大肠杆菌抗氧化应激反应的蛋白质组学讲解

大肠杆菌抗氧化应激反应的蛋白质组学分析摘要在细胞代谢过程中，部分电子逃逸出氧化还原系统，以氧分子作为电子受体，产生具有毒害作用的高能量活性氧分子(reactiveoxygenspecies,ROS)，包括超氧阴离子、单线态氧、过氧化氢、羟自由基和脂质过氧化的中间产物。活性氧是一种广谱杀菌剂,是宿主细胞抗菌作用的有效方式。但细菌在长期的进化过程中必然会发展出多种对策来抵抗宿主所产生的活性氧的杀菌作用。为检测与此相关的蛋白质,本研究主要通过正常及氧化应激条件下对大肠杆菌kl2的培养，差速离心法提取膜蛋白进行SDS,挖取具有明显差异的蛋白质条带，经胶内酶切处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)进行鉴定分析。结果鉴定到两种具有明显差异的蛋白，麦芽糖孔蛋白、外膜蛋白OmpA表达量明显下降，这两种蛋白主要与小分子物质渗透进入细胞有关，因此可以推测细菌为了适应周围环境的改变关闭膜上小分子通道，减少过氧化氢摄入细胞内，进而减少过氧化氢的毒害作用。通过本研究，我们可以初步阐明大肠杆菌的氧化应激机制。关键词：活性氧；氧化应激反应；膜蛋白；MALDI-TOFMS/MS；过氧化氢ABSTRACTDuringthemetabolisminthecell,oxygenmoleculesasanimportantelectronacceptor,Alsoaccompaniedbysomeelectronicescapefromtheredoxsystem,producesomehighenergyreactiveoxygenspecieswhichhaspoisoned,includingsuperoxideanion(O2-),singletoxygen,hydrogenperoxide,hydroxylradical,alsoincludestheintermediateproductsoflipidmetabolism.Reactiveoxygenspecies(ROS)isabroad-spectrumfungicide.Itisoneoftheeffectivewaytohostcellantimicrobial.However,bacteriainthelong-termevolutiondevelopmentofavarietyofstrategiestoresistthehostimmunebactericidalaction.Todetectwhichproteinsassociatedwiththissystem,inthisstudy,mainlythroughtrainingtwogroupofthepathogenicE.coli,theoneTreatmentbyhydrogenperoxide,theotheroneasthecontrolgroup,Brokencellsbyultrasound.Extractionthemembraneproteinsbydifferentialcentrifugation,makeaSDSelectrophoresiswiththeProtein,Diggingthesignificantdifferenceproteinband,aftergeldigestion,thenidentifiedbyMALDI-TOF-MS/MS.Wefoundtwoproteinswhichhavesignificantdifference,theyareMaltoporinandoutermembraneproteinA(OmpA).MaltoporinandOmpAareassociatetothesmallmoleculespenetrateintothecells.Therefore,wecanspeculatethattoadapttotheenvironmentBacteriaClosemembranechannelsofsmallmoleculestoreducetheintakeofintracellularhydrogenperoxide,therebyreducingthetoxicityofhydrogenperoxide.Throughthisexperiment,wecaninitiallyclarifytheoxidativestressmechanismofE.coli.Keywords:Reactiveoxygenspecies;Oxidativestress;hydrogenperoxide;Membraneprotein;MALDI-TOF-MS/MS目录摘要ABSTRACTTOC\o"1-5"\h\z第1章细菌抗氧化应激反应的研究进展1蛋白质组学分析在细菌抗氧化应激研究中的应用1金黄色葡萄球菌的蛋白质组学分析1幽门螺旋杆菌的蛋白质组学分析1枯草芽孢杆菌的蛋白质组学分析2在其他菌株上的蛋白质组学分析2蛋白质组学分析的概括3第2章材料和方法5实验流程图52.2材料及主要实验仪器62.3试剂72.4实验过程102.4.1大肠杆菌扩大培养10氧化应激处理102.4.3细胞破碎112.4.4膜蛋白提取112.4.5制胶112.4.6样品处理12SDS分析12MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定13第3章实验结果14第4章讨论18过氧化氢的浓度18质谱结果分析18前景展望19参考文献20致谢23#TEMED5吐AP30吐最后加AP,加完后立即混匀，灌胶。(为了加快凝胶，可以将AP和TEMED的量加大，一般为原来的2-3倍，电泳缓冲液视制胶环境温度而定)50mMTrisBase30.3g甘氨酸144.1gSDS10g加800ml超纯水充分溶解后，定容到1L,这是10x的缓冲液。使用时需用超纯水稀释10倍。样品loadingbuffer(2X)100mMTris-HCl(pH6.8)4%(w/v)SDS0.2%(w/v)溴酚蓝20%甘油(v/v)200mM巯基乙醇充分混匀，-20°C保存，使用前在沸水中加热1min。考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-2501g甲醇450ml蒸馏水450ml冰醋酸脱色液100ml乙醇250ml冰醋酸超纯水定容至1L。80ml2.4实验过程2.4.1大肠杆菌扩大培养[25]配置液体LB培养基分装到10支试管中，密封，每支试管约2ml；100ml固体LB培养基于250ml锥形瓶，将这些培养基和洗干净的4个培养皿在121°C,1MPa条件下灭菌20min,于烘箱中烘干，在紫外线灭菌30min的超净工作台中倒平板，从-80C冰箱中取出大肠杆菌k12菌株，将4支装有2ml左右LB液体培养基的试管放到超净台中，在酒精灯附近用20yL的枪头蘸下，小心丢进试管中，放在37C恒温摇床上培养过夜（约12h）。然后在超净台中，用灭菌后的接种环在固体培养基上划线，放到37C恒温箱中过夜。待培养基上长出明显的菌斑时，在超净台中，用20yL枪头挑取菌斑分别投入4支含有液体培养基的试管中，酒精灯烧一下管口，然后密封，在37C恒温摇床上培养过夜（约12h）。2.4.2氧化应激处理在超净台中，将培养好的细菌分别倒入4瓶装有500ml液体培养基的锥形瓶中，分别标号1、2、3、4。将4个锥形瓶放在恒温摇床上，37C，转速250rpm培养，每隔半个小时，在超净台取1ml于分光光度计中，测量其OD600的值。经过大约3小时，1号OD60o为0.5855,2号0。600为0.5654,3号0。600为0.5862,4号的0。600为0.6144。取4个500ml已灭菌的离心管，分别标号1、2、3、4。将锥形瓶中的菌液分别倒入对应的离心管中，每管约300ml,在电子天平上称量，使每两管之间的重量误差在0.05g以内，然后放到离心机中，4500rpm,4C离心10min，小心倒去上清液，将剩下的菌液倒入对应离心管，重复上述步骤。向每个离心管中分别加入30mlPBS缓冲液，用1ml枪轻轻吹打，使沉淀充分重悬，将重悬后的溶液用5ml的移液枪转移到50ml离心管中，分别标号1、2、3、4。然后放到离心机中，4500rpm,4C离心10min,离心完毕后，小心倾倒去上清液。将四瓶装有500mlPBS缓冲液的锥形瓶标号1、2、3、4,从中取出30ml缓冲液加入到对应的离心管中，用5ml移液枪充分吹打混匀，然后转移到对应编号的锥形瓶中。向1、2号锥形瓶中加入10mmol过氧化氢溶液，轻轻摇晃混匀，把混匀的锥形瓶放到恒温摇床上，37C,200rpm孵育1小时。2.4.3细胞破碎将孵育好的大肠杆菌分别从四个锥形瓶取一部分（约300ml）到500ml离心管中，在天平上平衡后，放入离心机，5000rpm，4°C离心10min,然后小心倾去上清液，将锥形瓶中剩余液体倒入离心管中，重复上述步骤，得到沉淀。向每管中加入10ml膜蛋白提取液，用移液枪轻轻吹打，充分混匀。然后将液体转移到新的离心管中，分别标号1、2、3、4。取一支管子插入装满冰块的烧杯中，放到超声破碎仪中进行超声破碎，超声时间3s,间隔5s,功率40%，超声180次，直到溶液澄清透明。膜蛋白提取[26]细胞破碎完全后，通过电子天平配平四支离心管，使误差尽可能小，放入高速冷冻离心机，12000rpm，4C，离心20min。离心完成后将上清液（胞浆蛋白及膜蛋白）转移到特殊的离心管中,标号，通过天平配平，使相对应的两组的质量误差不超过0.01go将转子小心地放到超速离心机中，23500rpm，4C,离心1h。在离心管的底部有少部分的膜蛋白沉淀。倒去离心后的上清液，加入少量的膜蛋白提取液轻轻冲洗，然后将管子倒扣在吸水纸上析吸干，向离心管中加入200吐的膜蛋白缓冲液，用200吐的移液枪轻轻吹打，尽可能的少产生气泡，约20min，蛋白沉淀充分重悬。分装到1mlEppendorf管中，每管各装100吐的膜蛋白混合液。对应标号，其中1、2编号的Eppendorf管中是过氧化氢处理后的膜蛋白，3、4编号的Eppendorf管中是对照的膜蛋白。将这些膜蛋白保存于-20C冰箱中待用。制胶清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗干净后立在架子上晾干。灌胶：1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）2、按前面方法配10%分离胶，加入AP后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用lml枪分次吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。4、按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入4°C冰箱保存。样品处理从冷冻冰箱中取出样品1号和3号，用100yL移液枪从1号管和3号管中各取40吐液体，放入新的EP管，标号1、3。1号中的样品为过氧化氢处理过的大肠杆菌的膜蛋白，3号为对照组。向两个EP管中加入等体积的loadingbuffer（2X），放在沸水中加热10min。加热完后，放到小型离心机中，12000rpm离心5min。SDS分析[24,25]将制好的胶从4C冰箱中取出，放入电泳槽，向内槽加入稀释后的电泳缓冲液，液面至少没过内侧小玻璃板。外槽加入用过的电泳缓冲液，没过金属丝即可。向加样孔中分梯度加入样品，从左到右分别是10吐、8吐、5吐、2.5吐，处理过的样品和对照样品两两对应。最右边加入Marker。盖上盖子，插上电源，刚开始电泳电压为80V,待样品跑过浓缩胶（约30min），进入分离胶后，把电压改为120V继续，直到溴酚蓝刚刚跑出胶的底部，停止电泳。将跑完的胶小心取出，如果太干就用自来水湿润，以防破裂。将胶放入洗干净的培养皿中，加入考马斯亮蓝在转速为70rpm的摇床上染色2h。加入脱色液放到转速为70rpm的摇床上脱色，30min后换一次脱色液。然后继续脱色4小时即可看到清晰条带。如果要过夜脱色，可以向100ml超纯水中加入1.46gNaCl作为脱色液。2.4.8MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定观察SDS胶，用洗干净的手术刀从上样量浓度相近的两组泳道上挖取3条差异最明显的条带，然后分别切成约lmmxlmmxlmm大小的胶粒，放入两个EP管，分别标号1、2。每管加入50吐脱色液（50%乙腈，25mmol/L碳酸氢铵），室温放置30min；吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。抽真空离心干燥30min左右至白色颗粒状，加入2yL（浓度为10ng/yL）溶于20mmoL/L碳酸氢铵的胰蛋白酶，4°C吸胀1h，吸去多余的酶液，将管子倒置，37°C空气浴过夜。每个装有胶粒的EP管中加入85%三氟乙酸，37C1h，将液体吸净转移至一干净的离心管中，每个蛋白质胶粒再加入8yL2.5%三氟乙酸/50%乙腈，30C1h,吸出液体与前一次的提取液合并，抽真空离心干燥。用2yL0.5%三氟乙酸充分溶解肽段立即进行MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定［26。第3章实验结果由于不知道样品浓度，第一次上样量分别是20yL、15yL、10yL,——对应，发现对照组的10yL条带比较清晰，而氧化应激处理后的样品中蛋白含量比较浓，条带不清晰，故第二次重新跑SDS电泳，调整上样量，分梯度进行，其中对照组取10yL不变，而处理组则分梯度，分别上样量为10yL、8yL、5yL、2.5yL,重新跑电泳，结果如下（图3-1）：对照处理对照处理对照marker处理对照处理样品类型10101081025102.5上样量（“1）图3-1可以明显的看到，处理组与10yL对照组样品中的蛋白含量接近的是5yL与8yL这两组，因此重新调整上样量，对照组样品上样量全取9yL,氧化应激处理过的样品，分别取6yL、5yL、4yL、3yL、2yL。电泳结果如下（图3-2）：

图3-2从上述胶中可以明显发现，处理组5yL样品中所含的蛋白与对照组9yL样品所含蛋白量差不多，故这两条带上挖取差异最明显的2个条带，编号1、2，如图3-3所示，切成约1mmxlmmxlmm大小的胶粒，放入装有超纯水的EP管中。对關处理每管加入50yL脱色液室温放置30min；吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。抽真空离心干燥30min左右至白色颗粒状，加入2yL溶于碳酸氢铵的胰蛋白酶，4°C吸胀1h,吸去多余的酶液，将管子倒置，37°C空气浴过夜。对關处理每个装有胶粒的EP管中加入85%三氟乙酸，37C1h，将液体吸净转移至一干净的离心管中，每个蛋白质胶粒再加图3-3入8yL2.5%三氟乙酸/50%乙腈，30C1h,吸出液体与前一次的提取液合并，抽真空离心干燥。用2yL0.5％三氟乙酸充分溶解肽段立即进行

MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定，得到如下两个图谱：图3-4为1号条带图谱，图3-5为2号条带图谱。4013.03370.20魚O89L.龙polrj9akHOO98Lpgp9ln6ZL998P36,_luJ—907777A\60cngo8c.Mass(m/z)图睁3and1)C900.9Z8L396C08L离茗t9厂5启.69lr»一zgfopggSL「董gX6ZIOOI9M86s.EmE9」968CNggCM°—律9P0C6I4013.03370.20魚O89L.龙polrj9akHOO98Lpgp9ln6ZL998P36,_luJ—907777A\60cngo8c.Mass(m/z)图睁3and1)C900.9Z8L396C08L离茗t9厂5启.69lr»一zgfopggSL「董gX6ZIOOI9M86s.EmE9」968CNggCM°—律9P0C6I@瞿吕=宇建这9L.\0z\60tn.6969082L10090C909G9924E二2727.4O)、8e-O90固」ifeK.g98=9900888R£d2084.6L6EE9Myxabze舊1062厂0ZS9mecL668蛍一gszggLAlwusu一津799.0Mass(m/z)图3-5(Band2)通过查阅数据库，比对鉴定得到两种蛋白分别是麦芽糖孔蛋白（Maltoporinprecursor)、外膜蛋白0mpA(0utermembraneproteinAprecursor)，如下表3-1。表3-1质谱鉴定结果BandAccessionNo.ProteinNameMWPep.CountProteinScoreProteinScoreC.I.%1gil125964lsplP02943.1ILAMBECOLMaltoporinprecursor(Maltose-inducibleporin)(Lambdareceptorprotein)49880.661911002gi|71159605|sp|P0A910.1QMPAECOLOutermembraneproteinAprecursor(OutermembraneproteinII*)37177.78426100第4章讨论4.1过氧化氢的浓度由于h2o2具有杀菌作用，掌握好h2o2加入的浓度和反应时间是一个难点。所以第一次培养大肠杆菌时，加入孵育的浓度为0.8mmol/L、1mmol/L的过氧化氢，与对照组一起孵育1小时，然后再提取膜蛋白，做一个SDS电泳，条带差异较小,调整过氧化氢浓度，重新培养大肠杆菌，这一次分别加入8mmol/L、20mmol/L的过氧化氢孵育，提取膜蛋白，跑SDS电泳，发现20mmol/L处理的样品膜蛋白的条带与8mmol/L处理和对照组的具有明显的差别，而8mmol/L处理和对照组样品的条带基本一样，由于这次样品不多，第三次培养细菌，就分两组，一组20mmol/L过氧化氢处理，另一组不处理做对照，孵育完后提取膜蛋白，保存样品。4.2质谱结果分析蛋白质功能分析：1号条带为麦芽糖孔蛋白，它参与麦芽糖和麦芽糊精的过膜运输，具有摄取麦芽糖和麦芽糊精的功能。同时它也能做几个噬菌体（包括lambda）的受体，缺乏膜孔蛋白，可抵抗某些噬菌体及兰刚菌素的侵害，对细菌而言，具有进化意义［27］。2号条带为外膜蛋白OmpA，该蛋白能通过产生大肠杆菌素K和大肠杆菌素L来保持共轭多聚体的稳定。它可以当做一个T型噬菌体的受体，也可以作为低渗透（允许小分子渗透过膜）的孔蛋白［28-30］。由于经过氧化氢孵育的样品中麦芽糖孔蛋白和外膜蛋白OmpA的表达量明显下降了，而这两种蛋白都属于通道蛋白。这说明大肠杆菌在有过氧化氢存在的环境中，为了适应新的环境，减少过氧化氢的毒害作用，菌体内部的麦芽糖孔蛋白和外膜蛋白OmpA表达量下降，关闭了膜上的小分子通道，从而减少了过氧化氢进入菌体内部，降低了过氧化氢对菌体的影响。通过这个实验，我们初步阐明了细菌抗氧化应激应答的机制。前景展望通过上述实验结果可以知道，细菌抵抗宿主的产生的活性氧的杀菌作用主要是依靠减少膜孔蛋白的编码，关闭膜上小分子通道，从而降低了菌体内的活性氧浓度，减少了活性氧对细胞的毒害作用，使细菌适应具有活性氧的环境，通过本实验，初步阐明了大肠杆菌抗氧化应激的原理，同时为进一步的实验提供了研究方向。参考文献DanchenkoSC,HartM,BegerR.COmpArativeproteomicsofStaphylococcusaureusandtheresponsetoreactiveoxygenspecies[J]．FASEBJ,2006,20:LB66．WeberH，EngelmannS,BecherD,eta1.Oxidativestresstriggersthioloxidationintheglyceraldehydes-3-phosphatedehydro-genaseofstaphylococcusaureus[J]．MolMicrobiol,2004，52(1):133-140．ThroupJP，ZappacostaF，LunsfordRD，etal．ThesrhSRgenepairfromStaphy1ococcusaureus：genomicandproteomicapproachestotheidentificationandcharacterizationofgenefunction[J]．Biochemistry,2001,40(34):10392-10401．[4]游运辉.胃癌及慢性胃炎幽门螺杆菌的蛋白质组学研究[J].中南大学学报(医学版),2008,33(5):384-389MostertzJ，ScharfC,HeckerM,etal.TranscriptomeandproteomeanalysisofBacillussubtilisgeneexpressioninresponsetosuperoxideandperoxidestress[J].Microbiology,2004,150(pt2)：497TopanurakS，SinchaikulS，PhutrakulS，etal.ProteomicsviewedonstressresponseofthermophilicbacteriumBacillusstearothermophilusTLS33[J].Proteomics,2005,5(14):3722SvensaterG，SjogreenB，HamiltonIR．MultiplestressresponsesinStreptococcusmutansandtheinductionofgeneralandstress-specificproteins[J]．Microbiology,2000,146(Pt1):107OkanoS,ShibataY,ShirozaT,etal.Proteomics-basedanalysisofacounter-oxidativestresssysteminPorphyromonasgingivalis[J].Proteomics.2006,6(1):251[9]胡丽萍,沈岩．双向凝胶电泳技术、蛋白质组与基础和临床医学[J].国外医学分子生物学分册,2001,23(2):118-121．[10]Lopez-CampistrousA，SemchukP，BurkeL，eta1．Localization，aB．uotation,andcOmpArisonoftheeseheriehiacolik12proteomeundertwostatesofgrowth．MdCellProteomies,2005,4：1205-1209．[11]ZengR，RuanHQ,JiangXS,eta1.ProteomieanalysisofSAPSassociatedcomnavimsusingtwo-dimensionalliquidehromatographymassspeetrometryandorle-dimensionalsodiumdodeeylsulfate-polyacrylamidegelelec・tmphoresisfollowedbymassspeetmemtrieanalysis.JProteomeRes,2004,3:549-555．[12]陈阳,徐维明•蛋白质组学技术在幽门螺杆菌研究中的应用[J].WorldChinJDigestol,2005January,15,13(2):243-245．张爱玲，王兴龙，等•蛋白质组学技术及其在病原微生物研究中的应用J].中国预防兽医学报,2008,30(5):408-410fieldss.Proteomicsingenomeland(J].Science，2001，291:1221-1224O'FarrellP.HHighresolutiontwo-dimensionaleletrophoresisofproteins[J].JBioChem，1975，250:4007-4021．KathrynSLilley，DavidBFriedman.DifferencegelelectrophoresisDIGE[J]．Proteomics，2006，3：347-353．TongeR，ShawJ，MiddletonB，etal．Validationanddiferentialgeloffluorescenceelectropho-resistechnology[J