HYT 229-2018 海洋生物活性物质标准样品结构确证方法

海洋生物活性物质标准样品结构确证方法2018-02-13发布I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家海洋局第三海洋研究所提出。本标准由海洋生物资源保护与开发分技术委员会(SAC/TC283/SC6)归口。本标准起草单位：国家海洋局第三海洋研究所、国家海洋标准计量中心。1海洋生物活性物质标准样品结构确证方法本标准规定了海洋生物活性物质标准样品结构的确证程序、确证内容、确证方法和要求。本标准适用于海洋生物活性物质标准样品结构的确证。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。海洋生物活性物质marinebioactivematerial对人、动物、植物和微生物的生命活动有影响的海洋生物组分或代谢产物，来源于海洋生物或其衍生物且分子量小于1500Da。结构确证structureconfirmation经过物理、化学的方法，准确无误地确证目标化合物的结构过程。波谱分析spectrumanalysis主要是以光学理论为基础，以物质与光相互作用为条件，建立物质分子结构与电磁辐射之间的相互关系，从而进行物质分子几何异构、立体异构、构象异构和分子结构分析和鉴定的方法。对照品referencesubstance用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的对照物质。标准样品referencematerial;RM一种或多种规定特性足够均匀和稳定的材料，已被确定其符合测量过程的预期用途。如果一对分子的组成和原子的排列方式完全相同，但如同左手和右手一样互为镜像，在三维空间里不能重叠，这对分子互称手性对应异构体，有手性对应异构体的化合物称为手性化合物。3结构确证3.1结构确证程序3.1.1一般目标化合物应按以下程序进行结构确证：a)质谱或高分辨质谱确定目标化合物的分子量、分子式，根据碎片峰及裂解规律推导部分结构信息；b)核磁共振谱的氢谱、碳谱和其他的原子谱，以及相关的二维谱，确定目标化合物的分子结构；2c)红外光谱确定目标化合物的官能团；e)元素分析确定目标化合物各元素的组成比例，推导分子式及纯度信息。3.1.2手性化合物除按3.1.1规定的程序进行分析外，还应按以下其中一种程序确定目标化合物的手性构型：a)圆二色谱确定目标化合物的立体构型；b)比旋度确定目标化合物的立体构型。3.2.1.1对于一般目标化合物而言，可以先采用HPLC法在相同条件下进行分析，通过保留时间比对，对化合物进行初步定性。或者将一般目标化合物和对照品在完全相同条件下进行核磁共振谱、质谱等谱图的比对，若两者间的谱图完全一致，则可确定目标化合物与对照品为同一物质。3.2.1.2对于目标手性化合物而言，除了将目标手性化合物和对照品在完全相同条件下进行核磁共振谱、质谱的比对之外，还需要进行圆二色谱比对或比旋度数值比对，若目标手性化合物的核磁共振谱数据、质谱数据、圆二色谱、比旋度数值或X-Ray单晶衍射的Flack值与对照品的数据完全一致，则可确定目标手性化合物与对照品为同一手性化合物。3.2.2.1对于一般目标化合物应按照3.1的要求对目标化合物进行结构确证。一般目标化合物的质其分子结构，并与文献报道的数据取得一致。3.2.2.2对于手性化合物，应按照3.1.2的要求对目标化合物进行结构确证。其质谱、核磁共振谱、红外征信息，方可确定其分子结构，并与文献报道的数据取得一致。3.3化合物其他信息确证4海洋生物活性物质化合物的结构确证方法按目标化合物的已知性质选择离子源：a)对于极性强的目标化合物，如肽，糖，核苷等，宜采用ESI(电喷雾电离，Electrospraylonization)电离源，选择正离子模式或负离子模式；b)对于低极性热稳定的目标化合物，宜采用APCI(大气压化学电离源，AtmosphericPressureChemicallonization)电离源，选择正离子模式或负离子模式；c)对于易于气化的目标化合物，宜采用EI(电子轰击离子源，Electronimpactionsource)电d)对于高极性、大分子量、难挥发或热稳定性差的目标化合物，宜采用FAB(快原子轰击电离源，Fastatombombarbmentionization)、FD(场解吸电离源，Fielddes34.2核磁共振光谱分析应使用不低于400MHz的NMR仪。按目标化合物的已知性质，选择¹HNMR,³CNMR,DEPT,H-HCOSY,HMQC,HMBC和NOE中的一种或多种谱图进行核磁共振光谱分析。供氘交换后的'H谱。b)通过¹HNMR谱获得目标化合物的氢原子化学位移值和质子个数。c)通过¹³CNMR谱获得目标化合物的碳原子化学位移值和碳原子个数。d)通过杂原子谱获得目标化合物的杂原子化学位移值和杂原子个数。e)复杂结构化合物，当一般的¹H和1³C谱不能对每个质子和碳原子明确归属时，或图谱峰过于拥挤，应考虑采用合适的其他技术确证，尤其是二维谱的测定和结构解析，如¹H谱中的各种去属，或在'H谱和¹³C谱数据表中增加相应的栏目列出(详见附录A)。f)对于复杂结构的化合物，需要增加HMBC和NOE数据；对于核磁波谱无法确定的化合物，需4.3红外吸收光谱分析固体样品采用溴化钾压片法，液体样品采用液膜法。对具有足够均匀的一种或多种化学的、物理的、生物学的、工程技术的或感官的性能特征图谱解析时，应尽可能归属每一官能团的特征谱及指纹谱，几何构型与立体构象信息亦应有一定解析。对于在200nm～800nm有紫外-可见吸收的目标化合物，应测定其最大吸收峰对应的波长，最大吸收吸光度值应小于1,并计算lge。对于同一物质，不论浓度大小如何，最大吸收峰对应的波长(最大4.5熔点或折光率分析4.5.1对于固体性状的目标化合物，应测定其熔点。测定熔点时，在接近熔点前，升温速率应控制在每分钟0.5℃~1.5℃。供试品开始局部液化时(或开始产生气泡时)的温度作为初熔温度；供试品固体全部液化时的温度作为全熔温度。遇有固体消失不明显时，应以供试品分解物开始膨胀上升时的温度作为全熔温度。某些目标化合物无法分辨其初熔、全熔时，可以将其发生突变时的温度作为熔点。对融解后又固化并在更高温度时再次出现融解的物质，应记录双熔点现象。对于未到熔点就出现升华的物质，应密封在尽可能小体积的熔点测定管中。4.5.2对于液体性状的目标化合物，应测定其折光率。测定折光率时，滴加样品应注意切勿使滴管尖端直接接触镜面，以防造成割痕。滴加液体要适量，分布要均匀，对于易挥发液体，应快速测定折光率。测完后，应立即擦洗上下镜面，晾干后再关闭折光仪。在测定样品之前，对折光仪应进行校正。通常先4测纯水的折光率，将重复两次所得纯水的平均折光率与其标准值。记录折光率时，要注明测定环境的温度。4.6元素组成分析或高分辨质谱分析采用元素分析法可获得组成目标化合物的元素种类及含量，比较测试结果与理论结果差值的大小(一般对于纯有机物而言，偏差一般在千分之三以内；对于不稳定的油状有机物，偏差一般在千分之五以内),即可初步判定供试品与目标化合物的分子组成是否一致。对于因化合物自身结构特征而难于进行元素分析时，在保证高纯度情况下可采用高分辨质谱方法获得目标化合物元素组成的相关信息。4.7圆二色谱分析或旋光光谱分析4.7.1对于目标手性化合物，可进行圆二色谱测定。测定时若有对照品，则将对照品与目标手性化合物，在相同圆二色谱条件下，测定并比对谱图，以确证目标化合物的相对构型或绝对构型。测定时若没有对照品，则需要查阅与目标手性化合物结构相近或相似手性化合物的圆二色谱文献，根据文献报道的实验条件测试目标手性化合物的圆二色谱图，比对谱图，以间接确证目标化合物的相对构型或绝对构型。4.7.2对于目标手性化合物，也可测定其一定浓度下的旋光值。每次测定前应以溶剂作空白校正，测定后，再校正1次，以确定在测定时零点有无变动；如第2次校正时发现零点有变动，则应重新测定旋光度。配制溶液及测定时，均应调节温度至25℃±0.5℃(或各品种项下规定的温度)。供试物质应配制成澄清的溶液状态。如出现浑浊或含有混悬的小粒，应予以滤过，并弃去初滤液。表示物质的比旋度时应注明测定条件。5(资料性附录)二十二碳六烯酸甲酯(DHA甲酯)结构解析”A.1理化性质样品为淡黄色油状物，易溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷等有机溶剂，不溶于水。A.2红外吸收光谱(IR)A.2.1仪器型号：BrukerVERTEX70红外光谱仪。A.2.2测试条件：KBr压片法。A.2.3测试结果：见图A.1和表A.1。图A.1DHA甲酯的红外光谱图6吸收峰/cm-1基团强度√=cH伸缩振动SSyc=0伸缩振动—COO—SSSA.2.4.13013为烯烃中=C—H的伸缩振动。An_20120521_22144(21.494)Cm(2144:21-3934044274294474494694847A.3.4解释该化合物分子式C₂₃H₃₄O₂,分子量理342。测得的准分子离子峰m/z=343[M+H]+与其分子量相符。除m/z=343外，还可以见到该化合物脱甲氧基C—O—CH₃(31amu)的碎片峰(m/z=311),与该化合物含甲氧基的结构相符。A.4高分辨质谱DHA甲酯加钠离子(C₂₃H₃₄O₂Na+)的理论精确质量数为365.2457,高分辨质谱测得的DHA甲酯加钠离子精确质量数为365.2453,两者数据一致。A.5核磁共振谱A.5.1仪器型号：Bruker400MHz型核磁共振仪。图A.3DHA甲酯的'HNMR核磁共振谱图89图A.8DHA甲酯的HMBC(局部)谱图A.5.5解释化合物DHA甲酯的分子式为C₂₃H₃₄O₂,则不饱和度Ω=7。根据³CNMR,7个不饱和度分别是由12个烯碳CH(6个不饱和度)和1个羰基碳C(1个不饱和度)组成。根据¹³CNMR和DEPT谱图数据¹HNMR和HMBC谱图数据(详见表A.2),可以确认单重峰δ3.68ppm(s,3H,OCH₃)是一个连着羰基的甲氧基—OCH₃(HMBC:δ3.68ppm质子峰和173.5ppm的酯键C峰有耦合)。三重峰δ0.99基(一CH₂—CH₃)Hz,-22CH₃)和五重峰δ2.09ppm(2H,p,J=7.6Hz,-21CH₂)相连的乙片段接在烯碳端(HMBC:H₂₂和C₁、C2₀有耦合，H₂₁和C2o、C₂有耦合)。同时，位于ppm(m,12H,6-CH=CH一)的多重峰指认为6个—CH=CH一的分子结构片段，经详细辨认其耦合裂分常数J=7.2Hz,也证实了此双键是顺式结构。分子中除去O=C,一OCH₃,-CH₂一CH₃和6个—CH=CH—的分子结构片段，还有7个亚甲基。¹HNMR显示2组多重峰δ2.81～2.87(m,10H,CH₂×5)、2.37～2.44(m,4H,CH₂×2),由化学位移和HMBC可以确认有5个CH₂分别位于五个烯键中间，而δ2.37～2.44指认为一CH₂—CH₂—分子片段，且此分子片段与羰基C₁有耦合作用，所以它们组成—CH₂—CH₂—C=O片段。综上所述，样品的核磁共振谱图(¹HNMR、¹³CNMR、DEPT、HMBC)所给出的结构信息与化合物DHA甲酯的化学结构式相符(如图A.9所示)。图A.9