低分子有机无机盐水两相体系的建立及其对罗丹明b的分离富集研究

第一章前言人们为了改变食品的外观，向其中添加色素的历史已有上千年。添加了色素的食物色彩鲜艳，不仅可以增加视觉效果，还能激起人们的食欲。由于天然色素成本昂贵，所以人们采用先进的技术合成了非常多的人工色素，这些人工合成的色素普遍具有着色能力强、价格低廉的特点。然而，将非食用色素添加到食品中虽然可以大幅降低成本，但是会严重损害人们的健康，长期食用会导致致癌。因此，为了保证消费者的权益，建立一种简单、快速的提取检测食品中的非食用色素是十分有必要的。双水相萃取技术是近些年来新兴起的一种样品前处理技术。其具有一系列的优点如：萃取条件相对温和、简单、高效快速、易于连续操作等。其原理是依据目标物在双水相体系两相间的溶解度不同和选择性分配。目标物进入到双水相萃取体系后，存在多种作用力，使目标物具有不同的分配系数从而达到分离提纯的目的。双水相萃取体系目前被广泛应用到中药活性成分的提取中。传统的双水相体系如高聚物/高聚物双水相体系原料昂贵且难以回收。因此，迫切的需要建立新组分的双水相萃取体系用于大规模工业提取。目前以一般有机物为导向的双水相萃取系统更具吸引力，因为它成本低、毒性低、溶剂易回收、后续操作简单[1]。例如，由乙醇、丙酮或异丙醇与无机盐组成的双水相体系已应用于天然产物提取[2-4]。由于有机物/无机盐双水相体系的上述优势，这种双相体系正逐渐被应用于其他领域。常用的分析食品中罗丹明b的方法主要有气相色谱法[5-7]，高效液相色谱法[8-10]，紫外分光光度计法[11-13]，荧光分光光度计法[14]等。由于紫外分光光度计的操作简单，检测快速，对色素有很好的吸收作用，所以被广泛的应用到色素的检测当中。但由于食品中成分多样，基质干扰复杂。因此，选择一种合适的样品前处理方法很关键。对于食品中罗丹明b分离常见的样品前处理方法有超声提取法[15-17]，固相萃取法[18-20]，固相微萃取法[21]，液-液萃取法[22]。双水相萃取是在液-液萃取的基础上发展起来的，是样品制备和预浓缩的新兴起的一种方法，其具有操作简便[23-25]，试剂用量少，耗时短等优点，因而在本研究中，我们采用低分子有机物/无机盐双水相体系来富集食品中的非食用色素罗丹明b，最后采用紫外分光光度计法对其进行定量检测。第二章文章综述2.1双水相萃取技术2.1.1双水相研究的历史和背景1896年，马丁努斯·威廉·拜耶林克在混合淀粉和明胶的水溶液时偶然发现了双水相体系。然而，它的实际应用是由佩尔-艾克·阿尔伯森发现的，之后双水相体系被用于生物活性物质提取等。双水相萃取除了体系优于传统的提取技术外，还具有环境友好、成本低、能够连续操作、易于放大等特点，并且对于许多种类的实验特别是生物分子的浓缩和纯化是十分有效的。而其他液-液萃取方法由于工艺条件和有机溶剂可能损害生物活性物质而被限制使用。2.1.2双水相萃取技术的研究现状1956年双水相萃取体系被瑞典的Albertsson初次用来提取生物活性物质以后，双水相体系的应用研究才逐渐进入人们的视线。双水相萃取体系的优点在于具有新颖，灵活，快速，连续操作，易于使用和扩大规模等优点。并且可以提供温和的萃取环境，保持目标物的活性，逐渐普遍应用到生物工程、中药有效成分萃取以及抗生素的分离萃取等方面。王金志等[26]采用了一种新的芦荟大黄素的分离和纯化方法，即丙酮/硫酸铵双水相萃取法。对丙酮、硫酸铵以及水的用量对提取效率的影响进行了考察，最终确定了芦荟大黄素分离和纯化的最佳条件。实验结果表明，当水的用量5mL，丙酮的用量5mL，硫酸铵的用量2.5g时，目标物质芦荟大黄素的提取纯度可以达到95.23%杜萍等[27]评估了一种三阶段PEG/柠檬酸钠双水相萃取体系来净化口蹄疫病毒（FMDV）。研究通过选择成相盐并通过使用添加剂改变PEG的分子量和pH值，获得独特的分离萃取效率，最后通过多级的双水相萃取体系来改善FMDV的纯度并除去聚合物。结果表明FMDV在单级双水相萃取体系中的分配系数（K）不随PEG的分子量线性增加。当PEG和柠檬酸钠的浓度分别为14％和16％时，FMDV的最高K值和回收率分别为989和107.69％。通过使用三阶段的双水相萃取体系，FMDV的纯度从0.007增加到0.14，除去PEG，FMDV的总体恢复率达到72％。并且在1000g放大实验中，结果与10g体系的结果一致。蒋玉琪等[28]开发了离子液体超声波辅助双水相萃取从菊花的栽培品种中提取和分离异氯酸C（ICGA）。并使用响应面方法优化对提取率有影响的参数，包括离子液体的浓度，液固比和超声时间。实验结果表明，在研究的离子液体中，1-丁基-3-甲基咪唑溴化物表现出最佳的提取能力。优化萃取条件包括液固比为23.44：1，超声时间为48.99min，pH=3.0，温度20℃，离子液体浓度为0.65mol/L。在最优条件下，ICGA的最大提取率为98.18％。此外，热力学参数表明，从富盐相到富含离子液体相的ICGA纯化是自发和放热过程。结果表明，该系统简便，快速，有效，可作为菊花提取和纯化ICGA的有效方法。目前，双水相萃取作为样品前处理方法，已经应用于中药中活性物质[29]的提取中。研究最多的双水相体系包括高聚物/高聚物双水相体系，如聚乙二醇/葡聚糖；高聚物/盐双水相体系，如聚乙二醇/硫酸钠。但这些萃取溶剂复杂、价格昂贵和不利于回收，使其应用受到了一定的限制。2.1.3双水相体系的形成双水相体系是由两种互不相溶的水溶液组成，当两种溶度不同且互不相容的水溶液以一定比例混合时，经过静置等辅助步骤后能够形成双水相或多水相体系，或是当两种聚合物、一种聚合物与一种盐，在一定的条件下进行混合时所形成的体系，都是双水相体系。在双水相体系萃取的过程中，两相间存在着多种作用力如电荷相互作用、分子间的氢键、聚合现象、疏水相互作用、范德华力等作用力。这些作用力导致目标化合物在两相间产生电势差异，从而实现相分离。2.1.4双水相体系的分类常见的双水相萃取体系如表2-1所示：表2-1常见的双水相体系双水相类型组成示例成相基本原理低分子有机物/无机盐乙腈/硫酸铵相间的缔结竞争聚合物/聚合物聚丙二醇/聚丙烯空间产生的阻隔效应聚合物/盐聚丙二醇/硫酸钠盐析作用离子液体/盐[BMIM]BF4/硫酸铵盐析作用表面活性剂十二烷基苯磺酸钠/十四烷基三甲基氯化铵胶束平衡共存聚电解质/聚电解质葡聚糖硫酸钠/羧甲基纤维素钠电荷相互作用2.1.5双水相萃取的基本原理目前，双水相萃取体系已经广泛应用到了生物活性物质的分离提纯，其中应用最成功的是在蛋白质的大规模分离中。双水相萃取的基本原理是根据目标物在两相间的选择性分配不同，从而达到分离的目的。当目标质进入双水相萃取体系后，由于表面性质不同和电荷相互作用的存在，使其在上下相中的分配系数不同，从而被分离提纯出来。被分离的物质的分配系数K是一个与浓度有关常数，符合Nernst分配定律：2-1公式中，Ct，Cb分别表示溶质在双水相上下相中的浓度。以低分子有机物/无机盐双水相萃取体系为例，其萃取过程如图2-1所示：图2-1低分子有机物/无机盐双水相萃取过程2.1.6影响双水相分配系数的因素以低分子有机物/无机盐双水相体系为例，有低分子有机物的种类及用量、无机盐的种类及用量、体系的温度、溶液的pH值，上下相体积比等条件都会影响目标物的分配。影响目标物分离的主要因素如表2-2所示：表2-2影响目标物分离的因素目标物质影响成相盐影响有机物的影响上下相的影响环境因素的影响物质的大小成相盐的种类有机物的种类上相体积的大小环境温度物质的溶解度成相盐的结构有机物的结构下相的浑浊度溶液pH物质的形状成相盐的用量有机物的用量上下相的比例操作影响物质的电荷成相盐的性质有机物的性质上下相的清晰度不连续实验影响目标物的种类目标物的种类也影响双水相体系的形成。目标物的溶解性影响着目标物的分配，而不同种类的目标物其溶解性有着明显的差异，溶解性好的在双水相体系中更容易富集，相反溶解性差的不易形成双水相。成相盐的种类和用量考察成相盐的种类及其用量是形成双水相的关键，成相盐的阴阳离子与水的结合能力不同，在两相间会形成不同的电势差从而影响目标物在两相间的分配。不同的成相盐形成双水相的能力不同，研究表明Na2SO4>MgSO4>(NH4)2SO4>NaCI>Li2SO4，可能的原因是不同的盐的盐析能力不同，从而影响双水相的形成。低分子有机物的种类和用量不同的低分子有机物的成相能力不同，对目标物的富集效率也不同，这可能是由于不同的有机物的传质效率，分相速度有着明显的差异，从而影响体系的分配。环境的影响体系的温度会影响目标物质的运动状态，从而影响其在体系的分配。温度也会对双水相体系的物理化学性质产生影响，使原来不易成相的物质通过升高体系的温度使其性质发生变化而变成易成相的物质。温度大范围的变化还会改变物质的密度和粘度，使目标物的提取率下降。（5）pH体系的pH值会影响成相盐阴阳离子的解离，使成相能力发生变化，从而影响体系的分配。pH还会影响目标物的稳定性，进而影响目标物的提取率。2.2双水相相图双水相体系的组成和成分的表面性质决定了两相之间的划分。对体系分配行为原理的不理解是双水相体系广泛应用的主要障碍。双水相相图很好的解决了这一问题，我们可以从建立的双水相相图中直观的观察到双水相体系的成相范围大小以及不能形成双水相的范围大小。图2-2是一种典型的双水相体系的相图。图2-2典型双水相相图双水相相图是一条平滑双节线，双节线下方的区域，体系为均匀的单相，形成双水相的两组分混合后溶液澄清，为均相区；双节线上方的区域，不同的两组分混合后体系能自动分为两相，为双水相区；双节线上的部分，溶液刚好由澄清变为混浊，为刚要分相的区域。连接双节线上两点的直线称为系线，由三点确定，即M，T，B。系线的长度越长两相间的差异就越大，当系线趋于零时，两相间的差异将消失并形成均相。系线上体系的总浓度不同，但均分成组分相同体积不同的两相时，两相体积服从杠杆规则：VT/VB=BM/MT。2.3双水相技术的应用双水相萃取体系是一种液-液分馏样品处理技术，因其在工业和学术界提取、分离、纯化和富集蛋白质、膜、病毒、酶、核酸和其他生物分子的巨大潜力而受到关注。但是，该方法中涉及的分区行为很复杂，很难预测。目前的研究表明，它还被成功地用于食品中兽药残留的检测、贵金属的分离、污水处理和各种其他用途。双水相体系能够提供较高的回收率，并且易于扩大规模，这也是非常经济和环保的方法。2.3.1中药有效成分的提取与分离中药中的活性成分种类较多，杂质干扰明显，采用传统的提取分离方法需要经过浓缩，回溶等一系列复杂的操作，繁琐耗时、产率偏低，很难达到所需要的提取率。因此，目前中药活性成分的提取一般选用双水相萃取技术。双水相萃取技术作为一种新兴的分离纯化技术，在中药活性成分的提取中得到了普遍的的应用，其研究主要集中于黄酮、生物碱、多酚和蒽醌等几类化合物。Tan等[30]建立了离子液体超声辅助（ILUAE）和双水相萃取（ATPS）相结合的方法用于提取金银花（FLJ）中咖啡酰奎宁酸（CQAs）的方法。用响应面法优化了ILUAE参数，包括白细胞介素浓度、超声时间和液固比。实验结果表明：优化后的ILUAE法提取3-O-咖啡酰奎宁酸（C1）、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸（C2）、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸（C3）的得率最高，分别为28.53、18.21、3.84mg/g。与传统提取工艺相比，该方法具有相当的提取率和较短的提取时间。应用双水相体系，两种痕量CQAs，5-O-咖啡酰奎宁酸（C4）和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸（C5）显著富集，这表明，ILUAE和ATPS是一种高效、环保的中草药CQAs样品提取富集技术。Xie等[31]建立了微波辅助双水相萃取-高效液相色谱法同时提取和测定无梗巴豆中黄酮类化合物。采用单因素实验和响应面法考察了双水相的组成、萃取温度、萃取时间、粒径和溶剂料比对黄酮提取率的影响。最佳萃取条件为：乙醇浓度32%，硫酸铵浓度22%，提取温度80℃，提取时间8min，粒度80目，料液比50：1。实验结果表明：在此最佳条件下无梗巴豆中的黄酮类化合物提取率和回收率分别为162.7-240.0μg/g和94.14-105.5%。2.3.2农兽药的提取与分离目前，茶叶中的基质干扰仍然是多种农药残留分析的一大挑战。FeiquanWang等[32]建立了一种改进的分散固相萃取法和冷诱导乙腈-双水相萃取法，开发了一种简单的样品制备方法。通过有效去除茶多酚和咖啡因等主要干扰物来降低茶叶中多种农药残留的基质效应。在改进的分散固相萃取工艺中，选用聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）作为基质分散吸附剂去除茶叶中的多酚，去除率大于98.3%。采用冷诱导乙腈-双水相萃取体系，茶叶提取物中咖啡因含量大幅降低81.2%，代表性农药富集系数达到0.798-3.167。2.3.3重金属的分离\o"SearchforHamta,Afshin"Hamta等[33]研究了汞（ⅱ）、锌（ⅱ）和钴（ⅱ）的分配行为在聚乙二醇双水相体系中的测定。该体系以Na2CO3作为成相盐，通过混合等重量的30%（重量比）聚乙二醇溶液和10%（重量比）Na2CO3溶液进行实验。以不同浓度的碘化物为萃取剂，研究了盐溶液的酸碱度、温度和初始金属离子浓度对离子分配的影响。实验结果表明，金属离子的提取主要取决于碘化物的浓度。换言之，金属离子的提取率随着碘化物离子量的增加而增加。观察到汞的萃取率随着酸碱度的增加而增加，而在锌和钴存在的情况下，汞的萃取并不显著，同时温度对金属离子的萃取影响较小。汞、锌和钴的最大提取率分别为99.3%、98.62%和58.2%。2.3.4生物活性成分的分离与纯化双水相体系萃取具有保持目标物萃取活性、操作条件温和等优点，被广泛用于生物活性成分的分离与纯化中。在实际应用当中常常用来提取溶液当中的蛋白质与酶。JuanHe等[34]利用两种酸碱度响应共聚物（PADB4.99和PMDM7.08）制备了一种可回收的双水相体系，并应用于猪圆环病毒2型Cap蛋白发酵液（PCV2Cap蛋白）的纯化。利用低场核磁共振研究了相分离机理。结果表明，当两种共聚物的浓度为4%-6%（重量比），pH=7.5-8.6时，能成功形成相对理想的双水相体系。考察了共聚物浓度、温度、酸碱度、盐的种类和浓度等主要参数对提取率的影响。结果表明，在30℃、pH=8.1、50mMLi2SO4的条件下，最佳成相条件分别为4%（重量比）PADB4.99和6%（重量比）PMDM7.08，最佳分配系数（K）和提取回收率（ER）分别为0.25和94.2%。PCV2Cap蛋白的最高纯度为88.4%。此外，通过调节溶液的酸碱度至等电点，可以回收两相共聚物，回收率超过97.5%。SuarezRuiz等[35]利用聚乙二醇和磷酸二氢胆碱选择性分离微藻色素和微藻蛋白质。叶黄素97.3±1.0%，叶绿素51.6±2.3%在富含聚合物的相中回收。同时，高达92.2±2.0%的蛋白质在水相中回收。回收的蛋白质活性完好无变性，色素没有降解，证明了双水相体系萃取的温和性。结论：双水相体系可以以温和的方式有效地将不同的生物分子分离出来。2.4低分子有机物/无机盐体系的应用低分子有机物/无机盐双水相体系具有分相速度快、良好的溶解性、粘度低、原料成本低等特点，因此被逐渐广泛的应用到重金属、生物活性物质、维生素、蛋白质的分离提纯中。低分子有机物还有沸点低的特点，可以采用蒸馏的方式回收成相物质，这有望解决其他双水相体系成相物质难回收的问题。2.5非食用色素罗丹明b概述色素可以分为食用色素和非食用色素，两者有着本质的区别。非食用色素大多属于合成色素如罗丹明b等，罗丹明b价格低廉，但有毒、有害而且具有一定的致癌性，长期食用会影响食用者的身体健康。因此，国家明令禁止将罗丹明b添加到食品中。国家在分析检测食品中色素的使用时，一旦发现非食用色素添加到了食品中如将罗丹明b添加到辣椒当中等情况，将依法追究相关使用人员的责任。下图是罗丹明b结构图：图2-3罗丹明b结构2.5.1罗丹明b的应用罗丹明b是一种粉红色的粉状化工染料，俗称“玫瑰红b”。工业用途主要有烟花爆竹的制作、有机玻璃的制作等。因其在溶液中有强烈的荧光，所以常常用于实验室细胞荧光染色。罗丹明b属于非食用色素，我国以及欧盟都禁止添加到食品中。但罗丹明b是一种工业合成色素，生产几乎没有成本，所以其价格低廉并且有很好的着色能力。一些不法商贩将其代替价格昂贵的使用色素添加到辣椒粉等食品中。过多的使用会引起中毒反应，甚至会致癌，严重危害消费者的健康。2.5.2非食用色素的分离方法与检测方法根据文献报道，常用的非食用色素的提取分离方法主要有：液液微萃取，固相萃取，分子印迹-固相萃取，浊点萃取等；常用的非食用色素的检测方法主要有：酶联免疫法，高效液相色谱-质谱法以及气相色谱等。DongmeiChen等[36]建立了液相色谱-串联质谱法同时测定12种动物源性食品（包括猪的肌肉和肝脏、鸡和鸭的肌肉、肝脏和皮肤、鱼的肌肉和皮肤以及鸡和鸭的鸡蛋）中的苏丹红一号、苏丹二号、苏丹三号、苏丹四号及其代谢物如4-氨基偶氮苯和邻氨基偶氮苯。样品制备程序包括乙腈超声辅助提取，正己烷脱脂，最后用固相萃取净化铝盒。6种苏丹红染料及其代谢物的检测和定量是通过反相液相色谱结合电喷雾电离三重四极杆质谱进行的。实验结果表明：各种样品的硫含量分别在0.03-0.12g/kg、0.09-0.19g/kg不等。加标样品从0.2-0.8g/kg的回收率为61.9-87.4%，相对标准偏差小于19.1%。整个分析程序的性能符合欧洲质谱检测委员会制定的标准。YingSong等[37]首次开发了在红酒中提取苏丹染料的方法，最后用高效液相色谱进行检测。以1-十二烷基-3-甲基咪唑溴（[C12MIM]br）作为萃取剂，加入六氟磷酸铵（[NH4][PF6]）后目标物转移到疏水性固态离子液体中。对萃取溶剂的种类和用量、微波功率和辐照时间、离子交换试剂（[NH4][PF6]）的用量、样品溶液的酸碱度和离子强度等几个实验参数进行了优化。结果显示：在最优的实验条件下，测定的分析物的线性范围为0.5-100g/L，相关系数为0.9995-0.9999。苏丹红一号、苏丹二号、苏丹三号和苏丹四号的检测限分别为0.19、0.18、0.24和0.16g/L。同时获得了令人满意的回收率78.5-106.8%，相对标准偏差小于9.7%。Nebiye等[38]研究了一种简单、灵敏的基于超分子溶剂的分散液液微萃取方法，用于罗丹明b的分离和预浓缩，然后采用紫外分光光度计对其进行定量检测。该微萃取方法是在室温下实现的，并在558nm下采用紫外分光光度法进行分析。优化了酸碱度、样品用量、洗脱液用量、离心时间、超声时间等参数对提取率的影响。实验结果表明：检出限和定量限分别为0.49g/L和1.47g/L。预浓缩因子为30，相对标准偏差为5.8%。2.6创新点（1）本研究首次将低分子有机物/无机盐双水相萃取体系与紫外分光光度计结合起来用于提取和检测食品中的非食用色素罗丹明b。本研究采用清浊点滴定的方法对低分子有机物/无机盐双水相体系进行了双节线数据的测定，并进行了相图的绘制。本研究考察了硫酸铵、磷酸氢二钾、柠檬酸、氯化钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠六种盐和乙腈、乙醇、异丙醇三种低分子有机溶剂的形成双水相的能力。本研究选用乙腈/硫酸铵双水相体系萃取罗丹明b，并绘制罗丹明b标准曲线，采用固定一种成分的方法考察了乙腈/硫酸铵双水相体系乙腈的用量、硫酸铵的用量和体系的温度对罗丹明b的提取效果的影响。本研究操作简便、快速、溶剂可回收利用，降低了成本，为其他体系溶剂回收难的问题给予了可行的办法。第三章低分子有机物/无机盐双水相体系成相能力的研究3.1实验试剂与仪器3.1.1实验试剂表3-1试剂种类试剂名称试剂规格生产厂家氯化钠分析纯天津大茂化学试剂有限公司硫酸铵分析纯国药化学试剂有限公司氯化钾分析纯天津光复科技有限公司柠檬酸三钠分析纯天津市福晨化学试剂厂磷酸氢二钾分析纯北京化工厂磷酸二氢钾分析纯北京化工厂硫酸钾分析纯北京化工厂柠檬酸分析纯北京化工厂乙腈分析纯北京化工厂乙醇分析纯北京化工厂异丙醇分析纯北京化工厂3.1.2实验仪器表3-2仪器种类仪器名称仪器型号生产厂家数控超声波清洗器KQ5200DE昆山市超声仪器有限公司数显恒温磁力搅拌器85-2常州荣华仪器制造有限公司漩涡混合器XW-80A上海米青科实业有限公司环水式真空泵SHB-2000巩义予华仪器有限公司超纯水制备机XJb-X日本移液枪H33766E安捷伦公司万分之一分析天平JA1003上海越平有限公司组织捣碎机EQ0101北京东信力搏科技有限公司pH计雷磁PHS-3C上海仪电科学仪器股份有限公司3.2无机盐分相能力的考察本节主要考察以硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、氯化钠、柠檬酸三钠、碳酸氢钠为盐相，以乙腈、乙醇、异丙醇为有机相，采用的方法是分别称取一定质量的六种无机盐加入到烧杯中，加入超纯水配制成盐溶液，恒温25℃。再向其中逐渐加入有机溶剂，充分搅拌混合，当滴加有机溶剂使体系刚好由澄清变浑浊后，向体系滴加一滴超纯水可以使体系由浑浊变为澄清，再滴加有机溶剂体系又可以变浑浊，反复数次，则说明盐与有机溶剂可以形成双水相，否则将无法形成双水相。最后发现只有硫酸铵、磷酸氢二钾、柠檬酸三钠和乙腈，硫酸铵、磷酸氢二钾、和异丙醇可以形成双水相，结果如下表所示。表3-3无机盐与有机溶剂成相情况试剂硫酸铵磷酸氢二钾磷酸氢二钠氯化钠柠檬酸三钠碳酸氢钠乙腈是是否否是否乙醇否否否否否否异丙醇是是否否否否3.3低分子有机物分相能力的考察本节主要考察乙腈、乙醇、异丙醇的成相能力，采用固定有机相的方法，量取一定体积的三种有机溶剂加入到烧杯中，加入超纯水配制成溶液，恒温25℃。向其中逐滴加入配制好的饱和盐溶液，边滴加边搅拌，当体系刚好变浑浊后，再向体系滴加一滴超纯水可以使体系由浑浊变澄清，再滴加饱和盐溶液体系又可以变浑浊，反复数次，则说明该有机溶剂可以形成双水相，否则将无法形成双水相。3.4研究结论本章主要研究的是低分子有机物和无机盐的成相能力，结果可以看出不同的成相盐和有机物之间的形成双水相的能力是不同的。主要是由于体系不同组分的性质差异造成的。第四章低分子有机物/无机盐双水相体系相图及数据拟合双水相萃取体系是一种基于液-液萃取发展起来的样品前处理技术，常用于食品中农兽药残留的检测、贵重金属的分离、污水处理和各种其他用途。本研究的低分子有机物/无机盐双水相体系具有价格低廉易于回收，因其具有较高的回收率，易于扩大规模，所以具有更好的应用前景。低分子有机物/无机盐双水相体系常用的有机相有乙腈、乙醇、异丙醇等。这些低分子有机物的粘度非常小，所以在萃取过程中便于物质传质，沸点低，有利于回收，为双水相体系成相物质的回收提供了参考。并且相对于其他双水相成相物质，低分子有机物的毒性更小，有利于实验人员的健康以及避免环境污染。综上所述，本章主要研究了三种低分子有机物，乙腈、乙醇、异丙醇与三种成相盐，硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠构成双水相的能力并测定了双节线数据绘制相图，为工业应用提供参考。4.1实验试剂与仪器表4-1试剂与仪器试剂与仪器名称试剂规格与仪器型号生产厂家硫酸铵分析纯国药化学试剂有限公司柠檬酸三钠分析纯天津市福晨化学试剂厂磷酸氢二钾分析纯北京化工厂乙腈分析纯北京化工厂异丙醇分析纯北京化工厂恒温水浴锅JHH6A嘉兴俊思电子有限公司移液枪H33766E安捷伦公司万分之一分析天平JA1003上海越平有限公司4.2双节线数据测定方法本研究采用清-浊点滴定的实验方法测定了目标体系的双节线数据。精准称量一定质量（m1）的50%有机溶剂于烧杯中并控制体系温度在25℃，向其中加入一定质量的40%盐溶液，充分搅拌后观察溶液由澄清刚好变为浑浊，记录加入的40%盐溶液的质量（m2）；然后再向体系中加入一定质量的超纯水，搅拌后体系由浑浊变为澄清，记录加入超纯水的质量（m3）。重复操作上述步骤，计算每次体系浑浊和澄清时加入的盐溶液的质量与加入的超纯水的质量，计算如下：成相盐质量分数：（其中i=1,2,3,...,n）4-1低分子有机物质量分数：（其中i=1,2,3,...,n）4-2分别以w1，w2为横纵坐标作图，得到的就是低分子有机物/无机盐体系的双节线图。4.3成相盐的盐析能力常用的比较成相盐的盐析能力的方法主要有以下几种：通过相图来研究低分子有机物/无机盐体系中的成相盐的盐析能力。通过相图中的双节线来判断，具体的做法是：在能形成双水相的前提下，固定Y轴低分子有机物的量在双节线上相区内考察盐的用量，越靠近双节线盐的用量越少说明盐的盐析能力越强。该方法简便直观，可以直接在双水相相图中比较成相盐的盐析能力。通过实验过程中的现象来判断成相盐的盐析能力。分析成相盐的盐析能力的最直观的方法就是观察他们形成双水相的上相的体积。具体做法是：在能形成双水相的前提下，采用相同的低分子有机物的量，相同的无机盐的量以及相同的水量，比较他们形成上相的体积大小，上相体积越小说明其成相盐的盐析能力越强。这种方法虽然简单，但不适用所有的体系。4.4双节线数据的测定4.4.125℃乙腈/硫酸铵体系的双节线数据及相图通过清浊点滴定的方法我们得到25℃（室温）下乙腈/硫酸铵双节线数据如下表4-1所示。表4-225℃下乙腈/硫酸铵双节线数据序号（NH4）2SO4（wt%）C2H3N（wt%）H2O（wt%）10.05810.84670.095220.09680.70510.198130.12880.62530.245940.15430.56170.284050.17500.50980.315260.19750.47930.323270.21740.45230.330380.25110.40640.342590.28460.37670.3387100.32340.33640.3402110.32660.31710.3563120.36180.29270.3455130.38620.26780.3460140.40210.25460.3433150.45570.22120.3231160.53390.18510.2810通过以上由清浊点滴定得到的双节线数据我们绘制了乙腈/硫酸铵双水相相图如图4-1所示。图4-1乙腈/硫酸铵双水相相图从相图中可以看出双节线的下方为单相区即不能形成双水相的的区域，双节线上方为两相区即可以形成双水相的区域。根据双水相相图以及双节线数据可知，在25℃是乙腈/硫酸铵双水相体系成相范围为：乙腈5.81%-53.39%，硫酸铵18.51%-84.67%，水9.52%-36.63%。4.4.225℃乙腈/磷酸氢二钾体系的双节线数据及相图通过清浊点滴定的方法我们得到25℃（室温）下乙腈/磷酸氢二钾双节线数据如下表4-2所示。表4-325℃下乙腈/磷酸氢二钾双节线数据序号K2HPO4（wt%）C2H3N（wt%）H2O（wt%）10.10670.76890.124420.14080.67670.182530.16760.60420.228240.19500.56230.242750.21280.51130.275960.25200.45410.293970.26840.42990.301780.30300.39710.299990.33260.36890.2985100.37330.33630.2904110.44320.29040.2664120.55890.22380.2173通过以上由清浊点得到的双节线数据我们绘制了乙腈/硫酸铵双水相相图如图4-2所示。图4-2乙腈/磷酸氢二钾双水相相图根据相图以及双节线数据可知，在25℃是乙腈/磷酸氢二钾双水相体系成相范围为：乙腈10.67%-55.89%，磷酸氢二钾22.38%-76.89%，水12.44%-30.17%。4.4.325℃乙腈/柠檬酸三钠体系的双节线数据及相图通过清浊点滴定的方法我们得到25℃（室温）下乙腈/柠檬酸三钠双节线数据如表3-3所示。表4-425℃下乙腈/柠檬酸三钠双节线数据序号Na3C6H5O7·2H2O（wt%）C2H3N（wt%）H2O（wt%）10.08350.76820.148320.13710.65210.210830.16380.58430.251940.19090.54480.264350.21460.51040.275060.23550.48000.284570.24790.44220.309980.28540.40730.307390.29890.38770.3134100.31110.36990.3190110.33240.33890.3287120.37770.29950.3228130.41970.27220.3081140.42580.26270.3115150.47570.23410.2902160.47830.22750.2942170.48060.22130.2981180.48500.20980.3052190.49430.20150.3042200.50630.19400.2997通过以上由清浊点滴定得到的双节线数据我们绘制了乙腈/硫酸铵双水相相图如图3-3所示。图4-3乙腈/柠檬酸三钠双水相相图根据相图以及双节线数据可知，在25℃是乙腈/柠檬酸三钠双水相体系成相范围为：乙腈8.35%-49.43%，硫酸铵20.15%-76.82%，水14.83%-32.87%。4.4.425℃异丙醇/硫酸铵体系的双节线数据及相图通过清浊点滴定的方法我们得到25℃（室温）下异丙醇/硫酸铵双节线数据如表4-4所示。表4-525℃下异丙醇/硫酸铵双节线数据序号（NH4）2SO4（wt%）C3H8O（wt%）H2O（wt%）10.19440.76610.039520.22330.70410.072630.24790.65140.099640.26910.60600.103050.28750.56650.146060.30360.53190.164570.31780.50130.180980.33070.47390.195490.33440.43930.2263100.36170.40740.2336110.37020.38910.2407120.39240.36390.2437130.39880.34930.2519140.41710.32880.2541150.43340.31060.2560160.44800.29430.2577170.46110.27960.2593180.47300.26630.2607190.49200.25020.2578200.51600.23240.2516通过以上由清浊点滴定得到的双节线数据我们绘制了乙腈/硫酸铵双水相相图如图3-4所示。图4-4异丙醇/硫酸铵双水相相图根据相图以及双节线数据可知，在25℃是异丙醇/硫酸铵双水相体系成相范围为：异丙醇19.44%-51.6%，硫酸铵23.24%-76.61%，水3.95%-26.07%。4.4.525℃异丙醇/磷酸氢二钾体系的双节线数据及相图通过清浊点滴定的方法我们得到25℃（室温）下异丙醇/磷酸氢二钾双节线数据如表4-5所示。表4-625℃下异丙醇/磷酸氢二钾双节线数据序号K2HPO4（wt%）C3H8O（wt%）H2O（wt%）10.10840.80830.083320.14290.71060.146530.17580.65500.169240.23510.58430.180650.25650.54640.178960.29940.49610.204570.33480.45430.122280.38250.40750.210590.42110.36940.2095100.45320.33790.2089110.48010.31130.2086120.51260.28310.2043130.53970.25960.2007140.56950.23590.1946150.59440.21620.1894160.62050.19690.1826通过以上清浊点滴定得到的双节线数据我们绘制了乙腈/硫酸铵双水相相图如图4-5所示。图4-5异丙醇/磷酸氢二钾双水相相图根据相图以及双节线数据可知，在25℃是异丙醇-磷酸氢二钾双水相体系成相范围为：异丙醇10.84%-62.05%，磷酸氢二钾19.69%-80.83%，水8.33%-21.05%。4.5结论本章共研究了三种无机盐与三种有机溶剂是否可以进行清浊点滴定进行相图的绘制。研究发现，乙腈可以与硫酸铵、磷酸氢二钾、柠檬酸三钠进行清浊点滴定，异丙醇可以与硫酸铵、磷酸氢二钾进行清浊点滴定。由清浊点滴定法测得了乙腈-硫酸铵、乙腈-磷酸氢二钾、乙腈-柠檬酸三钠、异丙醇-硫酸铵、异丙醇-磷酸氢二钾五种双水相萃取体系在25℃（室温）时的双节线数据，并根据双节线数据绘制了双水相相图。第五章乙腈/硫酸铵体系萃取罗丹明b罗丹明b是一种人工合成的非食用色素。在过去罗丹明b常被用来作为食品的染色剂，自从2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布罗丹明b作为3类致癌物，就禁止被添加到食品中了。但仍有不法分子将罗丹明b非法添加到食品中，所以建立一种简单、高效的乙腈/硫酸铵双水相体系萃取罗丹明b并采用紫外分光光度计对其进行定量分析。5.1实验试剂与仪器表5-1试剂与仪器试剂与仪器名称试剂规格与仪器型号生产厂家硫酸铵分析纯国药化学试剂有限公司乙腈分析纯北京化工厂罗丹明b5g/瓶德国恒温水浴锅JHH6A嘉兴俊思电子有限公司移液枪H33766E安捷伦公司万分之一分析天平JA1003上海越平有限公司组织捣碎机EQ0101北京东信力搏科技有限公司5.2实验方法5.2.1罗丹明b标准溶液的配制准确称取0.05g罗丹明b标准品加入50mL容量瓶中，稀释至刻度此时溶液的浓度为1.000g/L。在准确吸取此溶液1.0mL与100mL容量瓶中，稀释至刻度备用，此时溶液的浓度为10mg/L。5.2.2样品溶液的配制将一定量的辣椒样品于60℃烘箱中烘干，之后进行组织捣碎，将样品装入培养皿中，备用。取处理后的样品5g于100mL的烧杯中，加入50mL的罗丹明b标准溶液，充分混合烘干制得加标样品，备用。将处理好的加标样品于200mL烧杯中，加入100mL水充分混合静置后取上清液定容到200mL容量瓶中，制得样品溶液。5.2.3提取方法根据相图的建立分析我们最终选用乙腈/硫酸铵双水相体系来萃取罗丹明b。按照比例配置50mL的乙腈/硫酸铵双水相体系与容量瓶中，将其转移到烧杯中加入处理好的辣椒样液，恒温水浴30min后，记录上下相体积比R，以及取样分析上下相罗丹明b含量，分配系数K，回收率Y计算公式如下：5-15-25-3式中：R-上下相比K-分配系数Y-回收率V0-处理好的辣椒样液的体积Vt-上相体积Vb-下相体积C0-处理好的辣椒样液中罗丹明b的浓度Ct-上相中罗丹明b浓度Cb-下相中罗丹明b浓度5.2.4罗丹明b标准曲线的绘制标准曲线绘制准备5支10mL比色管备用，分别准确吸取1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL的10mg/L的标准溶液于10mL比色管中，加超纯水定容至刻度，在550nm下测得吸光度，绘制标准曲线见图5-1。图5-1罗丹明b标准曲线回归方程：y=0.23053x-0.02871R2=0.99726其中：y是罗丹明b浓度，x是吸光度。5.3结果与讨论5.3.1硫酸铵的质量对萃取的影响双水相体系的硫酸铵的用量会影响两相间的电势差，从而影响罗丹明b在两相间的分配。首先我们优化的是无机盐的质量对回收率的影响，采用的是固定乙腈的量的方法，来考察无机盐的质量对回收率的影响，数据如表5-1所示。从图5-2中可以看出，随着硫酸铵用量的增加罗丹明b的回收率越高，当硫酸铵的质量分数达到28%时回收率达到最大，继续增加硫酸铵的量回收率反而略有下降，可能是由于盐的量过大导致上相体积变大，富集倍数变小，所以影响了回收率。根据图中罗丹明b的回收率我们最终选用硫酸铵的质量分数28%。表5-2硫酸铵质量分数对罗丹明b萃取率的影响乙腈(wt%)硫酸铵(wt%)水(wt%)Vt(mL)Vb(mL)Ct(mg/L)Cb(mg/L)RKY20.020.060.03.053.47.07540.49830.056214.19910.678822.058.04.052.45.05280.30030.076316.82580.645824.056.04.351.44.65680.40880.083711.39140.656726.054.06.0494.04860.48420.12248.36140.771028.052.06.0474.70390.23900.127619.68160.914730.050.06.0464.40690.39460.130411.16800.8506图5-2硫酸铵质量分数对回收率的影响5.3.2乙腈浓度对萃取的影响与硫酸铵一样，双水相体系形成的另一关键乙腈的用量也对回收率有明显的影响。乙腈在不同浓度的盐溶液中的溶解度不同，其用量会影响双水相的疏水性，从而影响罗丹明b在两相的分配。我们采取与上述同样的方法，固定硫酸铵的量，考察乙腈的质量对回收率的影响，数据如下表4-2所示。结果如图5-3所示，随着乙腈质量分数的增加，回收率有上升的趋势，当乙腈的用量在24%时，罗丹明b的回收率达到最高值。继续增加乙腈，罗丹明b的提取效率略有下降。这可能与乙腈易挥发的性质有关，同时根据实验中的现象可知乙腈的用量增大上相体积明显变大，导致富集倍数有所下降影响提取效率。所以，根据罗丹明b的回收率我们最终选用乙腈的质量分数24%。表5-3乙腈质量分数对罗丹明b萃取率的影响硫酸铵(wt%)乙腈(wt%)水(wt%)Vt(mL)Vb(mL)Ct(mg/L)Cb(mg/L)RKY28.016.056.03.052.45.80240.12590.057346.08740.558818.054.04.651.25.11410.13530.089837.79820.742620.052.06.052.54.11930.18250.114322.57150.801622.050.06.053.23.91650.12590.112931.10800.750924.048.08.846.53.02550.10700.189228.27570.860226.046.09.4452.61050.09760.208926.74690.7788图5-3乙腈质量分数对回收率的影响5.3.3体系温度对萃取的影响确定乙腈/硫酸铵/水三者的最佳配比后，我们考察了体系的温度对罗丹明b回收率的影响。温度会影响低分子有机物/无机盐双水相体系的理化性质以及罗丹明b的溶解度，因此本研究考察了温度为20-35℃时对罗丹明b提取效率的影响。从图5-4中可以看出在25℃（室温）下罗丹明b有最大回收率。最终我们选择体系温度为25℃。表5-4温度对罗丹明b萃取率的影响乙腈(wt%)硫酸铵(wt%)水(wt%)温度(℃)Vt(mL)Vb(mL)Ct(mg/L)Cb(mg/L)RKY24.028.048.020.09.047.02.21450.48890.19154.52960.648025.09.047.52.60110.14950.189517.39870.763030.08.6472.22400.48890.18304.54890.613035.08.447.52.62000.52190.17685.02010.7180图5-4温度对回收率的影响5.4结论本章主要考察的是影响罗丹明b萃取效率的因素，并对双水相萃取条件进行优化。实验结果表明，硫酸铵的用量、乙腈的用量、体系的温度对罗丹明b的提取效率影响较大。最终确定最优的萃取条件为双水相体系中乙腈的质量分数24%、硫酸铵的质量分数28%、水的质量分数42%，体系的温度25℃。第六章结论本文主要研究的是低分子有机物和无机盐的成相能力，结果表明：可以看出不同的成相盐和有机物之间的形成双水相的能力是不同的。主要是由于体系不同组分的性质差异造成的。本研究考察了不同体系是否可以进行清浊点滴定。研究发现，乙腈可以与硫酸铵、磷酸氢二钾、柠檬酸三钠进行清浊点滴定，异丙醇可以与硫酸铵、磷酸氢二钾进行清浊点滴定。由清浊点滴定法测得了乙腈-硫酸铵、乙腈-磷酸氢二钾、乙腈-柠檬酸三钠、异丙醇-硫酸铵、异丙醇-磷酸氢二钾五种双水相萃取体系在25℃（室温）时的双节线数据，并根据双节线数据绘制了双水相相图。本研究对影响罗丹明b萃取效率的因素进行考察，并对双水相萃取条件进行优化。实验结果表明，硫酸铵的用量、乙腈的用量、体系的温度对罗丹明b的提取效率影响较大。最终确定最优的萃取条件为双水相体系中乙腈的质量分数24%、硫酸铵的质量分数28%、水的质量分数42%，体系的温度25℃。致谢本研究的顺利完成离不开长春工业大学化学与生命科学学院的支持。同时我要感谢我的导师王志兵老师，王老师给我提供了很多实验专业技术上的帮助。特别是王老师对我实验技能和实验态度上的指导，对我以后的学习和生活都具有很大的帮助。在此我还要感谢食品系的所有老师们，你们严谨的治学态度和渊博的专业知识，不仅使我对食品前言技术有了更进一步的理解，让我有机会真正接触到有关食品的专业知识。使我能够学以致用，提高自己的实际动手操作能力。我还要特别感谢陪伴我大学四年的各位同学们，在我的毕业论文完成过程中，同组的多位同学为我提供了帮助，正是因为有你们的存在才是我的大学生活充满色彩，在此表示感谢。最后再次感谢长春工业大学以及所有师生的支持。参考文献LiY,YangS,ZhangW,etal.Phaseequilibriaandsalteffectontheaqueoustwo-phasesystemofethanol

+

2-propanol

+

salt[(NH4)2SO4/Na2SO4]

+

water[J].JournalofThermalAnalysis&Calorimetry,2016,127(3):1-15.Xiao-QianF,NaM,Wei-PengS,etal.Microwaveandenzymeco-assistedaqueoustwo-phaseextractionofpolyphenolandluteinfrommarigold(TageteserectaL.)flower[J].IndustrialCropsandProducts.ZhiW,DengQ.PurificationofsalvianolicacidBfromthecrudeextractofSalviamiltiorrhizawithhydrophilicorganic/salt-containingaqueoustwo-phasesystembycounter-currentchromatography.[J].JournalofChromatographyA,2006,1116(1):149-152.JiangB,LiZG,DaiJY,etal.Aqueoustwo-phaseextractionof2,3-butanediolfromfermentationbrothsusinganethanol/phosphatesystem[J].PROCESSBIOCHEMISTRY,2009,44(1):112-117.CarabiasmartínezR,GarcíahermidaC,RodríguezgonzaloE,etal.Determinationofherbicides,includingthermallylabilephenylureas,bysolid-phasemicroextractionandgaschromatography-massspectrometry.[J].JournalofChromatographyA,2003,1002(1):1-12.BerradaH,FontG,J.CMoltó.Applicationofsolid-phasemicroextractionfordeterminingphenylureaherbicidesandtheirhomologousanilinesfromvegetables[J].JournalofChromatographyA,2004,1042(1-2):9-14.Escuderos-MorenasML,Santos-DelgadoMJ,Rubio-BarrosoS,etal.Directdeterminationofmonolinuron,linuronandchlorbromuronresiduesinpotatosamplesbygaschromatographywithnitrogen-phosphorusdetection.[J].JournalofChromatographyA,2003,1011(1):143-153.杨国伟,张烨.HPLC法测定不同基质样品中罗丹明B含量[J].山西职工医学院学报,2018,v.28(02):99-100.金龙柏,王玉立.高效液相色谱法测定辣椒粉中的罗丹明B[J].现代食品,2017(23):90-92.张春玲,蒲彦利,王红波,etal.高效液相色谱法测定薯片中9种工业染料[J].中国卫生检验杂志,2017(21):46-48+70.SahuAK,SahuGK,DashDK,etal.AssessmentofinVitroNaringeninReleasefromSolidLipidNanoparticlesandKineticModelProfiling:AppliedUltraviolet-VisibleSpectrophotometer[J].IndianDrugs.2017,54(11):46-57.JohnsonKS,ColettiLJ,JannaschHW,etal.Long-TermNitrateMeasurementsintheOceanUsingtheinsituUltravioletSpectrophotometer:SensorIntegrationintotheAPEXProfilingFloat[J].JournalofAtmospheric&OceanicTechnology.2013,30(8):1854-1866.TumirahK,SalamahS,RozitaA,etal.Determinationof2-thiocyanomethylthiobenzothiazole(TCMTB)intreatedwoodandwoodpreservativeusingUltraviolet-visiblespectrophotometer[J].WoodScience&Technology.2012,46(6):1021-1031.HuangYS,ZhiYF,KongSY,etal.Plasmaglutathioneofpatientswithcoronaryheartdiseasemeasuredbyfluorospectrophotometer[J].GuangPuXueYuGuangPuFenXi=GuangPu.2006,26(5):936-940.李占彬,杨鸿波,谭红,etal.超声提取-液相色谱质谱法同时测定辣椒制品中5种非法添加染料[J].贵州科学,2012,30(6):30-34.李军德,王亚楠,宋吉英.超声-微波协同萃取-液相色谱法检测口红中的4种色素[J].化学试剂,2018(12):1169-1172.苏日辉,阮贵华,曾令镇,etal.超声辅助分散乳液微萃取/高效液相色谱法同时测定辣椒粉中的5种染色剂[J].分析测试学报,2015,34(5):546-551.ChenX,LiX,ZhaoY.Applicationofdispersivesolid-phaseextractionandliquidchromatography-tandemquadrupolemassspectrometryin15dyesandpigmentsofwolfberry[J].WeiShengYanJiu=JournalOfHygieneResearch.2016,45(5):811-816.ChenXH,ZhaoYG,ShenHY,etal.Fastdeterminationofsevensyntheticpigmentsfromwineandsoftdrinksusingmagneticdispersivesolid-phaseextractionfollowedbyliquidchromatography-tandemmassspectrometry[J].JournalOfChromatographyA.2014,1346:123-128.YangW,WangJ,LiX,etal.Anewmethodresearchfordeterminationofnaturalpigmentcrocinyellowinfoodsbysolid-phaseextractionultrahighpressureliquidchromatography[J].JournalofChromatographyA.2011,1218(11):1423-1428.AsfaramA,GhaediM,GoudarziA.Optimizationofultrasound-assisteddispersivesolid-phasemicroextractionbasedonnanoparticlesfollowedbyspectrophotometryforthesimultaneousdeterminationofdyesusingexperimentaldesign[J].UltrasonicsSonochemistry.2016,32:407-417.ZhangH,ZhuS,ZhouJ,etal.Liquid–liquidmicroextractionofsyntheticpigmentsinbeveragesusingahydrophobicdeepeutecticsolvent[J].FoodChemistry.2018,243:351-356.PA.Albertsson,Partitionofcellparticlesandmacromolecules,thirded.,Wiley,NewYork[J].1986.CavalcantiM,PortoT,NetoB,etal.Aqueoustwo-phasesystemsextractionofa-toxinfromClostridiumperfringenstypeA,J.Chromatogr[J].2006:135–140.WalterD,BrooksD.Fisher,PartitioninginAqueousTwo-phaseSystems:Theory,Methods,Uses,andApplicationstoBiotechnology,AcademicPress,Orlando[J].1985.WanJ,LiuG,XuX,etal.SimplexOptimizationforAloe-EmodinSeparationandPurificationUsingAqueousDouble-PhaseExtractionSystem[J].JournalofLiquidChromatography&RelatedTechnologies.2014,37(5):653-663.DuP,SunP,SunS,etal.Separationandpurificationoffoot-and-mouthdiseasevirusbymultiple-stageaqueoustwo-phaseextractionsystem[J].ProcessBiochemistry.2019,77:143-150.JiangY,LiS,NingZ.ExtractionandpurificationofisochlorogenicacidCfromChrysanthemummorifoliumusingionicliquid‐basedultrasound‐assistedextractionandaqueoustwo‐phasesystem[J].