药学本科毕业论文 化合物A联合 化合物 B对人肝癌HepG2细胞作用机制研究

1、沈 阳 药 科 大 学本 科 毕 业 论 文论文题目：化合物A联合 化合物 B对人肝癌HepG2细胞作用机制研究起止时间：2014 年10月26日2015年6月20日姓名学号：学院专业： 年级班级： 指导教师：XXX 副教授实习单位：XXX大学生命科学与生物制药学院药理系18沈阳药科大学本科毕业论文 目录目 录中文摘要1英文摘要2第1章 绪论3 1.1细胞凋亡3 1.2立题依据5第2章 实验部分62.1实验材料62.2实验方法72.3实验结果12第3章 结论与讨论173.1结论173.2讨论18参考文献21致谢23沈阳药科大学本科毕业论文 摘要摘 要原发性肝癌是世界常见的恶性肿瘤之一，也是我国

2、的高发恶性肿瘤，由于不易被早期诊断，进展迅速，术后容易复发、转移，因此预后较差。目前肝癌仍以外科手术为公认首选和主要的治疗手段，但由于很多肝癌患者确诊时已是中晚期，失去了手术治疗的机会并于诊断后1年内死亡，手术切除率30%，术后总体5年生存率仅30%40%。对于可手术的肝癌患者，术后复发、转移是影响治疗效果及预后的主要因素，对于不能手术的中晚期肝癌患者尚缺乏有效的治疗方法。传统的化疗、放疗对肝癌疗效欠佳，目前仍缺乏行之有效的化学预防和治疗靶位1。因而本课题是对化合物 A联合化合物 B对人肝癌HepG2细胞作用机制研究。本实验首先用MTT法分别测得不同浓度的A和B单独处理HepG2细胞及不同浓度

3、的A和B联合用药处理HepG2细胞死亡的影响。结果表明不同浓度的A和B单独处理HepG2细胞，增值抑制程度表现为时间剂量依赖效应，并且在A 6mol/L联合B 100mol/L协同作用最为显著。流式细胞仪检测细胞凋亡率显示，联合用药组凋亡率升高更为明显。Western Blot法检测蛋白显示，促凋亡相关蛋白Bax、FADD增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 表达减少。关键词 联合用药，细胞凋亡，作用机制沈阳药科大学本科毕业论文 英文摘要AbstractHepatocellular carcinoma (HCC) is the most common cancer in the world and an

4、 increased malignant illness in our country. Because of its aggressive biological behavior, rapidly progresses and delayed diagnosis, this malignancy has a grim prognosis even following surgical resection and has high disease-recurrence. Surgery is the first and most common therapy of HCC. Unfortuna

5、tely, the disease is usually detected at an advanced stage, and the major patients lose the chance of surgery, die within 1year after the diagnosis of their disease. Relative survivor are 30% and 30%40% respectively. The high disease recurrence and metastasis are the important reasons for effect and

6、 prognosis. Curative therapies are least effective for surgically cases. For these patients, medical treatments, including chemotherapy, chemo-embolization, ablation, radiotherapy, remain disappointing. Clearly, there is an urgent need for new therapies for this aggressive disease because effective

7、prevent and targets of therapy are unavailable. Therefore this issue is the mechanism of the Joint Drug B, Drug A, on HepG2 cells is significant. This article assessed the effects of drug A alone, drug B alone and combination of drug A and drug B on HepG2 cells with MTT assay, suggesting that A and

8、B have a maximal combinational effect at the dose of A 6mol/L and B 100mol/L ,respectively. Western Blotting analysis indicates that pro-apoptosis proteins include BAX and FADD are increasing and anti-apoptosis protein BCL-2 is reducing. Keyword Combination, apoptosis, the mechanism of action 沈阳药科大学

9、本科毕业论文 第一章 绪论第一章 绪论1.1细胞凋亡细胞凋亡定义、意义、形态学特征、作用通路、机理1.2立题依据先介绍下肿瘤的危害，再介绍下肝癌HCC（hepatic cell carcinoma)的危害。虽然有些临床治疗药物具有一定的疗效，但同时也会加重肝脏的损害。因此治疗肝癌药物与保肝药物合用起到减毒增效的作用对肝癌患者具有极其重要的临床意义。药物 A是一种独特的多靶点抗肿瘤药物，既抑制肿瘤细胞增殖又抑制了肿瘤血管的形成，从而抑制肿瘤的转移。Drug A 属于多酶抑制剂, 能抑制RAF-1、BRAF 丝氨酸/ 苏氨酸激酶的活性, 以及血管内皮生长因子( VEGF-2、VEGF-3) 、血小

10、板衍化生长因子( PDGF) 、受体酪氨酸激酶KIT、FMS 样酪氨酸激酶-3( FLT-3) 等多种受体的酪氨酸激酶活性。Drug A 具有抑制肿瘤细胞增殖和血管形成的双重作用, 即它一方面可以抑制受体酪氨酸激酶KIT 和FLT-3 以及RAF/MEK/ ERK 途径中丝氨酸/ 苏氨酸激酶, 抑制肿瘤细胞增生; 另一方面它可以通过上游抑制受体酪氨酸激酶VEGFR 和PDGFR, 及下游抑RAF/MEK/ ERK 途径中丝氨酸/ 苏氨酸激酶, 抑制肿瘤新生血管的形成和切断肿瘤细胞的营养供应而达到遏制肿瘤生长的目。因此它可以起到抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤细胞增值的双重作用。但在治疗的同时，药物 A

11、 也会使患者的转氨酶短暂性升高（22）、酯酶增加等，因此能加重对肝肾功能的损害。药物B能够抑制肿瘤受体型酪氨酸激酶 (receptor t yrosine kinase, RTK) 的活性，包括表皮生长因子受体 1(epidermal growth factor receptor 1, EGFR) 和胰岛素样生长因子1受体 (insulin-like growth fact or 1 receptor , IGF-1R) 及其下游信号分子的活化。此外，药物B可以选择性清除羟自由基(OH)，且对NF-B 有明显的抑制作用。研究表明，药物B有明显的保护和稳定肝细胞的作用，用于治疗急慢性肝炎、肝硬化

12、、肝中毒等病。对肝炎患者症状、肝功能均有明显的改善。在临床上的应用为对肝脏的保护作用。临床试用表明该药作用强，疗效显著。沈阳药科大学本科毕业论文 第二章 实验部分第二章 实验部分2.1实验材料一、细胞人肝癌HepG2细胞购于American Type Culture Collection (ATCC，Rockville，MD，USA)。接种在含10胎牛血清、2谷氨酰胺的1640培养液中，在37，5CO2培养箱中培养。二、药品及试剂Drug A、Drug B于无菌条件下，DMSO溶解后，用1640培养液稀释至所需浓度。1640培养基，美国Gibco公司（Grand Island，NY，USA）；

13、胎牛血清，购于北京元亨圣马生物技术研究所；胰蛋白酶、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、Hepes、二甲基亚砜（DMSO）、甲基噻唑蓝（MTT）、碘化丙啶(PI)、丹磺酰戊二胺（monodansyl cadaverine，MDC）、RNase、Protein K、琼脂糖、溴酚蓝、二氨基联苯胺和ECL试剂盒购于美国Sigma公司。抗p-ERK、ERK和-actin 的抗体，及辣根过氧化酶标记的二抗，购于美国Santa Cruz Biotechnology 公司（Santa Cruz, CA, USA）。三、仪器二氧化碳培养箱（NuAir，Plymouth，MA，USA），酶联免疫分析仪（Tecan，Sal

14、zburg，Austria）， 6 孔、24 孔与96 孔培养板（Nunc，Roskilde，Denmark），倒置相差显微镜（Leica，Bensheim，Germany），荧光显微镜（Olympus，Tokyo，Japan），流式细胞分析仪（BectonDickinson FACScan，Franklin lakes，NJ，USA），DYY-2 型稳压稳流电泳仪，DYY-III28A型蛋白质电泳仪，DYY-III40B 电泳槽（北京六一仪器厂）。2.2实验方法一、不同浓度的Drug A和Drug B单独处理HepG2细胞及Drug A和Drug B联合用药处理HepG2细胞死亡的影响四甲基

15、偶氮唑3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT是一种能接受氢原子的染料。可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下tetrazoliu环开裂，生成蓝紫色的结晶甲臜(formazan)，甲臜结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。用DMSO溶解甲臜后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。取HepG2细胞，密度为6103个/孔，接种于96孔培养板中，培养24 h后加入不同浓度的Drug A和Drug B及Drug A、D

16、rug B联合用药培养24 h后，加入不同浓度Drug A作用6h、12h、24h、36h、48 h以MTT法测定细胞死亡率。按下列公式计算：死亡率（%）= A492（阴性对照） A492（加药组） / A492（阴性对照）100二、细胞形态的观察细胞凋亡的形态改变是多阶段的，其显著特征表现为：首先是细胞膜突起、细胞体积缩小；接着部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落；最后被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬。凋亡过程中，磷脂酰丝氨酸外翻；细胞核内染色质浓缩、边缘化、DNA发生有序裂解，形成180-200 bp的整数倍片断。取对数生长期的HepG2细胞

17、，密度为6103个/孔，接种于96孔培养板中，培养24 h后，加入不同浓度Drug A作用24h，在倒置相差显微镜观察细胞形态。三、细胞荧光染色的观察吖啶橙（AO）能够将凋亡细胞核或细胞质染色成可见致密浓染的黄绿色，在380 nm激发光下发出黄绿色亮光。以每孔2104个细胞的密度接种于24 孔板中，培养24h后，加入不同浓度的Drug A与不同浓度的Drug B作用24h后，去培养液，用PBS洗一次。加入稀释1000倍的AO于37避光染色1 h，于激发波长为380 nm，发射波长为525 nm的荧光显微镜下拍照。四、流式细胞分析细胞周期PI(碘化丙啶)为核酸嵌入型染料，可嵌入双股螺旋多核苷酸结

18、构，故DNA和RNA均可着色。PI不能穿过活细胞膜，故活细胞拒染；但能穿过死细胞膜，使之着色。PI鉴别细胞死活的灵敏度很高。因此，在流式细胞术中常用PI测定细胞活力。以每瓶2105个细胞的密度接种于6孔板中，培养24 h后分别加入6L-1的Drug A， 100L-1的Drug B，及两药联合作用组，作用24 h后，收集细胞，用PBS清洗一次。然后用70%乙醇固定过夜。次日将单细胞悬液离心弃去固定液，用PBS洗涤1-2次，加入50 mg/L(0.1% RNase)，PBS配PI染色液1.0 mL，置4C避光染色1 h后用流式细胞仪分析，测定细胞凋亡情况。五、Western blot analy

19、sis (免疫印迹法) 5,6 Western blot 是一种蛋白质的固定和分析技术。将已用聚丙烯酰胺凝胶或其他凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上。固定在滤膜上的蛋白质成分保留抗原活性及与其它大分子物质特异结合的能力，所以能与特异的抗体或核酸结合。第一抗体与特异性抗原决定簇结合，再用经标记（同位素或非同位素）的第二抗体来测检。1. 工作液的配制1） 丙稀酰胺和N, N亚甲基双丙稀酰胺储存液。使用去离子水配制含有29 （W/V）丙稀酰胺和1 （W/V）N, N亚甲基双丙稀酰胺储存液。2） 用于制备分离胶和积层胶的Tris 缓冲液。制备这些缓冲液必须使用Tris碱。用Tris碱完全溶于去离子

20、水后，用HCl调节溶液的pH值。分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)积层胶缓冲液：1.0 mol/L Tris-HCl (pH 6.8)3） 十二烷基磺酸钠（SDS）：用去离子水配成10 的储存液室温备用。4） 过硫酸铵。用去离子水配制少量的10 （w/v）的储备液保存于4，由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。5） Tris甘氨酸电泳缓冲液。25 mmol/L Tris碱，250 mmol/L 甘氨酸（电泳级），0.1 SDS, 可配成5储存液备用。即在900 ml去离子水中溶解 15.1 g Tris碱和94 g 甘氨酸，然后加入50 ml 10 （w/

21、v）的电泳级的SDS储存液，用去离子水补至1000 ml量则成5储存液。6） 细胞裂解液：50 mmol/L Hepes (pH 7.4), 1 % Triton-X 100, 100 mmol/L NaF, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 2 mmol/L正钒酸钠，1 mmol/L PMSF, 使用前加入：10 g/ml (aprotinin, leupeptin, pepstatin A)。7） 加样缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8), 100 mmol/L二巯基乙醇（2-ME）, 2 % SDS，0.1 溴酚蓝，10 甘油。8） 转

22、移缓冲液：3.64 g Tris碱，17.3 g 甘氨酸加入240 ml 甲醇，用去离子水补至1200 ml。9） 10 丽春红染料：2 g 丽春红S，30 g 三氯乙酸，30 g 磺基水杨酸加水至100 ml。10) 封闭液：5 脱脂奶粉，0.01 Tween-20, 0.02 % 叠氮化钠溶于PBS溶液中。11) 无磷酸盐，无叠氮化钠封闭液：5 脱脂奶粉，150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)。12) 二氨基联苯胺溶液：9 ml 0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.6) 溶液中溶解6 mg二氨基联苯胺，向其中加入1 ml 0

23、.3 % CoCl2。2. 蛋白质电泳1） 按Tab. 2-2A 配制15 ，12 %或10 的丙稀酰胺分离胶，依次混合各成分，一旦加入TEMED，马上开始聚合，立即快速旋转混合物灌制在电泳槽的两玻璃板之间，留出灌制积层胶所需的空间。在分离胶上覆盖一层异丙醇，将凝胶垂直放置在室温约30 min。分离胶完全聚合后，清除异丙醇用去离子水洗3次，用滤纸吸去水，按Tab. 2-2B配制积2） 层胶，加入到电泳槽后立即插入干净的样品梳。3） 在积层胶聚合时可把收集的Drug A和Drug B联合用药处理过的细胞用细胞裂解液在冰浴上裂解60 min，7,000g 离心10 min, 取上清加入2的上样缓冲

24、液，在沸水浴中加热5 min使蛋白质变性，采用Bio-Rad 蛋白浓度测定液测定样品中蛋白浓度，并调整各样品的浓度相同。4） 积层胶聚合完全后，在电泳仪中加满1的电泳缓冲液，将样品按预定的顺序加到样品孔中开始电泳，样品在积层胶时电压为75V, 待样品泳到分离胶时将电压调至180V。3.免疫印迹1） SDS聚丙稀胺凝胶电泳结束后，将胶放置到转移缓冲液中浸泡30 min, 切6张 Whatman 3 MM滤纸和1张硝酸纤维素膜，与凝胶大小相符合。将硝酸纤维素膜浸在去离子水中除去气泡。2） 将凝胶按叠成“三明治”状，插入转移池中，凝胶一面接阴极，15V 转移过夜。3） 转移后的硝酸纤维素膜进入丽春红

25、S染液中5-10 min，期间轻轻摇动，蛋白带子出现后用去离子水漂洗数次，用防水墨汁标记出标准蛋白分子量的位置。4） 将膜放入小盒中，按0.1 ml/cm2加入封闭液，封闭4 h。5） 再按0.1 ml/cm2加入含第一抗体的封闭液，室温过夜，（各种抗体稀释倍数如Tab. 3-2）。6） 回收一抗，用PBS漂洗膜3次，每次10 min，将膜转移到含150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) 的溶液中摇动10 min。7） 按0.1 ml/cm2加入含第二抗体的无磷酸盐及无叠氮化钠的封闭液中，其中以辣根过氧化酶标记的二抗稀释1,000倍。8） 以用1

26、50 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) 溶液漂洗3次，每次10 min，再将膜放入10 ml二氨基联苯胺溶液中（含10 l 30的H2O2），约5 min后可观察到蛋白带子的出现，待其颜色达到要求，用常水略漂洗，扫描图片保存。Table 2-2A 配制电泳分离胶所用溶液溶液成分15 ml 凝胶30 ml 凝胶10蒸馏水5.911.930 丙稀酰胺溶液5.010.01.5 mmol/L Tris (pH 8.8)3.87.510 % SDS0.150.310 % 过硫酸铵0.150.3TEMED0.0060.01212 %蒸馏水4.99.930 丙

27、稀酰胺溶液6.012.01.5 mmol/L Tris (pH 8.8)3.87.510 % SDS0.150.310 % 过硫酸铵0.150.3TEMED0.0060.01215 %蒸馏水3.46.930 丙稀酰胺溶液7.515.01.5 mmol/L Tris (pH 8.8)3.87.510 % SDS0.150.310 % 过硫酸铵0.150.3TEMED0.0060.012Table 2-2B 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）456810蒸馏水2.73.44.15.56.830 丙稀酰胺溶液0.670

28、.831.01.31.71.0 mmol/L Tris(pH 6.8)0.50.630.751.01.2510 % SDS0.040.050.060.080.110 % 过硫酸铵0.040.050.060.080.1TEMED0.0040.0050.0060.0080.01Table 2-2C 蛋白质电泳应用抗体AntibodiesType of IgGDilution-actinMouse monoclonal IgG1:1000ERKrabbit polyclonal IgG1: 400P-ERKBAX BCL-2FADDrabbit polyclonal IgGrabbit polycl

29、onal IgGrabbit polyclonal IgGrabbit polyclonal IgG1: 3001:6001:8001:1000secondary antibodygoat anti-rabbit IgG-HRP1: 5000secondary antibodygoat anti-mouse IgG-HRP1: 100002.3实验结果1. Drug A时间剂量性的抑制HepG2细胞增殖我们选择MTT法来考察培养HepG2细胞 24后， A对细胞的生长抑制作用。实验结果表明， A作用于细胞呈一定的时间依赖性和剂量依赖性(Fig.2-1)。随着作用时间的增加和剂量的加大， A对H

30、epG2细胞抑制作用更加明显。其24 h时的IC50值为12molL-1。Fig. 2-1 Effect of DrugA on HepG2 cells proliferation. Cells were cultured in 1640 for 24 h , then incubated with different concentrations of Drug A for 6, 12, 24, 36 and 48 h. Viability was determined by MTT assay. Data are presented as mean SEM of the results f

31、or three independent experiments.2. B时间剂量性的抑制HepG2细胞增殖我们选择MTT法来考察培养HepG2细胞 24后， B对细胞的生长抑制作用。实验结果表明，Drug B作用于细胞呈一定的时间依赖性和剂量依赖性(Fig.2-2)。随着作用时间的增加和剂量的加大，Drug B对HepG2细胞抑制作用更加明显。其24 h的IC50值为150molL-1。Fig. 2-2 Effect of DrugB on HepG2 cells proliferation. Cells were cultured in 1640 for 24 h , then incub

32、ated with different concentrations of Drug A for6, 12, 24, 36 and 48 h. Viability was determined by MTT assay. Data are presented as mean SEM of the results for three independent experiments. 3. Drug A与 Drug B联合用药我们用金氏公式求协同指数（Q值），再进行判断拮抗、相加、协同效果： Q=E(a+b)/(Ea+Eb-EaEb)Ea和Eb 为单独用药时的抑制率，E(a+b)为联合用药的抑制率

33、，(Ea+Eb-EaEb)为期望合并效应；Q值0.85为拮抗，Q值在0.851.15为相加，Q值1.15为协同作用。2. Drug A与 Drug B联合用药协同诱导HepG2细胞凋亡2.1细胞凋亡的形态学观察 相差显微镜下观察到Drug A与 Drug B联合用药与单独给予Drug A相比，HepG2细胞数量减少，凋亡小体增多（Fig. 2-2A）。Fig. 2-2A The cellular morphological changes were observed by phase contrast microscopy Con:0 h for Drug ,A:24h for 6mol Dr

34、ug A,B: 24h for 100mol Drug B,A+B: 24h for Drug A+B; arrow indicates apoptotic bodies(100 magnification).2.2 吖啶橙（AO）染色形态学观察吖啶橙（AO）能够将凋亡细胞核或细胞质染色成可见致密浓染的黄绿色，实验结果显示， Drug A与 Drug B联合用药与单独给予Drug A相比，HepG2细胞数量减少，凋亡小体增多（Fig. 2-2A）。Fig. 2-2A The cellular morphological changes were observed by phase contra

35、st microscopy Con:0 h for Drug ,A:24h for 6mol Drug A,B: 24h for 100mol Drug B,A+B: 24h for Drug A+B; arrow indicates nuclear condensation and fragment(400 magnification).2.2 Drug A与 Drug B联合用药增加细胞亚二倍体峰比率碘化丙啶（PI）染色，流式细胞术分析结果显示，Drug A与 Drug B联合用药与单独给予Drug A相比亚二倍体峰（sub-G0/G1期）的细胞比明显升高（Fig. 2-2B）ABFig.

36、 2-2B Flowcytometric analysis of apoptotic in HepG2 cells stained with PI. (A) Con:0 h for Drug ,A:24h for 6mol Drug A,B: 24h for 100mol Drug B,A+B: 24h for Drug A+B. (B) Data are presented as mean SEM of the results for three independent experiments.*P0.05；*P0.01.3.3. 蛋白免疫印迹法细胞凋亡蛋白免疫印迹法（Western blo

37、tting analysis）结果显示， A与 B联合用药24h后的BAX、FADD蛋白的表达增加，但BCL-2蛋白表达降低（Fig. 2-3C）。 Con Drug A Drug B Drug A+B p-ERK 42kDERK 42/44 kD-actin 43 kDFig. 2-3C Western blotting analysis of Drug A+B induced autophagy in HepG2 cells. Expression of p-ERK and ERK in (Con:0 h for Drug ,A:24h for 6mol Drug A,B: 24h for

38、 100mol Drug B,A+B: 24h) treated HepG2 cells at 24 h. Density of each protein band was detected through Bandscan 5.0 software (Glyko, Novato, CA, USA).第三章 结论与讨论3.1 结论1.不同浓度的Drug A和Drug B单独处理HepG2细胞，增值抑制程度表现为时间剂量依赖效应。2.Drug A 6mol/L联合Drug B 100mol/L协同作用24h最为显著。3.流式细胞仪检测细胞凋亡率显示，联合用药组凋亡率升高更为明显。4.蛋白免疫印迹

39、法结果显示，Drug A与 Drug B联合用药24h后的p-ERK蛋白的表达明显被抑制，但ERK蛋白表达无明显变化。3.2 讨论本论文对Drug A联合Drug B对人肝癌HepG2细胞作用机制进行了探讨。有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是哺乳动物细胞内广泛存在的一组丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶，对细胞内信号转导起到重要的调节作用。MAPK 途径主要由三种激酶组成：MAP激酶（MAPK）， MAPK 激酶（MAPKK）与 MAPKK激酶（MAPKKK）。MAPKKK对MAPKK的丝苏氨酸双位点磷酸化而将其活化；MAPKK对M

40、APK 丝苏氨酸双位点磷酸化而活化。它们参与细胞生长、发育及分化等多种生理过程，并在细胞恶性转化等病理过程中起重要作用7。众所周知，所有真核细胞中均存在RAF/MEK/ERK级联信号转导通路，其通过Ras、Raf、MEK及ERK的特异性级联磷酸化将信号由细胞膜外传入细胞核内8。在Raf激酶的作用下，激活的MEK将磷酸化ERK;而被磷酸化激活的ERK转移至细胞核，并且通过磷酸化作用，激活多种转录因子，最终调节包括多种参与细胞增殖、存活和分化的基因表达9。该通路上的相关蛋白发生突变或过度激活，都将导致细胞增殖的加速与细胞生存期的延长，促进肿瘤的形成及发展10。Drug A与 Drug B联合用药2

41、4h后的p-ERK蛋白的表达明显被抑制，从而起到杀伤HepG2细胞，诱导细胞发生凋亡。细胞凋亡(apoptosis)是受基因调控的生理性、自主性细胞死亡过程，细胞凋亡有其自身特点，首先凋亡细胞在形态学上主要表现为胞质浓缩，核染色质凝缩，DNA大规模断片化，细胞膜内陷并发泡形成凋亡小体，但细胞膜的完整性未被破坏;其次细胞凋亡过程消耗ATP。本研究结果显示，电镜观察的结果证实了凋亡特征性的形态变化。流式细胞仪检测结果不但证实了凋亡存在，而且比较了各组的凋亡发生程度，联合用药组细胞凋亡率高于两单药组。但是本实验研究只是从RAF/MEK/ERK这一条通路进行的机制研究，并且并没有考察其他凋亡相关蛋白的

42、表达。线粒体可以决定细胞的生存或死亡11,12，接下来我们可以考察两药合用是否影响Bcl-xL，Bcl-2,Bax,cyto.c线粒体途径的考察等凋亡相关因子的表达，从而促进细胞凋亡13,14。除了对凋亡蛋白的考察外，还可以影响细胞周期。Drug A经过不同的细胞周期阻滞机制，使肿瘤细胞阻滞在G0期，细胞增殖受阻，诱导凋亡。联合二者是否在更大程度上阻断细胞周期进展，起到增强抗肿瘤效果也是值得考察的重点。Drug A与 Drug B联合用药是否对HepG2细胞具有特异性的协同作用也需要考察，也就是说，我们还需考察的其他的肿瘤细胞。整体实验需建立肝癌细胞小鼠皮下移植瘤模型，随机分组，空白对照组、

43、Drug A组、Drug B组、联合用药组，观察移植瘤生长情况。实验结果若为联合用药作用于其他肿瘤细胞仍可起到良好的协同作用并且两药合用整体实验中与单独给药组比较抑瘤作用增强的话，联合给药对临床应用具有更为重要的意义。参考文献1 崔彦芝多靶点药物联合顺铂对肝癌细胞的作用及机制研究南方医科大学，2005。2 黄海华，余立华等药学细胞生物学M 北京：中国医药科技出版社，2007年（2），454-455。3 李晓丹，李进细胞凋亡J国外医学生理、病理科学与临床分册，1997, 17 (3)，231-233。4 刘因华抗肿瘤药物的研究现状与发展前景J 中国医药指南，2007年9月上半月刊，106。5 S

44、uzuki K, Hino M, Kutsuna H, Hato F, Sakamoto C, Takahashi T. Selective activation of p38 mitogen-activated protein kinase cascade in human eutrophils stimulated by IL-1. J Immol Lunol 2001, 167: 5940-5947.6 Sambrook J, Fritsch EF, ManiatisT. Molecular cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 880-898.7 Lewis TS, Shapiro PS, Ahn NG. Signal transduction