第10章+++细胞染色体显示和分带技术

第 10章 细胞染色体显示和分带技术及其应用体外培养的细胞是研究细胞遗传最便利、最有效的方法和对象，也是揭示培养细胞性状的重要方面。第一节 性染色质检测在间期细胞核中，女性 X染色质和男性 Y染色质均可用特殊染色法显示出来 ,性染色质检查方法如下 :一、 X染色质显示法 女性： X染色质 ： Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色 结果：细胞质不着色，细胞核染成紫红色，核内 Barr 小体呈三角形 /半月形。二、 Y染色质显示法 男性： Y染色质 ：盐酸阿的平染色法 结果 ： Y染色质呈特别明亮的黄绿色荧光园点，可位于核内任何位置，但多见于中央部位，第二节 培养细胞染色体显示法 一、原理 显示染色体要选择分裂中期细胞，因细胞分裂处于中期时，染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体的最好阶段。 获得多量的中期分裂相及染色体分散均匀的理想分裂相可采取的措施如下 :1提高细胞分裂相数 （ 1）细胞的选择和处理 大多数传代细胞应选择对数生长期的细胞。初代淋巴细胞常用有丝分裂源 PHA、 ConA等刺激细胞。 （ 2）阻抑中期分裂 用秋水仙素 (Colchicine)，现常用它的衍生物秋水仙胺 (Colcemid)来破坏细胞有丝分裂中的纺锤丝，以发挥阻抑分裂中期的作用。由于 DNA合成并无干扰，因此随时间延长可截获很多中期分裂相，一般的用量：秋水仙素 0.04 0.8mg/L培养液，秋水仙胺0.004 0.08mg/L培养液。作用时间为 2 6小时。2促染色体分散措施 （ 1）低渗处理 一般用 0.075mol/L，在37 水浴中将上述细胞处理 20 40分钟，可使细胞体积胀大，染色体松散。 （ 2）固定 常用醋酸甲醇 (1:3)混合液，用时现用现配。 显示染色体方法很多，以下几种方法较为常用。二、传代细胞染色体检查 一、原理：秋水仙碱可使细胞停止在分裂中期，染色体长短恰倒好处。 二、方法：细胞类型：传代细胞系，外周血 LC，羊水，绒毛细胞等方法：秋水仙素 低渗 固定 染色 镜检末梢血培养法，Giemsa染色法显示人染色体第三节 染色体结构显示和检测 一、染色体显带原理和种类 二、染色体显带方法要点 三、原理 四、 常用染色体显带法 五、姐妹染色单体分化染色一、染色体显带原理和种类 （一）原理 染色体显带是沿着整个染色体的长轴，能显现出着色深浅不同。 横行走向的带 (Band)经特殊染色后，易着色的阳性带 (Positive Band)为含有 A-T多的染色体节段，相反， G-C多的则不易着色，为阴性带 (Negative Band)。 有报道，已被定位的正常基因和异常基因绝大部分都在阴性带区。人们推测，看家基因在阴性区带，人染色体能显示出近 2000个 G带。（二）种类 染色体显带是指沿着整个染色体轴能出现着色深浅不同的横纹。根据显带方法不同可分为：用奎吖因 (QM)、 阿的平(QD)荧光染色的带，称 “Q”带；用Giemsa染色显带称 “G”带； 用 Giemsa染色显示异染色质部分称 “C”带；用特殊方法处理后，显现出与 Q带和 G带相反的带型称 “K”带等。目前， Q、 G和 C三种带型较为常用，其中 G带更为多用。二、染色体显带方法要点 “老化 ”处理：将染色体制片后存放 310分钟或86 干燥 20 30分钟 显 Q带法：用奎吖因 (QM) 或阿的平 (QM)染色显带 Giemsa显 G带：胰酶消化 Giemsa染色显带 显 C带法 ：在预热至 65 的 5%Ba(OH)2液中 15分钟 Giemsa染色 15分钟显带 注意： 1、标本片老化处理很重要； 2、胰酶浓度和消化时间要事先熟知，消化要充分但不能过度； 3、中期分裂相要多而均匀，稍长一些为佳1中期染色体 为了获得满意的显带效果，需制备质量好的中期染色体标本，即须达到以下要求： 长度适宜，一般稍长一些，能显出更多的条带，这与加入秋水仙素的浓度和作用时间有关，要控制好。 染色体分散均匀无重叠，这与低渗有关，低渗不足染色体易发生重叠，过度易流失。 无严重单体分叉。2特殊处理 中期染色体标本显带效果的提高要经三个步骤： （ 1）标本片应先放置一段时间，称 “老化 ”处理，以 3 10天为宜。 （ 2）显带染色前要将标本加温预处理利于显带，预处理后的标本不必再老化。常用 80 干燥 20 30分钟。 （ 3）胰蛋白酶消化较好 (比用 NaOH、 尿素等好 )。三、常用染色体显带法 1显 Q带法 （ 1）将标本片于 pH6.0缓冲液中浸 5 10分钟后，再转浸入用 Soresen氏缓冲液 (pH6.0)配制的 0.2%的 QD或 QM染液中染色 5 10分钟 (见表12-3-1)。 （ 2）用 pH6.0的磷酸缓冲液漂洗 2次，每次 5分钟，于玻片上滴加 1 2滴新鲜缓冲液，加盖片。 （ 3）在荧光显微镜下观察。表 12-3-1 Soresen(100ml)缓冲液PHNa2HPO4(1/15mol/L)kH2PO4(1/15m0l/L) pHNa2HPO4(1/15mol/L)kH2HPO4(1/15mol/L) 5.29 2.5 97.5 6.81 50 505.59 5 95 6.98 60 405.91 10 90 7.17 70 306.24 20 80 7.38 80 206.47 36 74 7.73 90 106.64 40 60 8.04 95 52胰酶一 Giemsa显 G带法 (1)将中期染色体标本于 60 80 烘箱中烘 24小时或过夜，然后再浸入 0.025m磷酸缓冲液中(pH6.8)， 56 温浴 10分钟后，用现配的胰酶一Giemsa混合液消化和染色 10 30分钟，染色后用自来水冲洗，再用蒸馏水漂洗数次，凉干，二甲苯透明 2 3分钟，封入中性树脂中。 (2)将标本放于 40 80 烤箱中数小时或更长，用 0.25%胰蛋白酶热消化 7 15分钟，并不断轻轻摆动玻片，水洗后再用 Giemsa染液染 5 10分钟，用自来水冲洗，蒸馏水漂洗，凉干，二甲苯透明 2 3分钟，封入中性树脂中。3显 C带法 将中期染色体玻片先投入预热至 65 的 5%Ba(OH)2液中15分钟，取出玻片用自来水冲洗后，再将玻片投入预热至 65 的 2SCC液中 1小时 10分钟，待自来水冲洗后再过 pH7.4磷酸冲液，用 Giemsa染色 15分钟后镜检。 附： 2SCC液配方：称 NacL17.5g和枸椽酸钠 8.82g液于1000mL蒸馏水中。 5%Ba(OH)2：称 Ba(OH)22.5g溶于 50mL生理盐水中。 必须注意： 胰蛋白酶消化显带过程中，消化不足，带不出现。 消化过度，染色体变得膨胀和不着色。 要注意胰蛋白酶浓度和消化时间。 预处理或老化是显带的重要环节，干热处理简单易行，效果好。（见书后照片 6）末梢血培养法，Giemsa染色分带法显示人染色体人染色体 G带慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞 PH染色体核型四、姐妹染色单体分化染色 (一 )原理 细胞被培养在含有 5-溴脱氧尿苷 (5-Bromode Oxyurdine;BUdR)的培养基中，当细胞 DNA合成时， BUdR取代胸腺嘧啶核苷 (Thymidine.TdR)进入细胞增殖周期，第一周期每条染色单体 DNA双链都被 BUdR掺入 (TB、 TB)， 第二周期只有一条单体保留了无 BUdR旧链，另一条单体双链都有BUdR(TB、 TB)， 经荧光染料着色时 TB有强荧光， BB荧光弱