病毒载量检测方法及其意义

.,1,病毒载量检测方法及检测意义,.,2,病毒载量（viral load）代表的是病毒的负荷，即体内复制的病毒的数量。实际上，体内复制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用每毫升血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的病毒载量。,.,3,一、通常的病毒载量测定方法,bDNA方法(分枝DNA杂交试验) NASBA(核酸序列扩增试验) Cobas Amplicor HIV-1 Monitor(逆转录-聚合酶链反应) 荧光定量PCR,.,4,bDNA 是一种夹心式的核算杂交反应过程，用于直接定量检测血浆中HIV-1 RNA 的含量。首先，通过离心将血浆中的HIV-1 富集起来。HIV-1 病毒基因组RNA从病毒颗粒中释放出来后，首先会被一组合成的寡核苷酸探针又称捕获探针所结合并连接在微孔板上，然后通过另外一些靶定探针使病毒RNA与预放大探针结合。捕获探针包括十七个可与基因组特异结合的捕获位，靶定探针包括81个可与基因组特异结合的靶定区，分别靶定在病毒RNA pol 基因的不同区段。放大探针结合到预防大探针上，从而形成支链DNA复合体。随后多拷贝的碱性磷酸酶（AP）标记的探针与该复合体杂交结合。与化学发光底物共同孵育，所产生的光强度与样品中HIV-1RNA的量成正比，以相对光强度单位（RLUs）表示的光度值被分析系统记录下来，试剂盒中含有已知浓度的经-丙内酯（BPL）处理的HIV-18E5/LAV病毒液作为标准品，根据标准品的光吸收值绘制标准曲线，样品中HIV-1 RNA的量可对照标准曲线求得。 扩增HIV-1 M组的A-H亚型。,.,5,本实验系统检测的定量范围为50至500,000HIV-1 RNA拷贝/ml。 检测结果以如下形式报告： 低于最低定量限的值报告为“500,000” HIV-1 RNA拷贝/毫升。 高于500,000HIV-1 RNA拷贝/毫升的样本位于检测的最高定量限以上，必须适当稀释以获得确切的量值。在人血浆中稀释高浓度样本，稀释用血浆需经VERSANT HIV-1 RNA3.0 Assay (bDNA) 检测鉴定不含HIV-1 RNA，按照实验流程重新检测，得出的结果乘以稀释倍数以确定初始样本的病毒载量。,.,6,COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验包括以下步骤： 样本制备 靶RNA的逆转录产生cDNA 用HIV-1特异互补引物进行靶cDNA PCR扩增 通过比色进行与探针结合的扩增产物的测定,.,7,COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR 试剂对HIV-1病毒RNA的定量检测是采用HIV-1定量标准品来完成的。HIV-1定量标准品是包括作为HIV-1靶RNA引物结合部位和HIV-1扩增子单一探针结合区的非感染性RNA转录物。将已知拷贝数的HIV-1定量标准品加到每一个样本中和HIV-1靶序列一起共同进行样本制备、逆转录、PCR扩增、杂交和检测。COBAS AMPLICOR 分析仪根据HIV-1定量标准品的数据计算每一个样本的HIV-1RNA 的含量。可扩增HIV-1 M组的A-H基因亚型。,.,8,标准试验：能够定量400-750000拷贝/毫升的 HIV RNA，需要0.2毫升血浆。 超敏试验：能够定量50-75000拷贝/毫升的HIV RNA,需要0.5毫升血浆。,.,9,NucliSens EasyQ HIV-1实验 是使用NASBA技术的靶扩增试验。NASBA技术选择性地直接扩增RNA而没有PCR步骤，用2个寡核苷酸引物、3个酶、三磷酸脱氧核苷和合适的缓冲液进行一步夹心杂交。首先用异硫氰酸胍和氧化硅颗粒提取高纯度RNA，RNA通过重复的合成和转录双链DNA中间体得到扩增。在AMV-RT的作用下，HIV-1gag区的引物P1介导由标本RNA合成cDNA，RNA链被RNAse降解。引物P2结合启动第二条DNA链合成，反义RNA通过T7多聚酶启动双链DNA合成，这个循环不断重复，使得靶RNA在等温条件下大量扩增100万到1000万倍，然后直接用化学发光法确定核酸量，通过HIV特异的gag和pol区的3个内标同时扩增而达到定量目的。它具有高度敏感性和广阔的动态范围。 最近NucliSens HIV-1定量实验有了较大改进，将NASBA核酸扩增技术与实时(real-time)检测技术结合起来,能够对检测进行实时监控。结果表达方式由每毫升标本的拷贝数（cp/ml）改变为每毫升国际单位（IU/ml）。 可扩增HIV-1 M组的A-G亚型。,.,10,NucliSens 核酸分析系统利用三项技术： 专利的BOOM核酸提纯技术:手 工 manual 半自动miniMAG 自 动 easyMAG “扩增RNA”的NASBA技术 使用荧光分子信标（molecular beacon)对扩增产物的实时检测技术,.,11,三种病毒载量检测技术比较,.,12,.,13,二、病毒载量检测的意义,早期诊断 婴儿的早期诊断：感染HIV的母亲所生婴儿小于18个月时，不能按照常规检测程序进行抗体检测来确证是否感染了HIV。这种情况下，采集婴儿不同时间的样本进行HIV核酸检测。 也可使用集合法对采供血机构的原料血浆及HIV抗体阴性的高危人群样品进行核酸检测，及时发现窗口期感染者，降低“残余危险度”，预防传播。,.,14,疑难样本的辅助诊断 在感染早期或疾病终末期出现抗体不确定反应时，RNA的测定结果可帮助提供HIV感染早期或终末期的证据。但在一般情况下，抗体检测足以对HIV感染与否作出正确诊断。,.,15,病程监控及预测 HIV感染后病毒载量的变化具有一定的规律，这种变化与疾病的进程密切相关。定期进行病毒载量检测有助于确定疾病发展的阶段，以确定相应的治疗方案。HIV病毒载量与6年发病率的关系： 病毒载量(拷贝/毫升) 6年发病率（%）30000 80,.,16,指导抗病毒治疗及疗效判定 通常在病毒载量达到一定水平后（如35000-50000拷贝/毫升）抗病毒治疗才显示良好的治疗效果。治疗后通过病毒水平的检测能够确定治疗是否有效。理想的结果是治疗24周后，病毒水平会控制在检测线以下。,.,17,.耐药性监测 可用于HIV耐药性检测和监测。治疗后病毒载量得不到有效控制时被认为治疗失败。引起治疗失败的原因之一是病毒对治疗药物的敏感性降低或不敏感，也就是产生了耐药。对病毒载量1000拷贝/毫升的样本进行耐药性检测对临床医生修改治疗方案有一定的帮助。,.,18,三、影响病毒载量测定结果的因素,样本类型： 血浆和血清标本都可用来测定病毒载量，但是血清的检测结果大约是血浆的50%（ 30-80% ），可能是因为血液凝固的过程中HIV颗粒被包裹在纤维蛋白网络中，导致血清中病毒的浓度下降。因此，测定病毒载量应该首选血浆标本，血浆也是临床使用的唯一标本。血清标本对于研究也是可以接受的，重要的是每位病人使用的标本类型应始终保持一致。,.,19,抗凝剂 ：抗凝剂能够显著影响测定的结果。肝素钠处理的血浆不适合做Amplicor HIV-1 Monitor试验，因为肝素是PCR反应的一个潜在的抑制剂。如果必须用RT-PCR方法测量肝素处理的血浆，可以向标本中加入肝素酶以分解肝素。另外，肝素处理的血浆中病毒颗粒降解的速率显著高于EDTA钠盐和枸橼酸钠处理的血浆，一般情况下不同抗凝剂处理的血液6小时之内HIV RNA的降解速率分别是1.8%/小时（EDTA）、3.3%/小时（枸橼酸钠）和5.0%/小时（肝素）。在血液处理方法相同的条件下，用EDTA钠盐抗凝的血浆结果显著优于枸橼酸钠和肝素，因此EDTA钠盐是首选的抗凝剂。,.,20,标本处理时间：HIV-1在体内进行快速转换，平均半衰期是大约6个小时。HIV-1在体外未处理的全血中也快速降解，全血中HIV RNA的降解速率在6小时之内平均是9%（0.04log）,最大的降解速率是在采血以后6-8小时，采血以后30小时内可能减少0.5log。因此为了减少病毒颗粒降解对检测的影响，应该在采血以后6小时之内分离血球和血浆。,.,21,样品的保存温度： -70室温冻融3次，HIV RNA变化的幅度小于0.2log。 -70保存5个月，HIV RNA减少0.3-0.5log。保存12个月，HIV RNA减少一般不超过0.4log. 血浆在室温或4 保存3天，HIV RNA减少不超过0.5log。 -20 保存2-3年，病毒载量大约减少50%左右。反复冻融影响更大。,.,22,四、病毒载量测定结果的分析和解释,分析一个病人不同时间病毒载量测定的结果时，首先要考虑测定结果的变化是真实的生物学改变还是方法本身的变异或误差。 病毒载量的变化超过0.5log（大约是3倍）就超过了实验和每日的正常变化，应被视为有生物学意义的变化，而0.5log以内的变化就很难与随机的变异相区分。特别需要注意的是在接近检测下限的时候，实验的变异对于解释病毒载量变化的意义有更大的影响。例如，病毒载量从50cp/ml增加到150cp/ml，虽然变化的幅度达到0.5log，但真正反映的可能是实验的变异而不是抗病毒治疗的失败，因此对于接近检测下限的测定结果需要进行认真分析。,.,23,五、病毒载量测定的质量管理,质量保证 质量保证指从接收样品到发出报告的整个过程中，为确保最终结果的正确性所采取的全部措施。 质量控制 制定和实施质量控制计划之前首先要对使用的方法和系统进行深入的了解，包括方法的检出限、偏性、误差被接受和拒绝的统计学水平。质量控制包括3个部分：对照（control）、程序（Procedure）和规则（rules）。 质量评价 可以用已知HIV RNA浓度的血浆样品进行外部质量评价。对质量评价样品的要求是：（1）覆盖检测的动态范围，一般要求5个log。（2）重复测定同一份样品考察精密度。（3）包含HIV-1不同亚型的样品。,.,24,六、样本采集及分装注意事项,样本采集：用EDTA抗凝管采集样本5ml ，立即颠 倒混匀8-10次，避免溶血。按照要求编号。 样本分装： 处理样本时戴一次性无粉手套。 核对样本编号及数量。 2-6个小时之内用普通离心机3000转/分离心15分钟分离血浆（一定要保证足够的离心时间）。 用去RNA酶的带滤芯吸头吸出血浆，分装到两个已编号的去RNA酶的螺口管中，每管1.1-1.2ml。 编号要清晰。项目样本按照项目要求编号；只做病毒载量检测的样本应编抗病毒治疗号。,.,25,七、样本的储存：,近几天需要检测的血浆可放于2-8 3个月以内检测的血浆可放于-20 需长期保存的（3个月以上的）血浆可放置-80以下冰箱冻存。,.,26,八、样本的运输,在冷冻状态下送样。 样本按照编号顺序放在冻存盒里，盖子上及盒子边上写明是哪个点的什么样本（比如说是哪个项目样本）以及样本的数量。第一份样本处要有明显的标示如箭头等。 冻存盒放入专用送样箱里，送样箱应易于消毒处理。在冻存盒周围应垫有吸水材料。 送样箱里放入适当的冰袋，以保证温度。 送样时一定要有病毒载量检测样本送检单，送检单上的编号要与血浆冻存管上的编号一致；冻存盒里样本的顺序一定要与送检单上的顺序一致。 样本冻存管上要标明样本编号、采样日期及样本性质（血浆）。 各州或地区CDC送检辖区内不同点的样本时必须有各点样本数的汇总表。 送样前一天告知我室送样时间。 联系人：佐合拉 电话：2611637-807,.,27,九、病毒载量检测样本送检单,.,28,十、常见的问题,送检单上的编号与管子上的编号不符。 抗凝管的选择 离心时间不够 样本分装量（不够或过多）,.,29,十一、送检要求:,有检测能力的实验室所属地州的病毒载量检测工作必须由该实验室承担，其它实验室的样本按照要求送我室检测。,.,30,谢谢！,