开放性实验-蚕豆（Vicia faba）根尖细胞微核监测技术实验原理及步骤

1、实验十二：开放性实验蚕豆（Vicia faba）根尖细胞微核监测技术【课前预习】1什么是微核？它是如何产生的？2微核监测技术的应用？【目的要求】1在教师的指导下，选题，学习实验方案的设计（包括所选用材料、实验技术、方法）；实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。四人一组，自由组合， 分工协作。实验过程监控，实验结果检查。2了解微核测试的原理及其在实际生活与工作中的应用范围及意义；学习蚕豆根尖的微核测试技术。【基本原理】微核简称（MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外、大小应在主核13 以下。微核的折光率及细

2、胞化学反应性质和主核一样。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。所以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。且有研究显示以植

3、物进行微核测试与以动物进行的一致率可达99%以上。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面 利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。利用蚕豆初生根尖细胞微核（micronucleus, MN)技术监侧水环境，系国内外的一种新的生物学测试系统。本检测法的立论根据是：动物、植物和人的外周血淋巴细胞等受到致突变物处理后都有增加微核的趋势，并且它们的定性反应一致性可达99以上。此项技术简便、易行、费用低，适用于河流湖泊、水库、池塘以及各种工矿企业废水、生活污水中所含致突变物的监测。

4、【实验用品】1实验材料松滋青皮豆（普通蚕豆代替） 蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA 含量多，因而对诱变物反应敏感。松滋青皮豆是华中师范大学生命科学学院遗传学教研室从蚕豆不同品种中筛选出来的微核试验敏感品种。本品种栽培繁殖时要注意不和其它蚕豆品种种在一起，不喷农药，以保持该品种较低的本底微核值。如果只需对水环境的监测起警报系统作用，也可用其它当地蚕豆品种，但要注意设好对照组。种子成熟晒干后，为保证其发芽率，要贮于干燥器内，或用牛皮纸袋装好放人4冰箱内保存备用。2器材 显微镜、温箱、恒温水浴锅、冰箱、手掀计数器、解剖盘（或铝制饭盒）、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、试剂瓶、烧杯等显微压片实验用具。3药

5、品1）5 mol/L HC1。2）卡诺氏液：无水乙醇（或95乙醉)3 份加冰醋酸1 份配成。固定根尖时随用随配。3）席夫氏（Schiff）试剂：称0. 5 g 碱性品红（Fuchsin Basic)加蒸馏水100 ml 置三角烧瓶中煮沸5 min，并不断搅拌使之溶解。冷却到58时过滤于深棕色试剂瓶中，待滤液冷至25 时再加人10 ml 1 mol/lHCl 和1 g 偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾（Na2S2O5 或K2S2O5）充分振荡使其溶解。塞紧瓶口，用黑纸包好，置于暗处至少24 h，检查染色液如果是透明无色即可使用。此染色液在4冰箱中可保存6个月左右，如出现沉淀就不能再用。4）SO2 洗涤

6、液贮存液：10% Na2S2O5（或K2S2O5)溶液，1 mol/L HCI使用液：取上述10% Na2S2O5（或K2S2O5)溶液 5 m，加1mol/l HCl 5 ml，再加蒸馏水100 ml 配成，现用现配。【方法步骤】1蚕豆浸种催芽1) 浸种 将当年或前一年的蚕豆种子按需要量放人盛有自来水（或蒸馏水）的烧杯中，置25 的温箱内浸泡24 h36 h，此期间至少换水2 次，换用的水最好事先置于 25 温箱中预温。（如室温超过25，即可在室温下进行浸种催芽。）2) 催芽 待种子吸胀后，用纱布松松包裹置解剖盘（或铝盒）内，保持湿度，在25 的温箱中催芽12 h24 h，待种子初生根露出2

7、 mm3 mm 时，选取发芽良好的种子，放人铺有薄层湿脱脂棉的解剖盘（或铝盒）内，仍置人25 的温箱中继续催芽，注意保持湿度。再经36 h48 h，种子大部分初生根长至1. 5 cm2 cm，根毛发育良好，这时就可用来作为监侧水源样品或检测药物溶液诱变效应之用。2被监测液处理根尖1) 每一处理选取6 粒8 粒初生根尖生长良好、根长较一致的种子，放人盛有被测液的培养皿中，让被测液浸泡住根尖即可。用自来水（或蒸馏水）处理作对照，方法相同。2) 处理时间4 h6 h，视实验要求和被测液的浓度等情况而定。3根尖细胞修复培养1) 将处理后的种子，用自来水（或蒸馏水）浸洗3 次，每次2 min3 min。

8、2) 洗净后的种子再放人新铺好的湿脱脂棉的解剖盘（或铝盒）内，按前述培养条件使根尖细胞修复22 h24 h，亦可在培养皿中用自来水浸住根尖修复培养。4固定根尖细胞1) 将修复培养后的豆子，从根尖顶端切下1 cm 长的幼根放人空青霉素瓶中，加卡诺氏固定液固定24 h48 h。2) 固定后的幼根如不及时制片，可换人70的乙醇中，置4 冰箱内保存备用。5孚尔根（Feulgen）染色1）固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗2 次，每次5 min。2) 吸净蒸馏水，再加人5 mol/L HCl 将幼根泡住，连瓶放人28水浴锅中水解幼根25 min 左右，视根软化的程度可适当增减时间，当幼根被软化即可。

9、3) 用蒸馏水浸洗幼根2 次，每次5min。4) 在暗室或遮光的条件下加席夫（Schiff）试剂，每瓶用量以淹住幼根液面高出2 mm 为好。在遮光条件下染色过夜（约12h）。5) 除去染液，用SO2 洗涤液浸洗幼根2 次，每次5 min,6）用蒸馏水浸洗一次，5 min。7) 将幼根放人新换的蒸馏水中，置4 冰箱内保存，可供随时制片之用。6制片1) 将幼根放在擦净的载玻片上，用解剖针截下1 mm 左右的根尖。2) 滴上少许蒸馏水或45的醋酸溶液，用解剖针将根尖捣碎。3) 加盖一清洁的盖玻片，注意不要有气泡。4）在盖玻片上加一小块滤纸，用左手食指压住盖玻片一角，右手用铅笔上的橡皮头一端敲打压片，

10、切勿让盖玻片与载玻片之间滑动。7镜检及微核识别标准将制片先置低倍显微镜下找到分生组织区细胞分散均匀、膨大、分裂相较多的部位，再转到高倍镜（物镜40X）下进行观察。附：微核识别的标准：1) 凡是主核大小的1/3 以下，并与主核分离的小核； 2）小核着色与主核相当或稍浅；3) 小核形态可为圆形、椭圆形、不规则形等。凡符合以上三条的小核就是微核。每一处理观察3 个5 个根尖，每个根尖计数1 000 个细胞中的微核数。【实验结果】将微核观察记载表上所得数据，按如下步骤进行统计学处理。1. 各测试样品（包括对照组）微核千分率（MN ）的计算为：某测试样点（或对照）观察到的MN 数MN X 1 000某测

11、试样点（或对照）观察的细胞数2. 如果被监测的样品不多，可直接用各样品MN 千分率平均值与对照比较（t 检验），从差异的显著性判断水质污染与否。3. 如被监测的样品较多，可先用方差分析（F 检验）看各采样点（或各样品）所出现的MN 千分率平均值和对照组差异的显著性。如差异显著，还可进行各采样点微核差异显著性的多重比较，看被检测样品的MN 千分率平均值差异显著性的分组情况，以归纳划分这些不同采样点不同级别的污染程度。4如采用已筛选出的、专门隔离栽培、无污染的松滋青皮豆作实验材料，并按规范标准实验条件（其对照本底MN为10以下），其监测样品污染程度的划分，可不用上述（2)、（3)两种统计处理方法，而直接采用如下标准：1) MN 在10 以下为基本无污染；10 18 区间为轻度污染；1