ec-sod在大肠杆菌中的可溶性表达

EC-SOD 在大肠杆菌中的可溶性表达 朱希强，袁勤生* （华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237） 摘要：目的在大肠杆菌中表达可溶性 EC-SOD。方法将表达质粒 EC-pet28a（+）转入宿主菌 BL21（DE3）plysS 中进行表达，在低温下培养含表达质粒 EC-pet28a（+）的宿主菌 BL21（DE3），通过 SDS-PAGE 电泳，观察其在超声上清中的表达。结果 EC-SOD 在 BL21（DE3）plysS 中表达，其量比在 BL21（DE3）降低约 20%，上清中有明显表达；在 20 和 15培养时，EC-SOD 在 BL21（DE3）的超声上清中有表达。结论 EC-SOD 在 BL21（DE3） plysS 中或在 BL21（DE3）中低温培养，均可实现部分上清中的表达。 关键词：EC-SOD；BL21（DE3）plysS；基因表达 The resolution expression of EC-SOD in supernatant by E. coli ZHU Xi-qiang, YUAN Qin-sheng （State Key Laboratory of Bioreactor Engineering and Institute of Biochemistry, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China） Abstract:ObjectiveTo express the resolution EC-SOD by E.coli.MethodsThe expression plasmid EC-pet28a（+） was transformed into BL21（DE3）plysS and BL21（DE3）containning expression plasmid EC-pet28a（+） was cultivated in low temperature. The expression of EC-SOD in supernatant was observed by SDS-PAGE. ResultsThe expressed amount of EC-SOD by BL21（DE3）plysS was less about 30% than that by BL21（DE3）, and it could express in supernatant obviously; EC-SOD could also express in supernatant by BL21（DE3）which was fermented in the temperature 20 and 15.ConclusionEC-SOD can express in supernatant by BL21（DE3）plysS or by BL21（DE3） fermented in low temperature. Key words: EC-SOD; BL21（DE3）plysS; gene expression 人胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）是目前已知的 3 种 SOD 同工酶之一，是含 Cu，Zn 金 属离子的分泌型糖蛋白，主要在血管壁高效表达1, 有显著降血糖，降血脂及降血压作用 24。EC-SOD 在组织中含量极少，分离纯化相当困难，因此进行基因克隆表达具有重要意 义。我室贺华君等构建了 EC-SOD 的表达质粒，并在 BL21（DE3）中进行了表达5。表达产 物均为包涵体。由于 EC-SOD 是四亚基的金属酶，每个亚基中含有 6 个巯基，使包涵体复性率 较低。为此我们尝试了将此基因在大肠杆菌中进行可溶性表达。 首先，将 EC-SOD 在 BL21（DE3）plysS 中进行表达。BL21（DE3）plysS 中含有质粒 plysS，此质粒可低水平持续表达 T7 溶菌酶，降低了 T7RNA 聚合酶的量，从而使重组基因的 表达水平下降。另将原工程菌在低温下培养，降低基因表达速度，使其有充分时间进行正确 折叠。以上措施均使 EC-SOD 在菌体超声上清中获得了表达。 1 材料、仪器与试剂 1.1 实验材料 EC-SOD 基因工程菌由本课题组构建；质粒 Pet-28a（）和菌株 BL21（DE3）由中科院上 海生物化学研究所吴祥甫教授提供；菌株 BL21（DE3）plysS 由本校张慧展教授的实验室提供； 种子培养基用 LB 培养基。 1.2 仪器及试剂 高速冷冻离心机（BIOFUGE-28RS，德国），超声波细粉破碎机（JY92-，宁波新芝科学 仪器研究所），回转式恒温调速摇瓶培养柜（HYG-，上海新蕊自动化设备有限公司）,紫外 分光光度计（UV-2100，UNICO），电泳槽（HOEFER,美国），硫酸卡那霉素（Kana, ultra pure grade，750mcg/mg,Amresco 分装，怡成生物公司），氯霉素（Cm, ultra pure grade，Amresco 分装，怡成生物公司），异丙-D-硫代半乳糖苷 IPTG（ultra pure grade,Calbiochem 分装，怡成生物公司），胰蛋白胨和酵母提取物（ Oxoid Ltd, England）,连苯三酚（E.Merk，BP），丙烯酰胺（进口分装，上海源聚生物科技有限公司）， N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Fluka 公司），其它均为国产分析纯试剂。 2 方法 2.1 表达质粒 EC-PET28a（+）转化 BL21（DE3）pLysS 感受态细胞及转化子扩增 取 2L 质粒（约 100ng），加入 90L 感受态细胞，转化后，涂布含 20mg/mL 氯霉素 （Cm）和 50mg/ mL 硫酸卡那霉素（Kana）的 LB 固体平板。37倒置培养. 挑取单菌落, 在 含 20mg/ mL Cm 和 50mg/ mL Kana 的 LB 固体平板上划线扩增。 2.2 转化子双质粒快抽鉴定 用牙签蘸取少量划线扩增的菌体，依法进行质粒快抽。取 5L 质粒溶液，用 Hind酶切 鉴定，同时以 plysS 和 EC-pet28a（+）做对照。 2.3EC-SOD 在 BL21（DE3）和在 BL21（DE3）pLysS 中表达量的比较 取含表达质粒的 BL21（DE3）和 BL21（DE3）pLysS 甘油种各 50L, 分别接种于 30mL 含 50mg/mLKana 及 20mg/mLCm 和 50mg/mLKana 的 LB 培养液中，37条件下培养过夜。按 1%接 种量翻二级 LB 瓶,抗生素种类和浓度同上。约 2h 后,波长 600nm 处测吸光度 A 值，当 A 达到 0.40.6 时，加 1.0mmol/LIPTG 诱导，取同量菌体，处理后进行 SDS-PAGE 电泳6。 2.4EC-SOD 在 BL21（DE3）pLys 超声上清中的可溶性表达 按以上方法培养菌体，诱导 4h 后收集菌体。加 Triton-EDTA 缓冲液 5mL，混匀后超声， 功率为 300W,时间 5s,间隔 5s,共超声 90 次。10000r/min 离心 10min，收集上清，加 2 SDS 缓冲液，沸水中煮沸 10min，15000r/min 离心 10min，进行 SDS-PAGE 蛋白质电泳。 2.5 培养温度对 EC-SOD 在 BL21（DE3）中表达量的影响 37条件下 LB 摇瓶同时培养 4 瓶菌体，每瓶体积均为 30mL 当 A600nm 为 0.40.6 时，分 别用 1mmol/L IPTG 诱导，然后分别置 30，25，20 及 15条件下培养，培养时间分别为 5，10，20 及 35h, 收集不同温度培养下的相同菌体离心后加 1 SDS 缓冲液，沸水中煮沸 10min，15000r/min 离心 10min，进行 SDS-PAGE 蛋白质电泳。 2.6EC-SOD 在 BL21（DE3）中的可溶性表达 培养条件同上。收集不同温度培养下的菌体，加入含溶菌酶（0.1mg/mL）的 Triton-EDTA 缓冲液 4mL，超声破碎菌体，超声功率为 500W，时间为 5s，间隔 5s。共超声 100 次。离心后 收集上清，加 2 SDS 缓冲液，沸水中煮沸 10min，15000r/min 离心 10min，进行 SDS-PAGE 蛋白质电泳。 3 结果 3.1 转化子双质粒快抽鉴定 结果见图 1。转化子中所含的质粒经 Hind酶切后，产生 3 个大小不同的片段，其大小与 质粒 plysS 和 EC-pet28a（+）单独用 Hind酶切产生的片段相对应，说明该转化子中除含有 质粒 EC-pet-28（+）外，还含有 plysS 质粒， 图 1 转化子双质粒快抽鉴定 1.plysS 酶切后；2. EC-pet-28a（+）酶切后； 3.DNA marker；4.转化子双质粒酶切 3.2EC-SOD 在 BL21（DE3）和在 BL21（DE3）plysS 中表达量的比较 SDS-PAGE 分析结果表明，hEC-SOD 在 BL21（DE3）plysS 及 BL21（DE3）中均可以表达， 经扫描分析，显示相同量菌体中目的蛋白在前者中的表达量比后者降低了约 20%，说明质粒 plysS 起到了降低蛋白表达量的作用，结果见图 2。 3.3EC-SOD 在 BL21（DE3）plys 超声上清中的可溶性表达 SDS-PAGE 分析结果表明，hEC-SOD 在 BL21（DE3）的超声上清中没有表达，在 BL21（DE3）plysS 菌体超声上清中有少量表达，但大部分仍以包涵体形式存于沉淀中，结果 见图 3。 图 3EC-SOD 在 BL21（DE3）plys 超声上清中的可溶性表达 1.EC-SOD 在 BL21（DE3）中的表达超声上清；2.标准蛋白 marker； 3. EC-SOD 在 BL21（DE3）plys 超声上清中的可溶性表达； 4. EC-SOD 在 BL21（DE3）plys 超声沉淀中的包涵体表达 3.4 培养温度对 EC-SOD 在 BL21（DE3）中表达量的影响 结果表明，随着培养温度降低，EC-SOD 表达量明显降低，结果见图 4。在 20培养时，表达 条带清晰可见，15时表达量已经很少。 图 4 不同细胞培养温度对蛋白的影响 1. 标准蛋白 marker；2.30培养时的表达；3. 25培 养时的表达；4. 20培养时的表达；5. 15培养时的表达 3.5EC-SOD 在 BL21（DE3）中的可溶性表达 结果表明，菌体在 20培养时，超声上清中开始有 EC-SOD 少量表达，15培养时，超声上 清中 EC-SOD 表达较明显，但表达量不大。结果见图 5。 图 5EC-SOD 在 BL21（DE3）中的可溶性表达 1.标准蛋白 marker；2. 30培养时的超声上清； 3. 25培养时的超声上清；4.20培养时的 超声上清；5.15培养时的超声上清 4 讨论 重组基因在大肠杆菌中经常是以包涵体形式表达的，其主要原因是基因表达量太高，来不 及进行正确折叠，此外，大肠杆菌中缺乏外援基因正确折叠系统，使基因的正确折叠更加困 难。虽然包涵体可减少分离纯化的麻烦，但对某些基因来讲，包涵体的体外复性率较低，因 此要得到足够量的折叠正确的蛋白质是十分困难的。在真核中表达目的基因可得到有活性的 蛋白，但相对大肠杆菌而言，真核细胞培养本身成本较高，因此，探讨外源基因在大肠杆菌 中的可溶性表达具有重要意义。 实现基因在大肠杆菌超声上清中的可溶性表达，最常用的方法就是改变细胞培养条件，如 温度和 pH 等，使细胞生长速度减慢，生长周期延长，相应的使基因表达时间延长，使其有足 够的时间进行正确折叠。改变培养条件还可以影响蛋白合成酶的活性，从而降低蛋白质的合 成量。本实验中，采用降低温度的办法，表明随着温度降低，相同菌体外源基因的表达量明 显下降。对超声上清进行 SDS-PAGE，结果表明，菌体在 20培养时，超声上清中开始 EC- SOD 少量表达，15培养时，超声上清中 EC-SOD 表达较明显，但表达量不大。实验还表明， 在超声沉淀中，仍存有大量的外源基因的包涵体。 PlysS 质粒对基因表达量的降低是十分明显的，而且整个过程中不影响细菌的生长，在短时 间内实现了基因的可溶性表达，因此比降低温度的方法更有效。在 BL21（DE3）plys 中表达 时，因为含双质粒，操作相对较麻烦，而且表达质粒转化 BL21（DE3）plys 时转化率相对较 低。 参考文献 1Oury T D, Chang L Y, Markloud S L, et al. Immunocytochemical localization of extracellular superoxide dismutase in human lungJ. Lab Invest, 1994，70：889- 898. 2Adachi T, Ohta H, Hirano K, et al. Nonenzymic glycation of human extracellular superoxide dismutaseJ. Biochem J, 1991, 279（Part）:263-267. 3Griendling