液相色谱-质谱联用技术同时测定婴幼儿配方奶粉中甲基香兰素和乙基香兰素

液相色谱-质谱联用技术同时测定婴幼儿配方奶粉中甲基香兰素和乙基香兰素李小运，王浩 *（国家食品质量安全监督检验中心， 北京 100094）摘要 建立了食品中甲基香兰素和乙基香兰素的高效液相色谱- 串联四极杆质谱联用测定方法。该方法样品经酸沉蛋白后,以 SB-C18 柱（2.150 mm, 3.5m）分离，流动相为甲醇和水(33:67，V/V) ，电喷雾负离子 MRM 模式检测。该方法的检出限 0.1mg/kg，线性范围 0.01-1.0g/mL，加标回收率 80.084.1，相对标准偏差分别为 1.55和 1.81。关键词 液质联用仪，婴幼儿配方奶粉，甲基香兰素，乙基香兰素0 前言香兰素是重要的食品添加剂,其被广泛用作糖果、饼干、糕点、饮料等食品的增香剂 。香兰素主要包括甲基香兰素和乙基香兰素。最近，卫生部公布食品用香料、香精使用原则（征求意见稿） ，明确把纯乳等20种食品列为禁加食用香料香精范围，其中婴儿配方食品、较大婴儿和幼儿配方食品也拟被“禁香” ，而香兰素是婴幼儿配方奶粉经常添加的增香剂，但是还没有国标方法，因此,建立灵敏、准确、快速的婴幼儿配方奶粉中香兰素检测方法,为执法提供技术鉴定依据,是当务之急。目前,国内外测定香兰素的方法主要有光度法、高效液相色谱法、电化学法等 12，这些方法只能定量，不能准确定性，可能会造成假阳性的测定结果。本文将样品经酸沉蛋白后,通过液相色谱-质谱联用技术对其进行准确的定性定量测定,获得较满意的结果。1 材料与方法1.1 实验仪器，试剂，样品1.1.1 仪器液相色谱-串联质谱仪： Agilent 6410 型串联三重四极杆质谱，配Agilent1200型液相色谱仪（Agilent公司，美国） ； Milli-Q去离子水发生器（Milli-Q公司，美国)。 1.1.2 试剂乙腈：色谱纯。冰醋酸、盐酸、氢氧化钠：北京化工厂。以上均为分析纯。甲基香兰素和乙基香兰素：北京化学试剂公司。1.1.3 样品婴幼儿配方奶粉购自本地超市。1.2 分析条件1.2.1 色谱条件色谱柱：ZORBAX SB-C18 柱：3.5 m，2.1mm50mm；流速：0.25 mL/min；柱温：30；进样量：5L；流动相：甲醇+水（ 33：67，V/V） 。1.2.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI） ；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应检测；干燥气：N 2 ；雾化气压力： 275.8 kpa；干燥气温度：340 ；干燥气流速：8 L/min。甲基香兰素和乙基香兰素质谱分析的条件参数如下表 1： 表 1 甲基香兰素和乙基香兰素的质谱参数被测物质名称 定量离子 定性离子 碎裂电压/ V 碰撞能量/ V甲基香兰素 151.0/136.0 151.0/136.0；151.0/108.040 10/10乙基香兰素 165.0/136.0 165.0/136.0；165.0/92.140 10/201.3 样品处理准确称取 5.0 g 样品，用 25.0 mL 50热水溶解，超声 10min，用 5 mol/L 盐酸溶液调节 pH 值至 1.7，放置 2 min 后，再用 2.5 mol/L 氢氧化钠溶液调节其 pH 值至 4.5。将样品溶液移至 50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度后，倒入漏斗用快速定性滤纸自然过滤，弃去最初滤液，在 50 mL 锥形瓶中收集滤液，滤液过 0.20m 滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪分析。2 结果与讨论2.1 前处理方法的优化婴儿配方奶粉中蛋白质含量较高，因此，本方法先用 50热水超声提取，再经酸沉蛋白后直接用测定。实验证明，该法操作简单，易于推广，加标回收率大于 80.0%，可以满足婴儿配方奶粉中的香兰素日常检测要求。2.2 质谱条件的优化采用直接进样方式分别将浓度为 100 ng/mL 的甲基香兰素和乙基香兰素标准溶液分别注入离子源中，在负离子检测方式下进行母离子全扫描，得到甲基香兰素和乙基香兰素的准分子离子峰。以甲基香兰素和乙基香兰素的准分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，最后采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，然后再对得到的甲基香兰素和乙基香兰素的二级质谱参数如破碎电压、碰撞能量等进行优化，使甲基香兰素和乙基香兰素的定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳，得到甲基香兰素和乙基香兰素的最佳质谱参数（如表 1 所示） 。2.3 色谱条件的优化甲基香兰素和乙基香兰素属于中等极性化合物，为了有利于色谱峰的分离及锋形的改善，本方法分别采用 ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱、ZORBAX Eclipse SB-C18 和 ZORBAX SB-Aq 柱进行分离试验，发现 SB-C18 柱，采用甲醇-水（33：67，V/V）为流动相进行梯度洗脱分离效果较好。0-3 min 主要是洗脱样品测定液中极性较强的杂质；3-9min 主要是洗脱样品测定液中目标化合物。图 1 为加标样品总离子流图，从图中可以看出甲基香兰素和乙基香兰素得到较好的分离。5x1000.20.40.60.811.21.41.61.822.22.42.6- TIC MRM (* - *) 100819YP+BY1.dCounts vs. Acquisition Time (min)0.20.40.60.81 1.21.41.61.822.22.42.62.83 3.23.43.63.84 4.24.44.64.855.25.45.65.86 6.26.46.66.877.27.47.67.88 8.28.48.6图 1 加标样品中甲基香兰素和乙基香兰素的总离子流图2.2 标准曲线线性范围和方法检测限将逐级稀释的标准工作液分别进样 5L，测定结果经线性回归，线性范围、回归方程（y 为峰面积，Counts；x 为浓度，ug.L -1）相关系数和检出限见表2。表 2 甲基香兰素和乙基香兰素的回归方程、相关系数及检出限化合物 线性范围（g/mL） 线性回归方程 （y=a+bx） 线性相关系数 （r） 检出限(S/N3) /( mg/kg)甲基香兰素 0.01-1.0 y=97185.32x-501.23 0.9988 0.1乙基香兰素 0.01-1.0 y=11065.93x-976.65 0.9994 0.1注：进空白样,以基线 3 倍噪声值在标准曲线查得结果计算, 按测定方法计算,得到方法检出限。2.3 方法的回收率和精密度 称取空白样品 6 份,每份 5.0 g, 分别添加成浓度为 0.1mg/kg 或 1.0 mg/kg的待测样品,按供试品制备方法制备后,进行测定, 结果见表 3。从表 3 中的回收率及精密度数据可以看出，甲基香兰素和乙基香兰素的加标回收率在80.084.1之间，平均相对标准偏差分别为 1.55%和 1.81%（n=8） ，满足试验要求。表 3 加标样品回收率（%）样品编号 添加浓度(mg/kg) 甲基香兰素（%） 乙基香兰素（%）1 0.1 80.0 82.42 0.1 82.1 80.63 0.1 83.0 80.64 0.1 81.3 83.65 1.0 83.6 81.06 1.0 80.9 83.97 1.0 82.7 81.58 1.0 83.3 84.13 结论建立了婴幼儿配方奶粉中甲基香兰素和乙基香兰素的高效液相色谱串联质谱测定方法。该法样品经酸沉蛋白后，样品提取液经 C18 反相色谱柱进行有效分离，电喷雾离子化，串联质谱检测。甲基香兰素和乙基香兰素的品加标回收率 80.0%-84.1%,平均相对标准偏差分别为 1.55%和 1.81%（n=8）, 适用于婴幼儿配方奶粉中甲基香兰素和乙基香兰素的快速测定。参考文献1景丽洁，韩伟，闫光烈.用反相高效液相色谱法测定香兰素含量.食品科学，2006,27(4):2052072张国文，倪永年. 多元校正-光度法同时测定食品中香兰素和乙基麦芽酚. 分析科学学报，2005，21（1）：20-23作者简介：李小运，女，北京人， （1987-