基于多组学的耐盐药材罗布麻叶的品质形成机制研究

基于多组学的耐盐药材罗布麻叶的品质形成机制研究陈翠花

【摘要】：罗布麻叶为常用中药材,系夹竹桃科植物罗布麻ApocynumvenetumL.的干燥叶,具平肝安神,清热利水之传统功效及降血压、降血脂、抗抑郁、保肝、增强免疫、抗衰老、抗糖尿病血管病变等药理作用,其药用、茶饮历史悠久,临床上用于肝阳眩晕,心悸失眠,浮肿尿少,高血压,神经衰弱,肾炎浮肿等症;茶饮具清凉去火,防止头晕等保健功能。罗布麻为一广布的耐盐中药资源,盐胁迫环境与罗布麻叶药材品质密切相关,适度盐胁迫可促进罗布麻叶有效成分的合成与积累,提高其药材质量。然而,在罗布麻叶品质形成过程中,盐胁迫如何影响罗布麻叶次生代谢产物的合成与积累及其响应盐胁迫机制至今尚不清楚,因而,如何阐明盐胁迫下罗布麻叶的品质形成机制已成为罗布麻叶品质提升工程中的关键问题。本课题在对罗布麻叶品质评价研究的前提下,依据盐胁迫诱导转录组、蛋白质组的差异表达而影响次生代谢物合成积累的规律。借助多组学整合分析的优势和特点,采用转录组学和蛋白质组学技术筛选和分析盐胁迫下罗布麻叶的差异表达基因和差异表达蛋白质,用植物代谢组学技术筛选和鉴定盐胁迫下罗布麻叶的特征性代谢差异标志物,并通过多组学关联分析,探讨盐胁迫下罗布麻叶次生代谢物差异成因及其药材品质形成的内在机制。从而为探索罗布麻叶药材品质形成过程提供基础资料。主要研究内容与创新性结果如下:1.文献研究查阅罗布麻叶以及盐胁迫下多组学分析的相关文献,对其进行综述。2.罗布麻叶中多元指标成分分析优化建立了基于UFLC-QTRAP-MS/MS技术同时测定罗布麻叶中黄酮、有机酸、氨基酸及核苷类共43种活性成分含量的方法,对不同产地和种属罗布麻叶和白麻叶共41批样品进行比较分析,并结合主成分分析及灰色关联度分析对样品进行分类和质量评价。结果表明,所建立的方法准确、可靠;罗布麻叶与大花罗布麻叶明显区分,罗布麻叶质量较好。从而为罗布麻叶药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考。3.罗布麻叶中黄酮类成分的组织定位和动态积累通过激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)确定了罗布麻叶中黄酮醇类化合物的组织定位,通过香草醛-HCl染色法观察到黄烷醇的组织定位。LSCM观察表明,黄酮醇类成分聚集在表皮细胞和木质部导管壁中,特别是在原生质体和细胞核中。黄烷醇类成分位于栅栏薄壁组织细胞和导管壁中,特别是在韧皮部的乳汁管中。根据槲皮素和山奈酚衍生物的最大发射波长之间的差异,通过2-氨基乙基联苯基硼酸酯试剂处理使其具有荧光特性,山奈酚及其衍生物仅分布在角质层中。采用HPLC法测定了不同采收期和不同生长部位的罗布麻叶中的5种黄酮类成分的含量。结果表明6、7月份不同部位的罗布麻叶中紫云英苷含量呈下降趋势,而金丝桃苷和异槲皮苷含量较高。通过LSCM和香草醛-HCl染色确定了罗布麻叶中黄酮类化合物的组织定位,并且罗布麻叶中黄酮的含量与采收时间和生长部位有关。4.盐胁迫下罗布麻叶质量分析(1)盐胁迫对罗布麻叶生理指标及多元指标成分的影响本实验基于UFLC-QTRAP-MS/MS技术结合多元统计分析,基于生理指标和多元指标成分对各种浓度盐胁迫响应变化系统地评价罗布麻叶的质量。光合色素、渗透稳态、脂质过氧化产物和抗氧化酶的生理特性研究四种浓度(分别为0、100、200和300mMNaCl)的盐胁迫下罗布麻叶的耐盐机制。此外,从盐胁迫处理下的罗布麻叶中定量了43种指标成分,包括14种氨基酸、9种核苷、6种有机酸和14种黄酮成分。另外,采用多元统计分析,包括层次聚类分析、主成分分析和灰色关联度分析,分别对样本进行系统聚类、区分和评价。结果表明,与对照组相比,低、中浓度盐胁迫处理组有助于维持光合作用、渗透平衡、抗氧化酶活性以及代谢产物的积累,并且这两个处理组比其他组的质量好。然而,在重度胁迫下,由于不能有效清除活性氧导致氧化损伤积累和代谢产物减少,从而罗布麻叶质量下降。综上所述,该方法有助于罗布麻叶和其他耐盐中药材的质量评价。(2)基于谱-效关系的盐胁迫下罗布麻叶质量分析建立了化学指纹图谱与保肝活性之间的关系,以评价盐胁迫处理后罗布麻叶的质量。通过UFLC-TripleTOF-MS/MS技术得到不同盐浓度处理后的罗布麻叶样品的特征指纹图谱,并基于共有特征峰,使用层次聚类分析进行相似性分析。通过生化标志物和组织病理学研究了罗布麻叶对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的保肝作用,结果表明与其他浓度盐胁迫处理组相比,高剂量的低浓度盐浓度胁迫下的罗布麻叶会明显改善小鼠肝损伤。基于多变量统计分析,包括灰色相关分析和双变量相关性分析,运用化学指纹图谱和保肝活性之间的谱-效关系。结果表明,在低浓度盐胁迫下的罗布麻叶中,多酚类化合物(如黄酮和酚酸)的积累可以有效清除自由基。因此,本实验结合化学指纹图谱和生物活性,可更全面的评价盐胁迫下罗布麻叶的质量。5.盐胁迫下罗布麻叶的多组学分析(1)基于RNA-seq技术的盐胁迫下罗布麻叶转录组学分析采用基于Denovo组装的RNA-seq技术对四组不同浓度盐胁迫处理下罗布麻叶进行转录组学分析。使用BLAST将所有基因比对到NT、NR、Swiss-prot、COG、KEGG、GO、Interpro数据库进行功能注释,根据差异倍数和错误发现率筛选出差异表达基因,依据差异基因代谢通路对罗布麻叶耐盐机制进行分析。结果显示,与空白组相比,低、中、高浓度盐胁迫下的罗布麻叶分别有807、1512、1258个差异表达基因。这些差异表达基因参与苯丙素类、黄酮类、萜类生物合成、氨基酸合成等164个KEGG通路。结果发现,盐胁迫显著上调了淀粉和蔗糖代谢、糖酵解、萜类合成、植物激素信号转导、植物与病原体相互作用、谷胱甘肽代谢、核糖体等基因的表达。本实验的转录组学分析对揭示盐胁迫下盐生植物罗布麻的耐盐机制和了解其质量形成机制具有一定的意义。(2)基于iTRAQ技术的盐胁迫下罗布麻叶的蛋白质组学分析基于iTRAQ的蛋白质组学分析了四组盐处理水平的罗布麻叶样品中蛋白质的变化。与对照组相比,盐处理的罗布麻叶中分别发现了143、162和167个DEPs。它们主要参与碳水化合物和能量代谢、代谢物的生物合成和信号转导。结果表明碳和氮的代谢在盐胁迫下发生了变化。中、低水平的盐胁迫增强了光合功能,并加速了碳水化合物的代谢。然而,重度盐胁迫抑制了次生代谢物的生物合成。(3)基于UFLC-TripleTOF-MS/MS的盐胁迫下罗布麻叶的代谢组学分析为了解盐生植物的耐盐机理,本实验采用了基于超快速液相色谱串联三重飞行时间质谱的代谢组学分析技术。结果表明,各组之间的代谢谱图可以区分。差异代谢物属于多种化学类别。此外,在所有盐胁迫的罗布麻叶组中,苯丙素类途径和萜类化合物的生物合成均受到干扰。从各种指标成分的相对含量和光合色素的生理变化、渗透稳态、脂质过氧化产物和抗氧化酶方面来看,低浓度盐处理组优于其他组的样品。本研究基于植物代谢物变化的整体水平,可为罗布麻叶的耐盐机制和品质评价提供一些参考。(4)盐胁迫下罗布麻叶组学关联分析通过指标成分含量、谱-效关系、代谢组学相关联,筛选出7个质量差异标志物—原花青素B2、灰青斑鸠菊内酯B、黄蝉花定、槲皮素、山奈酚、异槲皮苷、乙酰化异槲皮苷。通过转