pcr技术及应用

PCR 技术的研究与应用 班级：0814541 学号：081454115 姓名：刘俊 摘要 随着分子生物学的发展，PCR 技术的应用已由实验室中的探索发展到各项事业的 应用中的一种技术。从研究 PCR 技术及相关注意操作到 PCR 技术在分子生物学、 遗传学、医学甚至考古学等方面的应用。当然，PCR 技术的开发仍需进一步完善 其精确度和准确度，其应用前景将会在众多领域得到体现 关键字 PCR Taq 酶 引物 PCR 技术应用 一、PCR 技术的基本原理及特点 PCR 技术，即聚合酶链式反应，是美国 cetus 公司人类遗传研究室的科学家 K.B.Mullis 于 1983 年发明的一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法，鼓又称基因的体 外扩增法。 1、PCR 技术的基本原理 首先是双链 DNA 分子在临近沸点的温度下加热时分离成两条单链 DNA 分子，然 后 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板并利用反应混合物中的四种 dNTPs 合成新生 DNA 互补链。此外，新合成 DNA 聚合酶同时需要有一小段双链 DNA 来启动（引 导）新链的合成。 【1】 一般过程是： 反应系统加热到 9095，底物双链 DNA 变性成两条单链 DNA，作为互补链聚合 反应的模板 降温至 3760，使两条引物分别与模板 DNA 的 3一侧的互补序列杂交（复性） 升温至 7075，耐热性 DNA 聚合酶催化引物按 53方向延伸，合成模板 DNA 链的互补链。 【2】 2、PCR 技术的特点 PCR 技术快速敏感，简单易行，其原理也并不复杂，与细胞内的 DNA 复制过程十分 相似，其中需要引物，DNA 模板，四种脱氧核苷三磷酸（dNTTs）及 DNA 聚合酶。 然而，PCR 技术有其固定的特点。 新合成 DNA 链的起点是由在反应混合物中的一队寡核苷酸引物在模板 DNA 链两 端的退火位点决定的。 PCR 反应的最后理论最高值得到的结果应为 2n。 【3】 二、 DNA 聚合酶 在早期进行 PCR 反应中使用的是大肠杆菌 DNA 聚合酶的 Klenow 大片段，但此酶 是热敏感的，在双链 DNA 解链所需的高温下，会被破坏掉。因此，每个循环都需要 添加聚合酶。 1988 年 R.K.Saiki 等人成功将 TaqDNA 聚合酶用于 PCR 扩增，提高了反应的特异性和 敏感性。耐高温的 TaqDNA 聚合酶最初是由 Erlich 于 1986 年从一种生活在温度高达 75的热泉中的细菌,即水生嗜热菌中分离出来的,他的 DNA 聚合酶在此高温下能很好 的工作,在 94也能稳定较长时间,这种酶在 95下半衰期长达 38 分钟,其最适温度是 72. 然而,在体外进行的纯化 TaqDNA 聚合酶已经失去了 35方向的校正活性. TaqDNA 聚合酶具有类似脱氧核苷酸末端转移酶的功能,可在新合成的双链产物的 3 端加上 poly(dA),这是一个非模板的碱基合成.【4】 三、 引物 引物是指在 OCR 反应中与待扩增的靶 DNA 区段两翼互补的寡聚核苷酸,其本质是单链 DNA 片段,PCR 扩增产物的大小及扩增的靶序列在基因组中的位置是由引物限定的.因此,引 物的选择对 PCR 成功与否具有决定意义. 引物设计质量是影响 PCR 扩增的关键因素，一般要考虑以下几个问题： 1、长度 引物的长度一般为 1630bp 为宜，最佳为 2024bp，不形成稳定的复合物， 更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高有效性，扩增产物会增多 2、G+C 含量一般为 40%60%为佳，两条引物的 G+C 含量应尽量相似，Tm 最好接近， 差异最好在 1以内部超过 5。 3、两个引物之间不应发生互补，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶连续排列，避免同源序列。 4、引物内部避免形成次级结构，尤其是发卡结构，若用人工判断，引物自身连续互补 碱基不能大于 3bp。 5、引物的延伸从 3端开始，3端不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，3 端最后的一个碱基最好是 G 或 C。 6、引物的 5端限定着 PCR 产物的长度，它对扩增产物的特异性影响不大。因此，可 以被修饰而不影响扩增的特异性。 7、引物的 3端不要终止于编码区或密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并， 会影响特异性与效率。 【5】 4、PCR 反应得条件 聚合酶链式反应的条件主要考虑以下几个方面：PCR 反应体系的配制，变性的温度与 时 间，退火的温度与时间，延伸的温度与 时间，循环次数等。 1、PCR 反应体系的设制 PCR 是一种体外条件下模拟生物体内 DNA 复制达到在很短的时间内大量扩增的特异 DNA 片段的技术。因此，反应体系中除添加 DNA 模板，一对寡聚核苷酸引物，适量的 dNTPs，耐热 DNA 聚合酶外，还应包含 Mg2+的维系 DNA 聚合酶活性的缓冲液系统。 2、变性的温度与时间 在 PCR 反应中，能否成功地使 DNA 和 PCR 产物充分变性是反应成败的关键。一般情况 下，9395足以使模板 DNA 变性，但反应温度不能过高，否则影响酶的活性。变 性所需的时间与 DNA 分子的长度有关，DNA 分子越长，则所需时间越长。 3、退火的温度与时间 引物与模板复性所需的退火温度与时间取决于引物的长度，碱基组成及其浓度。引物 长度越短，G+C 含量越低，所需退火温度就越低。 引物退火温度可通过 Tm=4（G+C)+2(A+T)粗算，一般在算出的 Tm 值上减去 5，即为 较合适的反应设计退火温度。 4、延伸的温度及时间 延伸的温度取决于使用 DNA 聚合酶的最是温度。一般选择在 7075之间，最适 72。 过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，PCR 反应延伸的时间视待扩增片段的长度 决定。在最适温度下，核苷酸的渗入率为每秒 35100 个核苷酸。延伸时间过长会导 致非特异性扩增带的出现。 5、循环次数 循环次数决定 PCR 扩增的程度，通常情况下，PCR 循环次数主要取决于反应体系中最 初模板 DNA 的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量。一般循环次数在 3040。 【6】 5、PCR 技术的应用 1、分子生物学的理论研究 运用 PCR 方法可进行 DNA 序列的分析，尤其对特殊序列的 DNA，如 AT 丰富区，GC 丰富区。长的卡夹结构等的分析，还可以进行核苷酸的定点突变，测定染色体上两 个位点之间的重组值，制备高标记的 DNA 探针等理论研究。 2、临床医学上的研究 可检测由基因的缺失、转位、单基因的点突变或者由于某种致病基因的存在（如遗 传或病毒感染等）所引起的各种疾病。 3、法医学和刑事侦破上的应用 应用聚合酶链式反应可以从罪犯的一根头发或一滴血斑中获得有关罪犯的基因类型 的证据。也可以进行亲子鉴定。 4、考古学上的应用 由于 PCR 对基因组 DNA 的完整性要求不高，而对分子考古学极为有用，可判定生物 的种类间的亲缘关系，进化途径等。 【7】 参考文献 【1】吴乃虎 基因工程原理 第二版 上册 科学出版社 2003.5 100101 【2】楼士林 基因工程 科学出版社 2003.9 5455 【3】吴乃虎 基因工程原理 第二