血清蛋白的分离——

聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。(2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板及圆盘电泳的操作技术。聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（ Acr）和交联剂 N， N 甲叉双丙烯聚酰胺（ Bis）聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。Acr和 Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺（ Ap），催化剂是四甲基乙二胺（ TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团。聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶体系有连续和不连续电泳之分。不连续电泳系统由浓缩胶和分离胶两种胶体组成，两种胶体分别由不同的 pH 的缓冲液和胶贮液配制而成，形成孔径不同的两种胶体 。 不连续电泳系统电泳分离过程中包括三种物理效应，即样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和凝胶的分子筛效 应 。本次试验采用不连续电泳系统 PAGE，通过三种效应将血清中各蛋白质组分按其分子大小、电荷多少不同进行分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳有圆盘电泳和垂直板电泳之分，但两者的原理完全相同 ，只是所用的电泳槽不同。由于时间问题，本次试验将分两组进行，一组使用圆盘，一组使用垂直板 。 夹心式垂直板电泳槽，圆盘电泳槽 ，电泳仪， 直流稳压电源，玻璃板（ 1313） ， 注射器及微量注射器 抽气泵， 干燥器，培养皿，玻璃棒，吸量管，烧杯，滴管，玻璃管，薄膜手套 ，滤纸， 日光灯制备分离胶、浓缩胶有关试剂：凝胶缓冲液，分离胶贮存液， 0.8%过硫酸铵 ；浓缩胶缓冲液，浓缩胶贮存液， 40%蔗糖溶液，核黄素。 Tris-甘氨酸电极缓冲液（ PH8.3） 已加入溴酚蓝指示剂的血清样品 染色液 （氨基黑） 1%琼脂（糖）溶液 脱色液 （ 7%乙酸溶液） 由学生自己配制一、 垂直板 聚丙烯酰胺凝胶电泳1.凝胶的制备：（ 1）安装夹心式电泳槽将长短玻璃板分别插到 U形硅橡框的凹形槽中（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），在长玻璃板下端与硅胶橡框交界的缝隙内加入已融化的 1%琼脂糖且两玻璃板内下端处处有琼脂糖（其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避免有气泡），琼脂凝固后，将硅胶橡框装入电泳槽内，以对角线的方式将螺丝帽旋紧。试剂名称 用量（ ml)分离胶 缓冲液 （ ph8.9）2.5ml分离胶 凝胶贮液 5.0ml蒸馏水 2.5ml将以上三种试剂 混合均匀后，置于真空干燥器中抽气 10min过硫酸铵 ， 置于真空干燥器中，抽气 10min10.0ml按上表格配胶，二者抽气后混合均匀， 小心不要在溶液中搅出气泡 ， 以免过多接触空气。迅速用滴管将混合后的分离胶装在二块玻璃板之间至短板上端约 3-4cm，并用注射器在起上面加一层水约 1mm使凝胶形成时有一水平面，（ 注意加水时，不要引起胶面的大波动 ） 。在室温中放置，当两界面出现不同折射率时表明已凝胶，时间大约 40 分钟，以出现折射率不同的界面为准，再室温下放置十分钟，使凝胶充分。将分离胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的水（ 注意不要碰破胶面 ），为下一步做准备。试剂名称 用量（ ml)浓缩胶缓冲液 （ ph6.7) 0.5ml浓缩胶贮液 1.0ml40%蔗糖 2.0ml将以上三种试剂 混合均匀后，置于真空干燥器中，抽气 10min核黄素 0.5ml按上表所示配胶，抽气后加核黄素 0.5ml,混匀， 立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上端约 0.5cm，插入加样梳，放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开始凝胶， 3050分钟左右凝好（凝缩胶变为 乳白色 为准），凝好后小心拔去加样梳。 将 Tris 甘氨酸 电极 缓冲液稀释 10 倍后倒入电泳装置的左、右槽中，短玻板一侧要稍微超过玻板，长玻板一侧只要越过电泳丝的高度。 用微量注射器通过缓冲液在每个加样凹槽中加入约 5ul的样品 。将样品端 (短玻璃的一边 )接直流稳压电泳仪的负极，接通冷却水 ，开始电泳。开始时电流控制在 10mA，待样品进入分离胶时，将电流调至 30mA左右。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘琼脂界面处 0.5cm 左右时， 电泳完成。将缓冲液回收至试剂瓶中，还可用 1-2 次 （注意将正负级的缓冲液分开回收 ） 。4.剥胶将固定螺丝旋松，取出硅橡胶框，将一块玻璃板轻轻剥开，然后用玻璃棒将胶板取下放入培养皿中。5.固定，染色在培养皿中倒入 氨基黑 染色液至覆盖胶板，染色分钟左右，此时染色与固定同时进行。 （染色液要回收利用）6.脱色用 7%乙酸浸泡数次，直至背景蓝色脱去。 1.凝胶的制备： （ 1）安装圆形玻管将洗净的玻璃管烘 干后用橡胶玻璃头封 严 ，放置在一边等待 灌胶 。(2) 分离胶制备 按垂直板的方案进行配胶，混匀后 迅速用滴管分装在玻璃管中至玻璃管上端约 2-3cm，并用注射器在起上面加一层水约 1mm使凝胶形成时有一水平面，在室温中放置，当两界面出现不同折射率是表明已凝胶，将分离胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的水（注意不要碰破胶面），为下一步做准备。(3) 浓缩胶制备 （同垂直板） ：按垂直板的方案进行配制，配制好后， 立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上端约 1cm，然后放于日光灯下 10 分钟 左 右浓缩胶就开始凝胶， 3050 分钟左右凝好（凝缩胶变为乳白色为准）。2.加样 将 电极 缓冲液稀释 10 倍后倒入电泳装置的上 .下槽中 （ 注意需没过玻璃管的上下端 ） ，用微量注射器通过缓冲液在每个玻璃管的凝胶表面加约 5ul 的样品3.电泳 将样品端 (上槽 )接直流稳压电泳仪的负极，下槽接直压电泳仪的正极 。 开始时电流控制在 1-2mA/管，待样品进入分离胶时，将电流调至 5mA 左右 /管。当蓝色染料迁移至距离玻璃管下缘 1-2cm 左右时， 停止电泳 。将缓冲液回收至试剂瓶中 （ 注意正负极分开回收 ） 。4.剥胶 将玻璃管从电泳槽中取下，用注射器吸满自来水后将针头插到凝胶与管壁之间，推动注射器，使针头在管壁和胶之间前进，胶条在水的压力及润滑的作用下自玻管中脱出，将其放入培养皿中 。5.固定，染色 ，脱色（同垂直板）由于与凝胶集合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止此现象， 所用器材均应严格地清洗。安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。用琼脂（糖）封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。 灌胶时，若担心琼脂封底不牢固，则可 在上、下贮槽中倒入蒸馏水，液面上面不能超过上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶中。其作用是增加压力，防止凝胶液渗漏。 浓缩胶 凝胶完全聚合后，必须放置 30min左右 ，使其充分 “老化 ”后，才能轻轻取出样品槽模板，切勿破坏加样凹槽底部