g试验和gm试验厦门174张玲2015.8.3

G试验和 GM试验实验室检查中国人民解放军第一七四医院检验科张 玲 2001我国卫生部 “ 医院感染诊断标准（试行） ” 的具体诊断标准：1.在原发病的诊治过程中出现呼吸系统症状和体征、发热、白细胞增加；2. 线胸片出现不能解释的片状或团块状阴影；3.影像学提示有肺部病变，应用抗生素治疗过程中病情恶化，用一般细菌感染不能解释；4.连续次深部痰培养为同一种真菌；5.血、尿、便培养为同一种真菌。卫生部肺部真菌感染的诊断标准卫生部肺部真菌感染的诊断标准真菌感染诊断症状体征 特异性？影像学 特异性？真菌涂片、培养 敏感性？特异性？时间病理 特异！敏感性？侵入性早期、快速、敏感、特异、采样方便G试验、 GM试验生物标志物 (G和 GM试验 )分别被列入真菌诊断和治疗的指南 欧洲癌症治疗研究组织 (EORTC) 美国国家过敏症与传染病研究所霉菌病研究组(MSG)批准用于真菌诊断 (J Antimicrobial Chemotherapy 2008,61:S1, i3)。 中国血液病 /恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则 ( 第 3次修改版本 ) G试验作为侵袭性真菌感染临床诊断的指标 GM试验作为疗效判定的指标IFI诊断标准 确诊 : 病人有感染的危险因素 ;有临床症状 ;微生物培养阳性 ;组织检测阳性 ; 临床诊断 : 病人有感染的危险因素 ; 高分辨 CT出现阳性的影象特征 . 1-3-D葡聚糖试验 (G试验 )阳性 .并值上升 ; 广谱抗生素应用无效 ;疑似 : 病人有感染的危险因素 ;有临床症状或微生物检测 +微生物学标 准 （ 1）痰或支气管肺泡灌洗液培养呈霉菌（包括曲霉菌属、镰刀霉属、接合菌或放线菌属）或新型隐球菌阳性 ； （ 2）鼻窦抽取液直接镜检或细胞学检查，或培养呈霉菌阳性 ； （ 3）痰或支气管肺泡灌洗液经直接镜检或细胞学检查发现霉菌或隐球菌 ； （ 4）支气管肺泡灌洗液、脑脊液或 2份以上的血液样品呈曲霉菌抗原（半乳甘露聚糖检测、 GM试验）阳性 ； （ 5）血液中 (1,3)-D葡聚糖检测（ G试验）阳性 ； （ 6）血中隐球菌抗原阳性 ； （ 7）无菌体液中经直接镜检或细胞学检查发现真菌 ； （ 8）未留置尿管的情况下，连续 2份尿样培养均呈酵母菌阳性或尿检见念珠菌管型 ； （ 9）血培养呈酵母菌阳性 ； （ 10）肺部异常，与下呼吸道感染相关的标本中（血液、痰液和支气管肺泡灌洗液等）多次培养无任何致病细菌。获得有效治疗机会 预防用药 : 在 IFI的高危患者中 ,预先应用抗真菌药物以预 防 IFI的发生 . 经验治疗 : 患者有免疫缺陷 ,长期应用激素治疗后出现不 明原因的发热 ,广谱抗生素治疗 96h无效者,或起初有效 3-7天后再出现发热 ,在积极寻找 病因的同时 ,可经验性应用抗真菌治疗 .抢先先 治疗和确诊治疗 抢先治 疗 : 对已确立 临床诊断和高度疑似 的患者应用抗真菌药物 . 确诊治疗 :对确诊为 IFI的患者的治疗G试验原理 G试验检测的是真菌的细胞壁成分 -1,3-D- 葡聚糖（ BG），人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使血液中含量增高。 定植时 BG很少释放入血，因此可有助于鉴别真菌侵袭与定植。-(1,3)-D-葡聚糖细胞核（ 1-3） -D-Glucan鲎变鲎变 形形 细细 胞裂胞裂解物的解物的 G因子因子活化活化 G因子因子凝固凝固 酶酶 原原 凝固凝固 酶酶凝固蛋白原凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）G试验的临床价值 1 ,3-D 葡聚糖为真菌细胞壁成分 ,适用于除隐球菌和接合菌（毛霉菌）外的所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种。 诊断侵袭性真菌感染（如侵袭性念珠菌病、侵袭性曲霉菌病、肺孢子菌肺炎等）的方法之一 。 不能检测：隐球菌和接合菌 敏感性、特异性： 90左右 是早期真菌感染的敏感生物 标 志国产： MB-80（天津金山川）检测原理：动态浊度法Cut-off：阴性 10 pg/ml，中介 1020 pg/ml，阳性 20 pg/ml，儿童阳性 50pg/ml标本采集： 静脉采血 2 ml（绿帽管，肝素抗凝）。检测标本： 血液、尿液、脑脊液、胸腔积液、腹水等。 念珠菌、毛孢子菌、曲霉、镰刀霉、支顶孢霉、卡氏肺孢子菌 不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等） 无热原采血管（ BG-free）， 3h内送检 48h内 48 ， -20-70 冻存， -70 保存 2年， 仅可反复冻融 4次（尽可能不使用冻融标本） 检测环境要求高清洁！（安全柜）G试验：检测范围、要求高危人群监测监测人群 高危人群：血液系统恶性肿瘤，中性粒细胞减少，同种异体干细胞移植 不推荐在实体器官移植患者中常规监测监测频率 建议至少每周两次连续动态监测试验结果判断 连续两次检测 I 0.5，考虑阳性 结合临床正确解读试验阳性和阴性G试验假阳性的情况 使用纤维素膜进行血透，标本接触过纱布或其他含有葡聚糖的材料； 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； 标本中存在脂多糖； 操作者处理标本时存在污染； 使用多糖类抗癌药 物（ 如香菇多糖 ） ； 放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液； 服用多粘菌素 ,厄他培能 ,头孢噻肟、吡肟 , 磺胺也会不同程度引起假阳性。 某些细菌败血症（尤其是链球菌败血症）。G试验假阴性的情况 隐球菌具有厚壁包膜，生长缓慢，导致假阴性； 局灶性曲菌病， BG很少释放入血； 抗真菌药物的使用。G试验的优势和局限 优势：鉴别侵袭性感染与定植；不受机体免疫状态影响，早于临床诊断平均 4天；是早期真 菌感染的敏感生物标志。 局限：不能区分真菌的种类。 无热原采血管、清洁的检测环境 高特异性，连续 2次 G试验阳性，可提高敏感性 IFI早期诊断 比出现临床症状体征早约 10天 比 HRCT改变早约 9天 敏感性与感染严重程度（真菌负荷量）相关 动态反应感染程度和抗真菌治疗疗效 儿童 BG水平高于成人G试验：小结 与 GM试验联合可提高阳性率 2次或 2次以上阳性可降低假阳性率。 高危患者建议每周检测 1-2次。 高危人群动态监测。建议： GM试验的原理 GM试验检测的是半乳甘露聚糖（ glactomannan， GM），主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断； 半乳甘露聚糖是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁的一种多糖，菌细胞壁表面菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原； 检测法是一种微孔板双抗体夹心法，采用小鼠单克隆抗体 EBA-2，检测人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖。 双抗体夹心法 大鼠 EB-2A单克隆抗体 识别 15- - 呋喃半乳糖侧链 ELISA： 1ng/ml 乳胶凝集： 15ng/ml标本：血清 不打开， 28 ， 5d 长期保存 -70 仅可反复冻融 4次试剂保存： 28 C 微孔板： 28 ， 5w 洗液： 28 ， 14d 对照血清： -20 显色剂：室温避光 6hGM检测方法GM试验检测范围 GM%因曲霉菌属不同： 低：烟曲霉 黄曲霉 高：土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉 非特异性交叉反应：青霉 马尔尼菲青霉、新型隐球菌、头地霉 、组织胞浆菌 宛氏拟青霉、产黄青霉、指状青霉、顶孢霉、链格孢 、郁金香葡萄孢 、枝状枝孢霉 、多主枝孢霉 、尖镰孢 、深红酵母、红色发癣菌 、皮炎外瓶霉、 Wallemia ebiAquino VR, et al. Mycopahtologia. 2007, 163: 191-202.GM试验的临床价值 曲菌定植时极少释放入血，因此有助于鉴别侵袭与定植； GM释放量与菌量成正比，可以反映感染程度； 连续检测 GM可作为治疗疗效的监测； 在造血干细胞移植患者中的诊断敏感性高； 参考值： I0.5 为阳性 。标本采集： 静脉采血 5ml（红帽管）。检测标本： 血清标本。GM试验假阳性的情况 使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林 /他唑巴坦； 儿童和新生儿：假阳性 83% ，母乳或配方食品中双歧杆菌与 GM有交叉反应； 血液 透析：不能清除大分子 GM ； 自身免 疫性 肝炎等； 食用可能含有 GM的牛奶等高蛋白食物 。 高剂量使用激素。 化疗的严重黏膜炎的患者：谷类食物中的 GM抗原通过肠道入血 交叉反应真菌：青霉、拟青霉、隐球菌、头状地霉、组织胞浆菌等GM试验假阴性的情况 释放入血循环中的曲霉 GM并不持续存在而是会很快清除； 以前使用了抗真菌药物 ；三唑类降低 GM水平但：米卡芬净升高 GM水平（能够破坏真菌细胞壁，但不能清除） 病情不严 重（低侵袭性曲霉病，低曲霉负荷量）； 非粒细胞缺乏的患者 。GM试验的优势和局限 优势：鉴别曲霉菌侵袭性感染与定植；早于临床症状和影像学异常 1周；GM诊断侵袭性曲霉感染的敏感度高于 G试验；血清中存在时间较短，可作为疗效监测 。 局限：不能区分曲霉菌的种类。早期、快速、高特异性GM水平反映曲霉负荷量推荐用于恶性血液肿瘤、 HSCT患者曲霉脑病可考虑 CSF标本动态变化指导抗真菌药物使用结合患者临床情况进行分析！GM试验：小结G试验和 GM试验的联合使用种属 G试验 GM试验念珠菌属 镰 刀菌属 隐 球菌属 曲霉菌属 青霉 /拟 青霉 接合菌 纲 同 时测 定 G试验 和 GM试验 有助于早期 诊 断侵 袭 性真菌感染！G