉菌的培养物先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。(2)玻璃吸管吸过菌体或孢子悬浮液的玻璃吸管使用后应立即投入盛有2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭消毒液或巴斯消毒液的量筒或标本瓶内，24小时方可取出冲洗。吸取其它溶液的吸管应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，以免干燥后难以洗净。吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。(3)载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5 10 分钟，用软布或脱脂棉花擦轼，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液

6、中浸泡0.5 2小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95%酒精中保存备用。使用时在火焰上烧去酒精。用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。检查过活菌的载玻片和盖玻片应先用2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭消毒液浸泡24小时，然后按上述方法洗涤与保存。洗涤液的配制与使用( 1)洗涤液的配制洗涤液分浓溶液与稀溶液两种，配方如下：（工业用（工业用）50g150ml800ml（ 工业用 ） 50g850ml100ml自来水浓硫酸 ( 工业用 ) 稀溶液：重铬酸钠或重铬酸钾自来水浓硫酸 ( 工业用 )配法都是将重铬酸钠或重铬酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温，使溶解，冷却后

7、徐徐加入浓硫酸，边加边搅动。配好后洗涤液呈棕红色或桔红色，长期使用后变成墨绿色即为失效。贮存于有盖容器内。使用时注意安全。三、玻璃器皿的包装略。实验二 消毒与灭菌灭菌与消毒是有区别的。灭菌是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。消毒一般是指消 灭病原菌和有害微生物的营养体。灭菌与消毒的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用 化学药品等方法。在霉菌试验过程中有许多步骤是要求无菌操作的，因此灭菌是整个试验中的重要环节。灭菌 的彻底与否将直接影响试验结果的准确程度，能否确切地反映霉菌试验的真实情况，也是关系到 试验结果的可靠性。常用灭菌方法有加热法灭菌、紫外线灭菌、化学药品灭菌。一、加热灭菌干热

8、灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。通常说的干热灭菌是在电烘箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌，在热空气160170下保温2 小时进行灭菌。高压蒸气灭菌高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。高压湿热蒸汽灭菌有较大的渗透力，容易

9、使蛋白质凝固和变性，是一种可靠的灭菌方法。它能杀死一切微生物。其特点是杀菌可靠、经济、快速、无臭、无味和无毒性，能达到安全有效。灭菌时，先取出灭菌桶，再向外层锅内加入适量的清水（水没过电阻丝），放回灭菌桶，并将待灭菌的器皿以及被霉菌污染的物品用纸（牛皮纸、旧报纸）包装好装入高压灭菌锅内，注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。打开电源加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷气完全排尽（蒸汽从气门有力的冲击）关闭排气阀，随后压力上升,

10、直到指针到0.105Mpa， 锅内温度为121.3为止，控制电源电压，维持压力并保持20 30min。灭菌时间即将结束时，停止加热，让灭菌锅自行降压，等压力锅指针回到接近零时即可开启放气阀，使锅内蒸汽排空，然后揭开盖至1/3 左右，利用余热烘干试管塞，再取出已灭菌的物品，如果压力未降到会位，切勿打开盖子，以免压力容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。将取出的灭菌培养基放入291恒温培养箱内培养24小时，经检查无杂菌生长，即可待用。蒸汽压力与蒸汽温度换算的关系如表1 所示。表 1 蒸汽压力与蒸汽温度换算的关系蒸汽压力 大气压压力表读数蒸汽温度千克 / 厘米2

11、 (Kg/cm 2)磅 / 英寸2（ 1b/in2 ）1.000.000.00100.01.250.253.75107.01.500.507.50112.01.750.7511.25115.02.001.0015.00121.02.501.5022.50128.03.002.0030.00134.5紫外线灭菌是利用紫外线灯照射进行的，波长为200 300nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以 260nm 的杀菌力最强。紫外线灯距照射物以不超过1.2米为宜，为了加强灭菌效果，在开紫外线灯之前，可先在无菌室内喷洒2% 5%的来苏儿溶液，照射时间应在0.5小时 2小时。紫外线对人体有害，不能直视开着紫外

12、线灯。化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。即利用化学药剂进行灭菌。试验室桌面、用具以及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒灭菌。常用的2%来苏尔、0.25%新洁尔灭、1%升汞、3 5%的甲醛溶液、75%酒精溶液等。常用化学杀菌剂的浓度及应用范围见表2：表 2 常用化学杀菌剂的浓度及应用范围类别杀菌剂名称常用浓度应用范围醇类乙醇50-70%皮肤及器械消毒酸类乳酸0.33-1mol/L空气消毒（喷雾或熏蒸）食醋33 5ml/m熏蒸消毒空气，可预防流感病毒碱类石灰水1-3%地面消毒酚类石炭酸5%空气消毒（喷雾）来苏尔2-5%空气消毒、皮肤消毒醛类福尔马林40% 溶 液接种

13、室、接种箱或接种房熏蒸消2-6ml/m 3毒重金属离子升汞0.1%植物组织（如根瘤）表面消毒硝酸银0.1-1%皮肤消毒氧化剂高锰酸钾0.1-3%皮肤、水果、茶杯消毒过氧化氢3%清洗伤口氯气0.2-1ppm饮用水清洁消毒漂白粉1-5%洗刷培养基、饮用及粪便消毒去污剂新洁尔灭水稀释20 倍皮肤、不能遇热的器皿消毒染料结晶紫2-4%外用紫药水，浅创伤口消毒金属螯合剂8- 羟 基 奎 啉 硫酸盐0.1-0.2%外用、清洗消毒甲醛熏蒸：福尔马林（40%甲醛）10ml 加高锰酸钾5g/m3密封熏蒸6h 以上，福尔马林12.5ml/m3加入等量的水加热蒸发，熏蒸6h 以上。 实验三 培养基的制备和灭菌培养基

14、是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖，并累积新陈代谢产物的混合养料。它通常 含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大类成分。根据微生物种类和试验目的不同，培养基的种类和配制方法也不一样。（ 如按营养成分分：天然培养基（ PDA） 和合成培养基（ Czapek） ； 按物理状态分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基；等等。霉菌试验常用的培养基有：查氏培养基（Czapek） 、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA） 、滤纸 培养基、真菌培养基等。1培养基成分的配比1）查氏（Czapek）培养基配制：1.0g0.5g30.0 g1000mlNaNO31.0g0.5g30.0 g1000mlKCl0

15、.5gMgSO4FeSO40.01g蔗糖琼脂15 20 g水pH自然1.05 kg/cm2（ 15磅 /英寸）， 121.3灭菌20分钟。2）马铃薯培养基配制：马铃薯200.0 g蔗糖 （或葡萄糖）20.0 g琼脂15.0 20.0 g水1000mlpH7.2马铃薯去皮，切成1cm3的小块，煮沸半小时后，用4 层纱布过滤，再加糖及琼脂，加热溶化后补足水分至1000ml。 1.05 kg/cm2（ 15磅 /英寸）， 121.3灭菌20分钟。（ 3）滤纸培养基（NH（ 3）滤纸培养基（NH4） 2SO41.0gNaCl0.5g琼脂15 20gK2HPO4MgSO4 7H2O 水1.0g0.7g

16、1000ml将培养基与滤纸条在1.05 kg/cm 2（ 15磅 /英寸） ， 121.3条件下分别灭菌20分钟。（ 4）无机盐培养基(NH4)2NO31.5gK2HPO41.0gKCl0.25gMgSO4 7H2O0.5gFeSO40.002琼脂15 20g水1000mlpH自然pH滤纸条 （ pH滤纸条 （ 摆斜面时加入）6cm 1cm将培养基在1.05 kg/cm2（ 15磅 /英寸）， 121.3条件下灭菌20分钟。若培养球毛壳霉则在斜面上加滤纸条（6cm 1cm）， 将培养基与滤纸条在1.05 kg/cm2（ 15磅 /英寸）， 121.3条件下分别灭菌 20 分钟，在摆斜面前加入到

17、试管斜面上。2器皿天平（精确度为0.001g） ， 2000ml 搪瓷锅，电炉或电磁炉，石棉网，500ml 烧杯， 300ml 锥形瓶， 1000ml量筒，漏斗，15 150mm试管，玻璃棒，1ml、 10ml 吸管，滴管，pH 试纸，牛角匙，洁净纱布，油皮纸，棉花，橡皮筋等。3制备方法按不同培养基成分配比称量各种药品，用量筒量取700ml 蒸馏水于搪瓷锅中，加热至沸腾后加入琼脂使其溶解，再依次加入其它各成分，用玻璃棒搅拌溶解后，用1mol/L HCL 调节 pH 至7.2。趁热分装在试管内或三角瓶内（分装装置如图1 所示） ，分装后的容量不超过其容量的1/5，三角瓶不超过其容量的1/2。塞好

18、棉塞（棉塞的制作方法如图2 所示） ，用防潮纸包好，试管每7支一捆。准备灭菌。4灭菌各培养基均可在1.05 kg/cm2（ 15 磅 /英寸2） ， 121.3条件下分别灭菌20分钟。图 1 三类不同的分装装置5. 摆斜面灭菌后待培养基冷却至50 60时，将试管口一端搁在高度适中的木棍上，调整搁置的斜度，使斜面长度不超过试管总长度的1/2。 如图 3 所示。 对于滤纸培养基的灭菌，培养基与滤纸先分别灭菌，之后再在超净工作台内酒精灯火焰旁边分别用无菌镊子将无菌滤纸夹入到试验斜面上，再摆斜面。培养基凝固后放置在低温冰箱内保存待用。3 摆斜面2 棉塞的制作方法6. 3 摆斜面2 棉塞的制作方法6.

19、倒平板灭菌的培养基溶化后，待冷却至5560时，便可将培养基倒入已灭菌的平皿内。方法是右手持盛培养基的三角瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出， 如果三角瓶内的培养基一次可用完，则三角瓶塞不必夹在手指中。三角瓶在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住瓶塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。将平板放在室温2-3 天，或 37培养24小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。目前已配方好的各种培养基在

20、许多生物化学试剂公司均能购买到，按使用说明按比例进行配比即可，方便快捷。实验四 接种与培养1斜面接种(1)用记号笔或标签将接种的菌名、接种日期和接种者写在试管壁上或写在标签上贴于离试管口约 3cm 处的培养基斜面的正上方。(2)点燃酒精灯，并将火焰调至适中.(3)将菌种试管及待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指和无名指握在左手中，并将中指夹在两试管之间，使斜面向上，成水平位置，在火焰边用右手松动试管塞，以利于接种时拔出。(4)右手握在接种针(环)的胶木柄上，将接种针(环)通过火焰的外焰进行灼烧进行灭菌，在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞，将其拔出，并迅速烧灼管口。(5)

21、将烧灼的接种针(环)伸入菌种试管内，先使接种针(环)轻触试验管内壁或未生长菌的培养基，达到冷却的目的，然后挑取少许菌苔。将接种针(环)退出菌种试管，迅速伸入接种斜面试管，若用接种环则在斜面上自试验管底部向上端轻轻地划直线，勿将培养基划破，也不要使接种环接触管壁或管口，若用接种针则将菌苔轻轻点击在培养基内。（ 6）接种环退出斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上。将接种针（环）逐渐接近火焰，再烧灼。如果接种针（环）上沾的菌体较多时接种针（环）在火焰边烤干，然后烧 灼，以免未烧死的菌种飞溅污染环境。2平板接种（1）用记号笔或标签将接种的菌名、接种日期和接种者写在培养皿底部上或写在标签上贴

22、于培养皿底部。（2）点燃酒精灯，并将火焰调至适中。（3）将菌种试管及待接种的平板有序放置在无菌操作台内，用大拇指和食指、中指和无名指握在左手中，斜面向上，成水平位置，在火焰边用右手松动试管塞，以利于接种时拔出。（4）右手握在接种针（环）的胶木柄上，将接种针（环）通过火焰的外焰进行灼烧灭菌，在火焰边用右手的手掌边缘和小指夹持棉塞，将其拔出，并迅速烧灼管口。（5）将烧灼的接种针（环）伸入菌种试管内，先使接种针（环）轻触试验管内壁或未生长菌的培养基，达到冷却的目的，然后挑取少许菌苔。将接种针（环）退出菌种试管，用火焰烧管口后在火焰边将试管塞塞上，放回原位。右手握住接种针（环）放在火焰附近，切勿接近火

23、焰或靠得 太近。（ 6）左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，将接种针（环）迅速伸入接种平板，若用接种环则在平板上由内向外轻轻地划之字形线，勿将培养基划破，也不要使接种环接触平皿上盖或平皿壁，若用接种针则将菌苔轻轻点击在平板中间位置，合上皿盖，将平板放置在桌面上。将接种针 （环） 逐渐接近火焰，再烧灼。 如果接种针（环） 上沾的菌体较多时接种针（环）在火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅污染环境。以上两种接种方法均为无菌操作。将已接种的斜面或平板培养基放置在2830培养箱内培养。实验五 显微镜的使用一 . 显微镜的基本构造显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置镜座、镜筒、转换器、载

24、物台、调焦装置等组成。光学系统物镜 物镜安装在镜筒下端的转换器上。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如 NA 0.30； 10； 160/0.17； 16mm。其中“NA 0.30”表示数值孔径，“10”表示放大倍数，“ 160/0.17”分别表示镜筒长度和所需的盖玻片厚度(mm)， 16mm表示焦距。目镜装于镜筒上端，由两块透镜组成。目镜上一般标有10、 15等放大倍数，可根据需要选用。 一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500 700 倍， 最大也不能超过1000 倍。光源显微镜的光源通常安

25、装在显微镜底座内，通过按钮开关来控制。油镜油镜(1.8mm,95 100)通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI( oil immersion) ”字样表示。使用油镜时镜头离标本十分近，需要特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径。因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度的半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘，可用下列公

26、式表示：NA=n sin 式中NA=数值孔径n=介质折射率 =最大入射角的半数，即镜口角的半数。二 . 显微镜的操作：观察前的准备显微镜应放大一个相对固定的位置镜座距实验台边沿约3 4cm。 镜检者姿势端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳。打开电源开关，调节好亮度。低倍镜观察检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。将制好的标本放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物镜正下方，转动粗调节器，使物镜降至距标本约0.5cm处，由目镜观察。用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止，然后

27、移动标本，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。高倍镜观察将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察，并仔细调节光线，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。油镜观察用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜

28、头。从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。将各部分还原，将接物镜转成八字形，再向下旋。实验六 霉菌形态的观察一基本原理霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而而孢子很容易飞散，所以制作标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片特点是：（ a）细胞不变形；（ b）具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；（ c）溶液

29、本身呈蓝色，有一定染色效果。玻璃纸透析培养法是利用玻璃纸的半透明特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。此法能得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态。二 .器材：曲霉、青霉。乳酸石炭酸棉蓝染色液，查氏培养基，无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖刀，玻璃纸等。三操作步骤.一般观察法于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。.玻璃纸透析培养观察法（ 1）向霉菌斜面试管

30、中加入5ml 无菌水，洗下孢子，制成孢子悬浮液。（ 2）用无菌镊子将已灭菌的、直径与培养皿相同的圆形玻璃纸覆盖于查氏培养基平板上。（ 3）用1ml 无菌吸管吸取0.2ml 孢子悬浮液于上述玻璃纸平板上，并用无菌玻璃刮棒涂抹均匀。（ 4）置于28培养箱内培养48h 后，取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀取一小片玻璃纸置载玻片上，用显微镜观察。实验七 显微镜下霉菌孢子的计数目的：学会并掌握利用血球计数板测定孢子数的原理和方法。原理：计算单位体积内微生物细胞数目的方法很多，有平皿培养法、光密度法、血球计数法0.1mm3） ，所以可将在显微镜下计得的菌数或孢子数换算成单位体积试

31、 TOC o 1-5 h z 血球计数板是一块特制的载玻片，中部有 H 形的沟槽将中部分成上下两个计数室。如图4 6计数室方格的边长为3mm， 每个方格分成9个大方格,正中央的大方格被分成16个中方格，25 个小方格，这样正中央的大方格总共分成400 个小方格，每个小方格的边长1/20mm，因此，每个小方格的体积为1/4000mm3（计数室的高度为0.1mm）。所以，每一立方4000。由此得到如下公式：每一毫升的菌数（个）=（平/25）稀释倍数40001000。材料：.菌种：霉菌.血球计数板，试管、无菌水、无菌滴管，吸水纸，擦镜纸，振荡器。方法1.制备菌悬液：向菌种斜面加信10ml 无菌水，用

32、无菌接种环刮下菌苔后，在振荡器上充分振1 2个细胞为宜。2加菌液：先用擦镜纸将血球计数室擦净，然后用无菌滴管取少许菌液分别滴入上、下两个3.计数：先在显微镜下找到计数室，然后在正中央的大方格中沿对角线取9 个中方格，分别图 5 血球计数板构造（ 放大后的方格网, 方格网的中央为计数室）6 计数室实验八 菌种的保藏菌种的保藏方法有多种，根据实验室具体条件与需要选择可行的保藏方法。1斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待霉菌充分生长后，通常是霉菌培养14d 形成孢子后，棉塞部分用油皮纸包扎好，移至28的冰箱中保藏。保藏时间一般为2 4 个月，移种一次。此法为实验室和工厂菌种室常用的保

33、藏法，优点是操作简单，使用方便，不需要特殊设备，能随时检查所保藏法的菌株是否死亡、变异与污染等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。2液体石蜡保藏法将液体石蜡分装于三角瓶内，塞上棉塞，并用牛皮约包扎，1.05kg/cm2， 121.3灭菌30min，然后放在40温箱中，使水汽蒸发掉，如此反复灭菌三次，备用。将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到最健壮的菌种或孢子。用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm 为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室

34、温下保存。此法实用而效果好。霉菌可保藏2 年以上不死。此法的优点制作简单，不需要特殊设备，不需要经常接种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。3滤纸保藏法将滤纸剪成0.5cm 1.2cm的小条，装入0.6cm 8cm的安瓿管中，每管1-2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2， 121.3灭菌30min。将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使其充分生长。取灭菌脱脂牛乳1 2ml 滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌

35、悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。将安瓿管放入有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。将棉花塞入管内，用火焰将安瓿管从中间熔封，保存于低温下。需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。采用此法保菌种保藏时间在2 年左右，某些丝状真菌可保藏14年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。4沙土保藏法取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30min，以去除其中之的有机质。倒去酸水，用自来水冲洗至中性。烘干，用40 目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。另

36、取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干，碾碎，通过100 目筛子过筛，以去除粗颗粒。按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10mm 100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。抽样进行无菌检查，每10 支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37培养48h，若仍有杂菌，则需要全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。选择培养成熟的（一般孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。于每支沙土管中加入给0.5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜

37、）孢子悬液，以接种针拌匀。放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12h 内抽干。每 10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土有问题，尚须进一步抽样检查。若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。此法多用于产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2 年左右，但应用于营养细胞效果不佳。5液氮冷冻保藏法准备安瓿管用于液氮保

38、藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75mm 10mm的， 或能容 1.2mm液体的。加保护剂与灭菌保存细菌、酵母或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2， 121.3灭菌15min。 若作保存霉菌菌丝体用则需要在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1.05kg/cm2， 121.3灭菌15min。接入菌种将菌种用10%甘油蒸馏水溶液制成菌悬液装入已灭菌的安瓿管，霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块

39、，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。冻结 再将已封口的安瓿管以每分钟下降1的慢速冻结至-30。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。保藏 经冻结至-30的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氨保藏器内的气相为-150，液态氮内为-196。恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入3840的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞

40、均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。6冷冻干燥保藏法此保藏方法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及芽孢菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。这里不再介绍。实验九 霉菌试验流程及操作目录一 .试验前的准备.制备培养基.接种、培养.试验样品的交接及外观检查录.试验设备灭菌及调试.试验所需用具及试验室灭菌.制备无机盐溶液和营养液.准备对照样品.安装试验样品及对照样品.样品预处理.制备混合孢子悬浮液.孢子记数.孢子活力检验.样品接种.试验运行.试验后样品检

41、查.试验结果与长霉等级评定.出具试验报告并归档.制备培养基霉菌试验中常用的培养基有：查氏培养基（Ca） 、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA） 。菌种保存时查氏培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）应交替使用,以防止菌种退化。培养基的种类、成分的配比，所用的器皿，制备方法，灭菌，摆斜面，倒平板同实验三。.接种及菌种培养试验菌种来源必须是经由国家认可的菌种保藏或研究机构提供的纯菌种。菌种名称和菌种编号应与试验标准有关条款规定的菌种一致。GJB150 10 83 的试验菌种如黑曲霉3.3928 Aspergillus niger 黄曲霉3.3950 Aspergillus flavus杂色曲霉3.3

42、885 Aspergillus versicolor 绳状青霉3.3875 Penicillium funiculosum球毛壳霉3.4254 Chaetomium globosum接种前，先检查试验用菌种的纯度，如发现菌种不纯或被污染应及时更换。接种时通常应准备二套，一套用作试验另一套用作备份或保藏。接种的方法和菌种培养同实验四。.试验样品的交接及外观检查记录试验协议书签订后进行试验样品的交接。仔细记录试验样品的初始状态，逐一详细地进行外观检查并作记录，必要时进行拍照。若有关技术文件规定在试验前需要对试验样品进行处理时，在试验 72h 前按要求进行处理。若试验样品需要进行性能检测时，应在试验

43、前检测完毕，并作好检测记录。.试验设备灭菌及调试试验前先对试验设备包括试验箱、储水箱进行冲洗，然后更换湿球纱布并给湿球纱布储水槽加蒸馏水至标线位置，给储水箱加满蒸馏水等工作，关试验箱门后用臭氧或紫外线灯灭菌。根据试验条件调试试验设备24h， 当确定试验设备能力达到霉菌试验标准规定的试验条件后，关机待用。.试验所需用具及试验室的灭菌试验所需用具一般包括150ml 磨口锥形瓶5个 （瓶中含有45ml 蒸馏水和50 75粒直径为5mm的玻璃球）、直径 5cm 玻璃漏斗5 个、 50ml 量筒 2 个、玻璃棒数根、离心试管30 根 （分成6 捆包扎 ）、试管塞30个、蒸馏水1000ml、 20ml 磨口试管5根、移液管5支、喉头喷雾器1 个、 4层过滤纱布 5 块，数块清洁纱布、培养基平板5 个、 150ml 容量瓶 1 个等。准备好后依次进行高压湿热灭菌。试验室和操作工作台用臭气发生器或紫外线灯进行灭菌。.制备无机盐溶液和营养液无机盐溶液和营养液按如下成份进行称量，再溶解到无菌水中，充分溶解后备用。 TOC o 1-5 h z 无机盐成分:磷酸二氢钾（KH2PO4）0.7g磷酸氢二钾（K2HPO4）0.7g硫酸镁 （MgSO4 7H2O）0.7