RT-PCR的实验原理与操作步骤

1、提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引 物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基 因或检测基因表达。RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转 录产物、获取目的基 因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。反转录酶的选择Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相 对较弱。最适作用温度为37C。禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适 作用温度为42C。Thermus

2、thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶： 在Mn2存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。MML V反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScrip t和SuperScrip til。 此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结 构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。合成cDNA引物的选择1随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其 全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此 种 方法时，体系中所有RNA分子全部充当了

3、 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增 过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3 端Poly(A)尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。由于Poly(A)RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量 和复杂性方面均要小。特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为 引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3端最靠 近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异

4、的PCR扩 增。生物科研 HYPERLINK 二、实验耗材与试剂RNA 提取target二_blank RNA 取试剂第一链cDNA合成试剂盒dNTPmix:含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mMTaq DNA聚合酶三、实验步骤（一）总RNA的提取见相关内容。（二）cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不 一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。在0.5ml微量离心管中，加入总R

5、NA 1-5 口 g，补充适量的DEPC H O使总体积2达15 1。在管中加10口M 0ligo（dT）12-18 1ul，轻轻混匀、离心。70C加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物： TOC o 1-5 h z 10XPCR buffer2口125mM MgCl2口1210mM dNTPmix1口10.1M DTT2口1轻轻混匀，离心42C孵育2-5min。加入 SuperscriptII1口1，在 42C水浴中孵育 50min。于70C加热15min以终止反应。将管插入冰中，加入RNase H 1口1 , 37C孵育20min，降解残留的RNA

6、。-20C 保存备用。（三）PCR扩增取0.5m1 PCR管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA2 口1 TOC o 1-5 h z dNTP（2mM）4口l1OXPCR buffer5口lTaq 酶（2u/口l）1ul加入适量的ddH,使总体积达50ulo轻轻混匀，离心。2设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果 的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引 物，同时扩增内参DNA，作为对照。电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。四、注意事项在实验过程中

7、要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程 中，注意避免mRNA断裂。为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。2.内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷 酸脱氢酶）、B-Actin（B-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误 差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二 级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循 环数，均应通过单独实验来确定。防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA样品，在可能的情况下，将PCR引物 置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。所有的玻璃器皿均应在使用前于180C的高温下干烤6hr或更长时间。塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被 氯仿腐蚀，故不能使用）。有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡 在3% H2O2室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37C处理12h