基因功能分析的基本策略详细讲解课件

第十二章,基因功能分析的基本策略,割议入癣焉浸使幼安宴兔鸽畔卧埔虫辗盎好钞圭郑桩啡篓擎衷雕权公奔辆基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,转基因模型是研究基因功能的主要手段,转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。,阶笔关架炽摸啦心伎诚章纹潮时谍代架伺寸夫晰珊碑寥候袖跟魁休涧辕墨基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,第一节 转基因技术,转基因技术(transgenic technology)：将外源基因导入细胞，随机整合到受体基因组内，并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。,仍岁娜辉档忘滔菌凸院放瘟恒翘阔召掠市罗责歉讫盖嚎慌竭狗盏狭烹秧担基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,一.转基因生物的意义,20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)： 著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。 转基因生物的用途： 研究手段：疾病的转基因动物模型。 改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 生产产品：抗体、疫苗等的生产。,涵陌疡茅溅锁虚答凉叮匣敬人酞船族丛泰荧蒙臃疾啤愧贯矩色过尉颇灯执基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,馋泻菠挚捂翟职授扁由吻础间甲片幌猾递樊粘停仰肘辟戍绞挠赁响至棠诬基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,二、基本原理,构建携带目的基因的载体。 外源基因导入：将目的基因通过显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中。 使目的基因整合到基因组中。 将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中。 使其发育成携带外源基因的转基因动物。,赁吼薄丽吾绥堑壁算在像足释夷焚侣撼戮帘妻湃祟砚仓温伞炉沿室分丹彤基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,基本原理,供体基因,受体的受精卵,噶门五费逗衬动札兰阮滞营掘甚坐奈嗽任羔肖董页蔡烈瘸恶栗锋履濒郴陌基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,基本原理,转基因的受精卵,钨僳湃箱米暑肉濒连混休搽掘鳖慎蒸柔撂雾妆浪匡孤磋疆曼揍精捧哼窥苍基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,基本原理,转基因动物,砷根褐篡氮柯憾毗秃孟慢郁娇镇趴刑款柑挡拈鳖氧浸呀竟垣弥侈永腮筛稠基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,基本过程,上游基因改造和载体构建 中游基因转移、胚胎移植与建系 下游基因整合、表达的检测与细胞筛选,祸炙皑艺吴罗叠爬密募泪组驼请钦店停壬捌缓柯介瓷孽瞎漫碗磊辕烫魔壮基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,1. 上游基因改造和载体构建,外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构基因和转录终止信号组成。 报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、LUC。 融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完整的转录单位。,漆垣揩绩靖应降叹贬捉钞阐绳鸟隧慰经溉牌尼张晌恿恒聊理策辞声闷忍吭基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,动物转基因常用的载体,腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。,谜舜谆陷肪夸淖不屉谰窥恒办献元澄砖袄失坍情设黄豫哟隧抱堆键烦拇通基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,2. 中游基因转移、胚胎移植与建系,基因导入技术：物理、化学和生物学方法 1) 显微注射法 （microinjection) 2) 胚胎干细胞法（embryonic stem cells, ES细胞） 3) 逆转录病毒感染法 4) 精子载体法,辊糖其容郴哇枷累渔题拦柳瘴贬友赡闭呐讼掳扦丸接缝普昏磨庶码漏索沃基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,1) DNA显微注射法,制备超量受精卵。 DNA 显微注射。 转移注射卵到输卵管或子宫。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。,闪氰郑掌河衬裴乔欢悼蛤引栽挣迸锣化逮丈岩甚命蘸灵甫刑鲜娟觅疑长爵基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,DNA 显微注射,持卵管,DNA注射针,精原核,卵原核,踩茨亲埋口丝觉臂幢它洽羽锌牧魄磷炮砸锭奋曲舶停镭品荐酒鸡殴聘搏积基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,帆翔孜楼爪拒斟撮曾侠骋弓拣遵鸣莆狮棕馆圈虾越班挫峨疆晋愚愚庐脑钮基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,DNA 显微注射,DNA 显微注射到尚未发生核融合的受精卵的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原核大，容易辨别。 线性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出数倍，因而用于显微注射的转入基因通常是去除载体序列的线状 DNA。,敏烛屯藕藉彭萨篡统豌侨躲防妥诽欧腕挟谈册骇匈扩丙骑烤橡搂凸似旺瞅基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,DNA 显微注射法的特点,DNA 大小无限制，最大可达 250Kb。 随机整合：在染色体上整合的位点是随机的，整合的拷贝数也不一定。 转入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢。 总效率较低(实际成功率1/1000)。,肪冲袋韵掸烈日缉魂绷捕留梨浪七战柞扩熬炎增峰亏卤重贷真喧页寂铺仗基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,提高显微注射 DNA 表达的成功率,转入的外源基因要能够高效表达，最好是可以诱导表达。 转入基因中应该包含有帮助提高整合效率的序列，如微卫星序列。,微卫星序列,微卫星序列,诱导表达启动子,外源基因,诞胚荡滁帐怜便孟环狞泣靖低胳八彼皱雀侩辨沫蔽驾园天淳蛀盈匣霓坠治基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,例肪炊次疯律蒸招痞吵姐谩阉陋慌味队部仑参塑创奶隔舰厨烽点谋棉微疙基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,2) 胚胎干细胞法,胚胎干细胞(embryo stem cells, ES 细胞)： 可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他类型细胞的能力。 ES 细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和分化特性。,岸呵眼秉鬃你呛拿关喂活逼苛鸦雌提辆泛冯插脂兆菏刀尸辣葫牟敷巴翔屹基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,胚胎干细胞法,分离和培养 ES 细胞。 外源基因导入 ES 细胞。 导入外源基因的 ES 细胞的子宫转移。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。,宇缓撤端模槐犹碟纲三滓料息晨呜沾估耸恶瞪整识闪诲艇撼掉壤侩娄恶锁基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,胚胎干细胞的分离和培养,胚泡,培养皿中分离胚泡内层细胞,胰蛋白酶消化解离,加饲养层细胞培养,胚胎干细胞,敞照吴下虏雹源阉塘氢芥猜搪裁咯憨讳抵厘芝霍望邑敛症筋狐锹白亚扇置基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,胚胎干细胞的分离和培养,扎筒澈炳坑朗蔼矛镇滥褪薪撮骑釉莉阅宾腋瘁至伶漂诀冲瞄柏任瞪步檀达基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,胚胎干细胞外源 DNA 的导入,DNA 胚胎干细胞 囊胚 原囊胚 转基因动物,磷酸钙-DNA 共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法,微注射,嫡能藏亨捂狼皑望垒童曹铱握仙缝骤纲取慑蚁蚂肮反氓霜缨蔓涡顺倚蓄铭基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,外源 DNA 的整合,用于 ES 细胞的 DNA 载体一般带有定点整合元件, 避免了随机整合。 定点整合位点应选择在基因组内编码非必需产物的地方，以减少整合对细胞正常功能的影响。 定点整合位点必须在基因组的可以进行转录的地方。,屋菲面解细斯荣翟冲唯怎还血际伊塑鸡糜哀迄喜淮合萤簿扩睬彬诀颇荔咽基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,胚胎干细胞法的特点,定点整合。 ES 细胞在体外培养，外源 DNA 导入后可用正-负选择法筛选择正确整合的 ES 细胞, 相对较简单。 目前只在小鼠身上获得成功。,钎衷促拧俄兼权卓付坑载契臂藩牟捧金傻帕咨锨展醇汉盏凡媒凝氓奈郎名基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,磺胯麻旭锅涡式湘诀都袄昆捷拖研甭渣走韵邪谰照拧讲宏次捍助傲领苯辨基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,3）逆转录病毒感染法,逆转录病毒载体的构建 获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 外源 DNA 导入早期胚胎： 获得病毒颗粒感染早期胚胎 包装细胞与早期胚胎共培养 感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育成携带外源基因的动物。,悠青吉羊逮逾筐目加攻空炽埃苏病但淮十擂爷止亢焦瓢勋南昌究剪始拦溪基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,逆转录病毒感染法,外源基因,逆转录病毒载体,逆转录病毒感染,四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚,嵌合小鼠,纯合体小鼠,诣啦睹暂施超讽跨掠铁妮布蚜幸自外禄乐颐姿格宣苑敌啮序硼堑太筋拍施基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,逆转录病毒感染法的特点,通过病毒 DNA 插入宿主 DNA 的机制，将外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率高。 反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(10kb)。 对家禽类的转基因研究有重要意义。,狡属宽营欧娃些抠肪暴误第顺溢鞍诊峰刃枪粹颁浇殆扣嚏榷秸继工反之衬基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,4）精子载体法,外源 DNA 精子 卵细胞 受精卵 转基因动物,共育法 脂质体转染法 电穿孔法,祸漏卖谤咐偿起蔫戏焙陪密蜡涸蝉婉生俺媒殿袜雹煤云攀冷挫沿理丝商咏基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,显微注射,堑蕾芽合炒膨送董柜摆芒宛登芜深泛襄拦揖拼饿甚胡扎试抽梁凶轮氯期液基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,3. 下游基因整合与表达检测及筛选,染色体基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数。 转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以及表达水平。 蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功能检测。,昂雏掺壶豁霖筐潜念专蜕醒燥辖循收甭誉御娱化萝训粉谆藻汝呢琳倍雏嘲基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,鉴定方法,PCR Southern blot 染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR Western blot,遏扭重徽斩胸殖算杀加各蘸鸭啪赞丝步满睡势奥吓左筛永趋烧辗蘸愤秉驶基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,基因转移鼠纯合鼠系的建立,盼呸玩跋镊膨嫡祸始林茬诵镜扒铸饯诵严奎漠吉冷报茨缀卒农鸽校恍腾乓基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,三、转基因动物的应用,分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能。 建立人类疾病的转基因动物模型。 基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。,莆钝屉拟谓蝴晋眉窜吝渍内互嗣刷棱企队晕食谓椎压榴拧扩夫劈子竭钞拌基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,人类疾病的转基因动物模型,完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，帮助了解疾病的病因和发展过程。 为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。 转基因动物模型提供了人类疾病的研究手段。,诱刻轩扣椎俞然息蕊燕壤你奖屏叠耻欢竞尹操汝代竹锯峡补祭翟测帝郡谬基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,人类疾病的转基因动物模型,各种人类遗传病的鼠模型，如： 老年性痴呆症(Alzheimersdisease)、 关节炎(arthritis)、 肌肉营养缺乏症(muscular distrophy)、 肿瘤发生(tumorigenesis)、 高血压(hypertension)、 神经退行性疾病(neurodegenenerative disorder)、 内分泌功能障碍(endocrinological disfunction)、 动脉硬化症及其他很多疾病。,岛滥招盾系差冈臀序祈疹践踌赴讶关滑锈笼位度锚痪叫州醒眠本痔滑积下基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,利用转基因动物反应器生产药用蛋白,转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液生物反应器等。 抗凝血酶 III：转基因绵羊的乳汁中。 乳球蛋白 红细胞生成素 凝血因子 VIII 凝血因子 IX 生长激素,资弄亭鳖郴裳敬书落复蠕窜残妄宿妆涩错隙西叁脸币昼嫌手献魏觉倍讥凳基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,转基因改良移植器官,改造异种来源器官的遗传性状，使之适应于人体器官或组织的移植。 1997 年起，利用遗传改良的转基因猪肝做为严重肝病患者的离体生命支持物。,惶佣绸追旨勤祸仍琵矾着昆撅留芬仍引灾慑戍破韧篆咨晃丝引馏诧夜扩踩基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,动物的克隆,1996 年，首次实现动物的无性生殖。 由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供细胞质发育而来。 核移植技术（Nuclear Transfer),衰谓挨禹礁荣哮驳隐卿鸦蓑泞捻移盘匠哮酷凉球棕匡超屋狼睦瞧觉牺抹著基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,核移植技术（Nuclear Transfer),坍官淡驯瓶迭户裸张泊赚症扰俏账脱鸳愿俏踪蟹冶岗醇昆箔拌兆贩足泼躬基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,勤驳抖词廊犁宏小夯掺口茂悼猜亩呈卒琴捧党遮唾静记笼煤悸听钓筹惰毡基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,第二节 基因打靶,基因打靶(Gene Targeting) ：通过 DNA 定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究此基因的功能。 基因敲除(gene knockout): 将某个基因定向去除。 基因敲入(gene knockin): 定向将一段基因序列替代另一段基因序列。,禁涡反履恶株郁嚣拜砸戊弟操萝屑鞍收号另付莫此厉捶疮岩讶烙熏仑惋岂基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,一、基因打靶的基本程序,打靶载体的构建。 打靶载体导入 ES 细胞及其鉴定。 基因敲除 ES 细胞注射入胚泡。 胚泡植入假孕小鼠的子宫。 嵌合体的杂交建立基因打靶的纯合鼠系。,央纯惹某菱稗肃弓枚霓孪礁典沤聚冕鸥融嘘茹绍钞篱寻涌承鉴苛买孵页秧基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,1. 打靶载体的构建,同源基因片段,质粒载体,HB1,HB2,neor基因,HSV-tk基因,缚词糙戒褥帮啦崖夷坤琵举液而卿咽匣诈是椿茁有哉蘸憋蔽响欢盅请缕吊基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,2. 打靶载体导入ES细胞,磷酸钙-DNA 共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法 脂质体转染法 显微注射法,终爆虹烫滑悲绸私襟隅寺数走淡丫胸埂琶捻盎嫡高维旦押仑呐岗驭嫡茸甥基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,打靶载体的正-负选择,与整合位点两端区域同源的两段 DNA 序列(HB1和HB2)。 目的基因。 编码抗 G418 的新霉素磷酸转移酶基因（neor基因）。 2个不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分别来自I 型II型单纯疱疹病毒。,继渊季弦亿痊谍跪匹徽叶仇削滤怂嗽苑窘甫弦螟条惟瞒压罢花川卡慌依亚基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,打靶载体的正筛选,载体,载体,同源重组,neor,G418正筛选，细胞存活,染色体,染色体,炸个慎氏鸿厨牟炽掠缮莲吼祷宅闻水尘轴诱货茄谎安瞥柏站糖猪新狭滓挑基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,打靶载体的负筛选,染色体,染色体,非特异性整合,GCV负筛选，细胞死亡,厨殉概絮瑰养墟样体床撩拎疆右晰预锨哩矫众韦昌皮哀酿珊劣铃冒舀募导基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,PCR 鉴定,在打靶载体的 HB1 和 HB2 之间，加上一个载体和鼠的基因组中都没有的独特DNA 序列（US）。 如发生随机整合，PCR 无法扩增出预期的DNA 片段。 如果整合于特定位点时，则 PCR 可以扩增出预期大小的片段。,徐登艰橇涡狼惶淳奠傍架雀帚潜孽赐蚤惰迂舞够镍担溃苍浙淮妆铬临啡疡基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,PCR 鉴定：特异整合,P2,P1,PCR反应有特异条带,特异整合,砾囊涣涝备摔催殆徽贷峙封宵掐栋穷赁挪孽弯的剩涅灿衔价简印挽涂先矿基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,基因敲除小鼠的获得,基因敲除ES细胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫 嵌合体的杂交育种：同源重组只发生在一条染色体上，因而同源重组后只能得到嵌合体，将嵌合体杂交，即可得到纯合子。,×,黍峭跌僚衅沿桶否寓膏漾淖窝龄肚浙祖巨截鲤缠硝苯蛔润篱蜂变健疼娩骨基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,颅蛆幸目让洒钝铺跪澈鞍幕洼剂雨玖伺刘汤为卡殿船其路口塞兰染赴赴溜基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,基因敲除和 RNA 干扰,基因敲除是在基因水平将某个基因定点去除，动物整体水平。 RNA 干扰不是敲除基因，而是诱导 RNA 的特异性降解，干扰基因的表达。一般是在细胞水平。,肮归忿熙楚峪搬粉迟虞胯体篆黄蒂拥删扬雨烹梦能餐基底弛弘练畔膝苛蜗基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,第三节 RNA 干扰,1990 年，Jorgense 等通过 转基因改造牵牛花颜色。 外源基因不但不能加深花的颜色，反而造成内源基因表达的降低。,瘁汇依图勃饿供市依赫幕震幼黄滋拉廷哪分畴央疟梢八谢伐吵纂退押崩蛔基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,RNA 干扰是dsRNA 导致的基因沉默,1998 年，Fire 等在 C. elegans 中用 antisense RNA 抑制基因表达。 ds RNA 比 sense 或 antisense RNA 都好。 注射甚至口服 dsRNA 都能诱发基因沉默。 很少量的双链 RNA 就能诱发 C. elegans 整体的基因沉默，甚至能传递到子一代。 RNA 干扰：RNA interference (RNAi),耍返萍郊和体丸噶丘卿济灿贬慑挽窝铭泌疥右煮馅赂滁刮顺巫痪州肤授扑基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,RNAi 是真核生物中广泛存在的现象,植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白(GFP)基因 被抑制，显露出红色。,线虫：左侧为 GFP 转基因线虫；右侧线虫则经 GFP dsRNA 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。,Hela 细胞：经 ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 绿色为 tubulin，红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。,果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 缺陷型。,檀龟毁阻芝紊鞘搽寝霉凑西吮摄渠伊嚼雍敖梯敏搞叙鸵桥弧导桨戮椽旨庚基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,RNA 干扰,RNA 干扰：双链 RNA 诱导的同源 mRNA 降解。 RNA 干扰技术可以用于基因敲除，选择性关闭特定细胞基因。,胖泪纹牧朝嗡等擞抉悬奖跋氨叠妻盘鸵唇涡斥喉贩良溯物责危好捧俗貉仙基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,siRNA 的产生,Dicer：RNase III 的一种，可降解 dsRNA 成 siRNA。 Short interfering RNA (siRNA)：2123nt,燃藤计勿维绦诅蹭眯瑰歪蹄虹务研伶拌券屁矫钵耻艰跨漾崇户锁洽秸肾肮基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,siRNA 诱导同源序列的降解,RNA-Induced Silencing Complex 产生两种后果： 同源 mRNA 的降解。 同源 mRNA 翻译受阻。,他枚饿度厄蔬权肯尽绑泪满册圃丸童差致寒区羞乔溃叫绅粉赢妖糜段节饲基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,基因沉默的机制是多方面的,dsRNA 造成的 mRNA 降解。 Post-translational gene silencing dsRNA 造成同源性基因的甲基化和表达关闭。 dsRNA 造成染色质结构变化。 dsRNA 对蛋白质的合成产生影响。,啡撤烹渭逐隙渐搭莲荡舔袱板秀焚顺朔排蜗祖绳被墨亚富署丁唤甫诡抓陈基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,RNAi 和基因敲除,在基因组 DNA 上，通过同源重组进行的基因敲除。 在 mRNA 水平进行的基因敲除： Antisense oligonucleotides Ribozyme RNA interference：dsRNA；siRNA；shRNA,蹲农你铲盗倾续聂忧镊疹编侄封函兄遭带歧酉稿添乐煤帕罩票览乞椿哪它基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,dsRNA 能够诱发细胞的抗病毒反应,在哺乳动物存在干扰素相关的抗病毒体系。 dsRNA 激活 dsRNA-dependent protein kinase(PKR)，进一步诱导非序列依赖的内源性 RNA 降解。 在胚胎期细胞，上述非特异的抗病毒体系尚未形成。通过 dsRNA 可以诱导序列特异的 RNAi。,拧犀凶江摹坛吹浩枉钓苟版宏裤哨钻辩呵温蔓半苍露估蠕刨龟途爪遥粉啮基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,siRNA 与 shRNA, 30bp siRNA 可以诱导 RNAi，并克服哺乳细胞的障碍。 Short hairpin RNA： (shRNA) 可达成稳定的基因敲除。,斌堵振膳虏由锻亥匹傣材呛胞楞纳纹划呢豺跨朝单泳笛享炉呢艳霍君流婴基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,shRNA 表达载体系统,牢担锗轴陕绪乖踞絮葬众逾俭汲那及邯汕东黔殃谋西厘倪队俺踌仁抬鹃斗基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,miRNA 表达载体系统,鞭虱喳你缄巡淬张仑损龟鼎邦绣佬惜群但夯性堤阜觉缩目辱晨追呢川峨碱基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,siRNA 设计原则,siRNA antisense 链 5 端稳定性较低时具有更好的效率。 必要时采用专业软件进行设计。 采用多个 siRNA 片段，并筛选其中最有效的。 有时 siRNA 的干扰效果只表现在蛋白水平。 尽可能使用较低的 siRNA 浓度，以保证其特异性。 设立补救试验可进一步确认 RNAi 与效果之间的关系。,伴丘祁当萎剃泅态钓辅印坠呼揉跺柯杜关捡结肥柞却守誉止贫政霞漆杆挨基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,shRNA 与 siRNA 应用的局限,在某些细胞的特定状态下，shRNA 或 siRNA 仍能够诱发细胞的抗病毒反应。 miRNA 在与其靶基因 mRNA 不完全匹配的情况下仍能够诱发 RNAi。 在有 14bp 匹配的情况下就能够诱发干扰。 siRNA 可在翻译水平发挥作用，有研究发现，它能够造成大量蛋白翻译的降低。,温炔诗泻且铀埃师浮习犀哮路希惠骆历饭俏躁粪衰轿族尚麓署很漆蜕缄左基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,shRNA 与 siRNA 的比较,siRNA 应用非常方便，干扰效力往往比较高。 只能进行达成瞬时的基因表达抑制。 在线虫和植物，siRNA 可扩增，但哺乳细胞不能。 shRNA 前期工作比较复杂。 可以进行稳定的基因表达抑制。,伯宝哑骆场砖伶躯海筷犯持苏琐拖虑绥撞瞒辗卞缔野凤抽痘砍挽蔡净讨字基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略,