糖尿病肾病模型的建立及评价

糖尿病肾病模型的建立及评价

糖尿病性肾炎（dn）是糖尿病的严重并发症。并发症率约为20%，约为5%8%的患者死于患有尿毒症的药物综合征。目前DN的防治已成为国内外研究的热点，而建立较好的DN模型是研究DN发病机制及防治的重要手段。目前有关DN的实验研究，模型建立方法各异，文献表明，单侧肾脏切除术后腹腔或尾静脉注射链脲佐菌素(streptomycin,STZ)的方法报道较多，为近年来研究DN的主要造模方法。但实验动物行单侧肾脏切除术后，死亡率高。目前STZ的给药途径有腹腔和尾静脉2种，不同给药途径对模型稳定性的影响有待于探讨。为此本实验采用单侧肾脏结扎术后，STZ诱导的方法。通过对血糖（glucose,Glu）及肌酐清除率（creatinineclearance,Ccr）的观察，探讨了单侧肾脏结扎术后不同给药途径对模型的稳定性及可重复性的影响。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验动物，包括动物，包括动物，也包括动物选用SD大鼠，雄性21只，体重（250±20)g，购自北京大学医学部实验动物科学部，实验动物批号SCXK（京）2002-0001。适应性平衡饲养1周后，用于试验。1.1.2试剂和测定试剂STZ购自Sigma公司，-20℃保存；尿蛋白(urineprotein,Upro)试纸购自广州市珠江生化试剂有限公司；肌酐（creatinine）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。2%STZ溶液配制：2gSTZ:100ml0.1M枸橼酸—枸橼酸钠缓冲液（pH4.2），使用前10min配制。1.1.3主要设备乐康全活力型血糖仪及乐康全试纸,德国；HZS-H水浴振荡器，上海；UV-Vis8500型紫外分光光度计，上海。1.2方法1.2.1小组将实验动物按体重随机分为空白对照组（N）、腹腔模型组（CF）及尾静脉模型组（CW)3组，每组7只。1.2.2模型建立及建立实验大鼠禁食12h后，CF组、CW组大鼠10%水合氯醛300mg/kg体重腹腔麻醉下行左侧肾脏结扎术,结扎方法为：沿肾蒂同时结扎肾脏动静脉及输尿管。N组大鼠不做手术处理。术后2周，大鼠禁食18h,CF组一次性腹腔注射2%STZ50mg/kg体重，即具体给药量为2.5ml/kg体重；CW组一次性尾静脉注射2%STZ40mg/kg体重，即具体给药量为2.0ml/kg体重；N组腹腔注射枸橼酸缓冲液2.5ml/kg体重。注射药物后大鼠自由摄食水。以造模72h非空腹尾静脉血糖水平≥13.8mmol/L作为模型成立选择标准。CF组模型8周成活率为90%。1.2.3血胱氨酸组ccr大鼠模型成立后，代谢笼收集24h尿液，行Upro定性检测并记录尿量，取尿样-20℃保存待测定尿肌酐（urinecreatinine,Ucr）。内眦取血，4℃过夜，3500r/min离心15min，收集血清，-20℃保存，待测定血肌酐（serumcreatinine,Scr）。依公式：Ccr=Ucr×24h尿量/Scr计算Ccr。同时对实验大鼠进行10d内非空腹尾静脉Glu动态变化的观测。1.2.4测定的肌腱采用苦味酸法，依试剂盒操作要求进行。1.2.5统计学分析实验数据以百分率及±s表示,采用SPSS11.5统计软件分析，组间比较采用t检验，百分率比较采用确切概率法。并比较各组10d内平均Glu的变异情况。2结果2.1表1显示了模型成功的比较，验证了两组模型的成功率p0.052.2比较的目造模72h后，CF组Upro定性试验呈阳性反应，但强弱不等。N组Upro定性试验呈阴性反应。2.3显著差异检验如表2所示，CF组10d内平均Glu大于CW组，呈显著差异P<0.05。CF、CW两组10d内Glu变异系数的比较表明：CF组变异系数小于CW组，且从图1、2可以看出CF组的Glu随时间的变化较一致。2.4n和cf两组ccr的比较如表3所示，N、CF两组Ccr的比较表明：与N组比较，CF组Ccr升高，呈显著差异P<0.05。3单次给药途径及方式DN是DM严重的微血管并发症，是由糖代谢异常引起的一系列代谢紊乱导致的肾小球硬化，主要是指肾小球毛细血管基底膜增厚、系膜区基底膜样物质沉积。随着对DN发病机制的深入研究，DN治疗药物的筛选及其药理研究也不断增多,成功地模拟、建立理想的动物模型是研究DN的关键。目前，糖尿病动物模型制备主要采用化学药物诱导的方法。采用四氧嘧啶损害胰岛β细胞功能的模型制备是最早的糖尿病制备法，因其对肝肾损害较大，不利于糖尿病并发症的研究，已很少应用。STZ为四氧嘧啶的换代药物，它不仅具有高特异性杀伤胰岛β细胞作用，对肝肾损害亦明显小于四氧嘧啶，是近年来诱导糖尿病发生的首选药物。目前国内有关DN实验模型制备主要采用2种：（1)STZ诱导DM，伴随病情发展使之发生DN。（2）切除单侧肾脏，再给予STZ直接诱导DN。比较2种造模方法：前者在糖尿病发展至肾小球基底膜增厚一般需要3～6个月。近有文献报道单纯腹腔注射≥60mg/kg体重STZ诱导糖尿病大鼠发病1周后肾小球直径开始增加、基地膜开始增厚，可以用于研究糖尿病早期肾脏改变。而后者人为切除单侧肾脏，造成对侧肾脏肥大、高滤过，在此基础上给予STZ直接诱导DN，缩短了DN发生的早期阶段，能够较好地模拟DN，但模型成活率低（据经验单侧肾脏切除术+STZ诱导法4周存活率为50%）。而采用单侧肾脏结扎法+STZ诱导DN模型国内尚未见报道。为此本实验以单侧肾脏结扎法代替切除术，配合STZ诱导的方法制备DN模型，对不同给药途径及给药剂量诱导模型血糖及成模率进行比较，并在此基础上对CF模型鼠进行Upro定性及Ccr的观察，探讨了该模型的稳定性及可行性。结果表明：2组模型大鼠，模型成功率比较显示：CW组及CF组模型成功率无显著差异（P>0.05）。但2组间Glu比较显示：CF组10d平均Glu大于CW组，呈显著差异（P<0.05）。Glu变异系数比较显示：CF组模型Glu变异系数小于CW组，变化趋势稳定。考虑可能与STZ剂量及经尾静脉药物吸收不完全有关系。可以认为不同给药途径、不同给药剂量均可以使单侧肾脏结扎法大鼠的血糖达到DM模型遴选标准，但与尾静脉注射相比，腹腔注射2%STZ50mg/kg体重的方法更适合于实验研究。肌酐是人体内肌酸代谢产物，不与血浆蛋白结合，可自由通过肾小球，不被肾小管重吸收，在Scr无异常增高时不为肾小管排泄。所以可以用Ccr来表示肾小球滤过率（glomerularfiltrationrate,GFR）,作为判断DN出现肾脏肥大、高滤过的指标。Upro的出现反映肾小球滤过屏障的损伤程度。因此本实验在考察两模型鼠Glu变化的基础上，对正常及腹腔模型鼠进一步进行Upro定性及Ccr的比较。结果表明：CF组大鼠Upro定性呈阳性，Ccr显著升高（