IPTG诱导蛋白质表达实验步骤总结_第1页
IPTG诱导蛋白质表达实验步骤总结_第2页
IPTG诱导蛋白质表达实验步骤总结_第3页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

1、实验总结IPTG 诱导表达蛋白15-11-3配固体培养基和液体培养基，灭菌。配Binding Buffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液 pH 值至 7.4，定容后转移到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤（滤除溶液 内的气泡和不溶性杂质）。倒板：（5 个灭菌的培养皿）微波加热溶解固体培养基（每次加热30s,待有沸腾的迹象时， 减少加热的时间）。超净台操作，以1 1000的比例（1ml培养基1讥抗生素）向 培养基中加入Kan+抗生素（50mg/ml），摇匀。倒板。培养皿放置在超净台上凝固，凝固后将培养皿倒着放入培养箱 中。15-11-4热转化：（将质粒导入大肠杆菌中）提前将大肠杆菌（冰

2、上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上 操作）后冰上放置 30min。42C热水浴1min （超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰 上冷却23min，加入lmlSOC培养基。摇床上摇45min，150rpm， 37C。（使菌体复苏）离心，3000rpm, 3min。涂板：取200pl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放 入培养箱中30min晾干后倒着放置。（1216h）15-11-5配IPTG （0.2g/ml）,用灭菌水，超净台操作。挑单克隆:（将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验）提前准备好几支装有3ml培养基的试管，每管加入3ul Kan+ 抗生素（50mg/ml）,塞好

3、塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的 菌落，轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子 【试管中培养基液澄清】将试管放在摇床中培养一晚，37C,250rpm。（尽量不超过12h） 【试管中培养基液变混浊】 注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。15-11-6 扩大培养、诱导表达以（抗生素:培养基）1：1000的比例向培养基中加入Kan+抗生 素，摇匀后再加入（每100ml培养基）1ml单克隆溶液，摇匀。摇床上放置2.5h,37C,180rpm。以48pl IPTG/100ml培养基的比例加

4、入IPTG诱导，移去牛皮 纸，恒温摇床上摇6h，3OC,180rpm。冰上放置一晚（抑制细胞生长 速率，有利于蛋白质充分折叠）15-11-6 离心收集细菌：将培养液倒入50ml离心管中，8000rpm,离心5min, 弃上清。沉淀加水冲洗混匀，再离心，弃上清。加 PBS 冲洗混匀， 离心，弃上清。加PBS混匀，将溶液移入PU管中，-20C保存。 15-11-7破碎、离心细胞4ml细胞液用超声破碎34次（探头不能碰到管底和管壁，且 离管底1cm左右,47ml），至溶液透明。将溶液分装到15ml离心管中，（10000rpm，4C,1015min） 离心 23 次至没有白色沉淀。蛋白质纯化脱盐离心后得到的上清液用针筒抽取过膜，先后用镍柱纯化、脱盐 柱脱盐（柱子不能干，不能有气泡）。两者也可同时进行镍柱：水洗Bind

人人文库> 全部分类> 行业资料 > 机电工程

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论