分子生物学论文

分子生物学课程论文 基因治疗与基因诊断的研究与发展 邓小红 临床医学 08 级 3 班 200805090346 摘 要 ： 基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由 于分子生物学的理论及技术方法，特别是重组 DNA 技术的迅速发展，使人们 可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分 子水平的研究，并已取得了重大的进展。因此在 20 世纪 70 年代末诞生了基因 诊断(gene diagnosis)；随后于 1990 年美国实施了第一个基因治疗(gene therapy) 的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术 与医学相结合的范例。 关键词：基因治疗 基因诊断 重组 DNA 英 文 题 目 ： Molecular biology course in dissertation Molecular biology curriculum paper gene treatment and gene diagnosis research and development Deng Xiaohong clinical medicine 08 levels of 3 classes 200805090346 Summary: gene-diagnosing and gene therapy in the relatively short time from theoretical ideas into reality, mainly due to the molecular biology of theory and techniques, in particular the recombinant DNA technology is developing rapidly, so that people can build a variety of carriers in the laboratory, cloning and analysis of target genes. The disease can drill down to the molecular level research and has made significant progress. Thus, in the late 1970s was born gene diagnosis (gene diagnosis); subsequently, in 1990, United States implemented the first gene therapy (gene therapy) clinical trials programme. Visible, genetic diagnosis and gene therapy is a modern molecular biology of theory and technology combined with the medicine. Keywords: gene therapy gene-diagnosing recombinant DNA 1 引 言 20 世 纪 后 半 叶 以 来 ， 由 于 分 子 生 物 学 的 崛 起 ， 人 们 进 入 了 合 成 代 谢 与 代 谢 调 节 的 研 究 。 这 一 阶 段 ， 细 胞 内 两 类 重 要 的 生 物 大 分 子 -蛋 白 质 与 核 酸 ， 成 为 研 究 焦 点 。 20 世 纪 50 年 代 初 期 发 现 了 蛋 白 质 的 螺 旋 的 二 级 结 构 形 式 ； 更 具 里 程 碑 意 义 的 是 1953 年 提 出 的 DNA 双 螺 旋 结 构 模 型 ， 为 揭 示 遗 传 信 息 传 递 规 律 奠 定 了 基 础 ， 是 生 物 化 学 发 展 进 入 分 子 生 物 学 时 期 的 重 要 标 志 。 20 世 纪 70 年 代 ， 重 组 DNA 技 术 的 建 立 不 仅 促 进 了 对 基 因 表 达 调 控 机 制 的 研 究 ， 使 基 因 操 作 无 所 不 能 ， 而 且 使 人 们 主 动 改 造 生 物 体 成 为 可 能 。 基 因 诊 断 和 基 因 治 疗 也 是 重 组 DNA 技 术 在 医 学 领 域 应 用 的 重 要 方 面 。 随 着 对 各 种 疑 难 疾 病 的 深 入 研 究 ， 和 分 子 生 物 学 日 新 月 异 的 发 展 ， 传 统 的 诊 断 治 疗 手 段 无 法 解 决 的 一 些 重 要 问 题 。 通 过 对 生 物 体 在 分 子 水 平 上 的 研 究 ， 基 因 诊 断 与 治 疗 的 作 用 逐 渐 显 露 出 来 ， 尤 其 是 许 多 遗 传 疾 病 。 2 传 统 对 疾 病 的 诊 断 主 要 是 以 疾 病 的 表 型 改 变 为 依 据 ， 如 患 者 的 症 状 、 血 尿 各 项 指 标 的 变 化 ， 或 物 理 检 查 的 异 常 结 果 ， 然 而 表 型 的 改 变 在 许 多 情 况 下 不 是 特 异 的 ， 而 且 是 在 疾 病 发 生 的 一 定 时 间 后 才 出 现 ， 因 此 常 不 能 及 时 作 出 明 确 的 诊 断 。 现 知 各 种 表 型 的 改 变 是 由 基 因 异 常 造 成 的 ， 也 就 是 说 基 因 的 改 变 是 引 起 疾 病 的 根 本 原 因 。 基 因 诊 断 是 指 采 用 分 子 生 物 学 的 技 术 方 法 来 分 析 受 检 者 的 某 一 特 定 基 因 的 结 构 （ DNA 水 平 ） 或 功 能 （ RNA 水 平 ） 是 否 异 常 ， 以 此 来 对 相 应 的 疾 病 进 行 诊 断 。 基 因 诊 断 有 时 也 称 为 分 子 诊 断 或 DNA 诊 断 (DNA diagnosis)。 基 因 诊 断 是 病 因 的 诊 断 ， 既 特 异 又 灵 敏 ， 可 以 揭 示 尚 未 出 现 症 状 时 与 疾 病 相 关 的 基 因 状 态 ， 从 而 可 以 对 表 型 正 常 的 携 带 者 及 某 种 疾 病 的 易 感 者 作 出 诊 断 和 预 测 ， 特 别 对 确 定 有 遗 传 疾 病 家 族 史 的 个 体 或 产 前 的 胎 儿 是 否 携 带 致 病 基 因 的 检 测 具 有 指 导 意 义 。 2 基 因 诊 断 的 原 理 与 方 法 2.1 基 因 诊 断 的 原 理 疾 病 的 发 生 不 仅 与 基 因 结 构 的 变 异 有 关 ， 而 且 与 其 表 达 功 能 异 常 有 关 。 基 因 诊 断 的 基 本 原 理 就 是 检 测 相 关 基 因 的 结 构 及 其 表 达 功 能 特 别 是 RNA 产 物 是 否 正 常 。 由 于 DNA 的 突 变 、 缺 失 、 插 入 、 倒 位 和 基 因 融 合 等 均 可 造 成 相 关 基 因 结 构 变 异 ， 因 此 ， 可 以 直 接 检 测 上 述 的 变 化 或 利 用 连 锁 方 法 进 行 分 析 ， 这 就 是 DNA 诊 断 。 对 表 达 产 物 mRNA 质 和 量 变 化 的 分 析 为 RNA 诊 断 (RNA diagnosis)。 2.2 基 因 诊 断 的 方 法 基 因 诊 断 是 以 核 酸 分 子 杂 交 (nucleic acid molecular hybridization)和 聚 合 酶 链 反 应 （ PCR） 为 核 心 发 展 起 来 的 多 种 方 法 ， 同 时 配 合 DNA 序 列 分 析 ， 近 年 新 兴 的 基 因 芯 片 可 能 会 发 展 成 为 一 种 很 有 用 的 基 因 诊 断 方 法 。 DNA 诊 断 常 用 检 测 致 病 基 因 结 构 异 常 的 方 法 有 下 列 几 种 。 斑 点 杂 交 ： 根 据 待 测 DNA 样 本 与 标 记 的 DNA 探 针 杂 交 的 图 谱 ， 可 以 判 断 目 标 基 因 或 相 关 的 DNA 片 段 是 否 存 在 ， 根 据 杂 交 点 的 强 度 可 以 了 解 待 测 基 因 的 数 量 。 等 位 基 因 特 异 的 寡 核 苷 酸 探 针 （ allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe） 杂 交 ： 是 一 种 检 测 基 因 点 突 变 的 方 法 ， 根 据 点 突 变 位 点 上 下 游 核 苷 酸 序 列 ， 人 工 合 成 约 19 个 核 苷 酸 长 度 的 片 段 ， 突 变 的 碱 基 位 于 当 中 ， 经 放 射 性 核 素 或 地 高 辛 标 记 后 可 作 为 探 针 ， 在 严 格 杂 交 条 件 下 ， 只 有 该 点 突 变 的 DNA 样 本 ， 才 出 现 杂 交 点 ， 即 使 只 有 一 个 碱 基 不 配 对 ， 也 不 可 能 形 成 杂 交 点 。 一 般 尚 合 成 正 常 基 因 同 一 序 列 ， 同 一 大 小 的 寡 核 苷 酸 片 段 作 为 正 常 探 针 。 如 果 受 检 的 DNA 样 本 只 能 与 突 变 ASO 探 针 ， 不 与 正 常 ASO 探 针 杂 交 ， 说 明 受 检 二 条 染 色 体 上 的 基 因 都 发 生 这 种 突 变 ， 为 突 变 纯 合 子 ； 如 果 既 能 与 突 变 ASO 探 针 又 能 与 正 常 ASO 探 针 杂 交 ， 说 明 一 条 染 色 体 上 的 基 因 发 生 突 变 ， 另 一 条 染 色 体 上 为 正 常 基 因 ， 为 这 种 突 变 基 因 的 杂 合 子 ； 如 果 只 能 与 正 常 ASO 探 针 杂 交 ， 不 能 与 突 变 ASO 杂 交 ， 说 明 受 检 者 不 存 在 该 种 突 变 基 因 ， 如 图 21-1 所 示 。 若 与 PCR 方 法 联 合 应 用 ， 即 PCR/ASO 探 针 杂 交 法 (PCR/ASO probe hybridization)， 是 一 种 检 测 基 因 点 突 变 的 简 便 方 法 ， 先 用 PCR 方 法 扩 增 突 变 点 上 下 游 的 序 列 ， 扩 增 产 物 再 与 ASO 探 针 杂 交 ， 可 明 确 诊 断 突 变 的 纯 合 子 和 杂 合 子 。 此 法 对 一 些 已 知 突 变 类 型 的 遗 传 病 ， 如 地 中 海 贫 血 、 苯 3 丙 酮 尿 症 等 纯 合 子 和 杂 合 子 的 诊 断 很 方 便 。 也 可 分 析 癌 基 因 如 H-ras 和 抑 癌 基 因 如 p53 的 点 突 变 。 单 链 构 象 多 态 性 （ single strand conformation polymorphism, SSCP） 分 析 相 同 长 度 的 单 链 DNA 因 其 序 列 不 同 ， 甚 至 单 个 碱 基 不 同 ， 所 形 成 的 构 象 不 尽 相 同 ， 在 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 时 速 度 就 不 同 ， 若 单 链 DNA 用 放 射 性 核 素 标 记 ， 显 影 后 即 可 区 分 电 泳 条 带 。 一 般 先 设 计 引 物 对 突 变 点 所 在 外 显 子 进 行 扩 增 ， PCR 产 物 经 变 性 成 单 链 后 进 行 电 泳 分 析 。 PCR/SSCP 方 法 ， 能 快 速 、 灵 敏 、 有 效 地 检 测 DNA 突 变 点 ， 如 图 21-2， 此 法 可 用 检 测 点 突 变 的 遗 传 疾 病 ， 如 苯 丙 酮 尿 症 、 血 友 病 等 ， 以 及 点 突 变 的 癌 基 因 和 抑 癌 基 因 。 限 制 性 内 切 酶 图 谱 （ restriction map） 分 析 ， 如 果 DNA 突 变 后 改 变 了 某 一 核 酸 限 制 性 内 切 酶 的 识 别 位 点 ， 使 原 来 某 一 识 别 位 点 消 失 ， 或 形 成 了 新 的 识 别 位 点 ， 那 么 相 应 限 制 性 内 切 酶 片 段 的 长 度 和 数 目 会 发 生 改 变 。 一 般 基 因 组 DNA 经 该 种 限 制 性 内 切 酶 水 解 ， 再 做 Southern 印 迹 ， 根 据 杂 交 片 段 的 图 谱 ， 可 诊 断 该 点 突 变 ， 如 图 21-3 所 示 。 如 果 用 PCR 扩 增 该 突 变 点 的 外 显 子 ， PCR 产 物 经 该 种 酶 消 化 后 ， 进 行 琼 脂 糖 电 泳 ， 溴 乙 锭 染 色 后 可 直 接 观 察 片 段 的 大 小 及 数 目 。 此 法 可 用 于 检 测 有 些 限 制 性 内 切 酶 识 别 位 点 消 失 的 遗 传 疾 病 ， 如 镰 状 细 胞 贫 血 。 或 基 因 缺 失 的 疾 病 如 地 中 海 贫 血 症 ， 单 纯 性 生 长 激 素 缺 乏 症 等 。 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 （ restriction fragment length polymorphism ,RFLP） 遗 传 连 锁 分 析 人 群 中 个 体 间 DNA 的 序 列 存 在 差 异 ， 据 估 计 每 100-200 个 核 苷 酸 中 便 有 1 个 发 生 突 变 ， 这 种 现 象 称 为 DNA 多 态 性 。 有 些 DNA 多 态 性 可 改 变 某 一 限 制 性 内 切 酶 的 识 别 位 点 ， 因 而 产 生 了 DNA 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 。 RFLP 按 孟 德 尔 方 式 遗 传 ， 在 某 一 特 定 的 家 庭 中 ， 如 果 某 一 致 病 基 因 与 特 定 的 多 态 性 片 段 连 锁 ， 可 以 遗 传 给 子 代 ， 因 此 这 一 多 态 性 片 段 可 作 为 遗 传 标 记 ， 来 判 断 该 家 庭 成 员 或 胎 儿 的 基 因 组 中 是 否 携 带 该 致 病 基 因 ， 见 图 21-4， 此 法 可 用 于 诊 断 甲 型 血 友 病 、 苯 丙 酮 尿 症 、 享 延 顿 舞 蹈 病 等 。 DNA 序 列 分 析 对 致 病 有 关 的 DNA 片 段 进 行 序 列 测 定 ， 是 诊 断 基 因 异 常 （ 已 知 和 未 知 ） 最 直 接 和 准 确 的 方 法 。 RNA 诊 断 RNA 诊 断 主 要 是 分 析 基 因 的 表 达 功 能 ， 检 测 转 录 物 的 质 和 量 ， 以 判 断 基 因 转 录 效 率 的 高 低 ， 以 及 转 录 物 的 大 小 。 RNA 印 迹 （ Northern blot） RNA 印 迹 是 检 测 基 因 是 否 表 达 ， 表 达 产 物 mRNA 的 大 小 的 可 靠 方 法 ， 根 据 杂 交 条 带 的 强 度 ， 可 以 判 断 基 因 表 达 的 效 率 。 RT-PCR 是 一 种 检 测 基 因 表 达 产 物 mRNA 灵 敏 的 方 法 ， 若 与 荧 光 定 量 PCR 结 合 可 对 RT-PCR 产 物 量 进 行 准 确 测 定 。 3 基 因 诊 断 的 应 用 3.1 遗 传 病 的 预 防 产 前 诊 断 产 前 诊 断 可 以 通 过 胎 儿 组 织 活 检 、 羊 膜 腔 穿 刺 、 羊 膜 绒 毛 样 4 品 及 母 体 血 液 循 环 中 的 胎 儿 细 胞 进 行 。 可 以 进 行 染 色 体 组 型 分 析 ， 发 现 染 色 体 异 常 ， 但 利 用 PCR 技 术 结 合 DNA 诊 断 学 方 法 分 析 特 异 基 因 缺 陷 更 宜 推 广 。 携 带 者 测 试 基 因 测 试 常 用 于 检 出 隐 性 遗 传 病 携 带 者 ， 包 括 遗 传 病 受 累 个 体 家 庭 的 其 他 成 员 和 有 特 殊 遗 传 病 死 亡 家 庭 中 的 危 险 人 群 。 例 如 对 个 缺 失 型 和 个 非 缺 失 型 假 肥 大 肌 营 养 不 良 家 系 缺 失 片 段 定 量 分 析 和 连 锁 分 析 ， 对 个 家 系 名 成 员 （ 患 儿 名 、 女 性 亲 属 名 、 男 性 亲 属 名 ） 进 行 了 基 因 检 测 。 检 测 结 果 发 现 了 名 女 性 为 致 病 基 因 携 带 者 ， 肯 定 了 名 女 性 为 非 携 带 者 ， 为 这 些 家 系 提 供 了 可 靠 的 遗 传 信 息 。 以 上 检 测 方 法 简 便 易 行 ， 利 于 在 临 床 实 验 室 中 开 展 。 症 状 前 诊 断 对 于 某 些 单 基 因 紊 乱 所 引 起 的 综 合 征 ， 仅 至 晚 年 才 会 有 明 显 表 现 ， 例 如 肝 豆 状 核 变 性 的 症 状 前 诊 断 及 干 预 治 疗 ， 应 用 短 串 联 重 复 序 列 标 记 对 个 肝 豆 状 核 变 性 家 系 进 行 单 体 型 连 锁 分 析 ， 在 先 证 者 的 例 无 症 状 同 胞 中 ， 检 出 例 症 状 前 患 者 。 对 其 中 例 投 用 硫 酸 锌 治 疗 ， 效 果 良 好 ， 在 预 防 症 状 出 现 的 同 时 ， 提 高 了 血 清 铜 蓝 蛋 白 水 平 。 强 调 症 状 前 诊 断 及 干 预 治 疗 的 重 要 性 。 遗 传 病 易 感 性 多 基 因 遗 传 病 是 由 多 个 易 感 性 基 因 累 加 效 应 引 起 的 遗 传 性 状 ， 是 由 多 个 易 感 性 基 因 累 加 效 应 引 起 的 遗 传 性 状 ， 是 多 个 才 会 有 发 病 的 机 会 。 比 如 ， 有 LDL 受 体 基 因 缺 陷 的 个 体 同 时 有 高 胆 固 醇 血 症 ， 其 冠 状 动 脉 患 病 率 要 比 单 纯 高 胆 固 醇 血 症 者 高 。 因 此 ， 根 据 DNA 诊 断 ， 做 好 疾 病 的 早 期 预 防 并 注 意 环 境 卫 生 和 个 人 生 活 方 式 ， 可 以 达 到 预 防 的 目 的 。 3.2 感 染 性 疾 病 过 去 对 感 染 性 疾 病 (infectious diseases)的 诊 断 ， 一 是 直 接 分 离 检 查 病 原 体 ， 或 者 对 患 者 血 清 学 或 生 物 化 学 的 分 析 。 有 些 病 原 体 不 容 易 分 离 ， 有 些 需 经 过 长 期 培 养 才 能 获 得 。 血 清 学 对 病 原 体 抗 体 的 检 测 虽 然 很 方 便 ， 但 是 病 原 体 感 染 人 体 后 需 要 间 隔 一 段 时 间 后 才 出 现 抗 体 ， 并 且 血 清 学 检 查 只 能 确 定 是 否 接 触 过 该 种 病 原 体 ， 但 不 能 确 定 是 否 有 现 行 感 染 ， 对 潜 伏 病 原 体 的 检 查 有 困 难 。 对 感 染 性 疾 病 的 基 因 诊 断 具 有 快 速 、 灵 敏 、 特 异 等 优 点 。 80 年 代 建 立 的 PCR 技 术 已 广 泛 应 用 于 对 病 原 体 的 检 测 。 一 般 根 据 各 病 原 体 特 异 和 保 守 的 序 列 设 计 引 物 ， 有 的 还 合 成 ASO 探 针 ， 对 病 原 体 的 DNA 可 用 PCR 技 术 直 接 检 查 ， 而 对 RNA 病 毒 ， 则 采 用 RT-PCR。 现 在 市 场 已 经 有 许 多 种 病 原 体 的 测 定 药 盒 供 应 ， 每 一 盒 包 含 扩 增 某 种 病 原 体 的 特 异 引 物 ， 所 需 的 酶 以 及 配 妥 的 各 种 反 应 试 剂 ， 并 附 有 可 行 的 操 作 方 法 步 骤 。 病 毒 性 感 染 ： 多 种 病 毒 性 感 染 都 可 采 用 基 因 诊 断 检 测 相 应 的 病 原 体 ， 如 甲 型 、 乙 型 、 丙 型 和 丁 型 肝 炎 病 毒 ， 人 免 疫 缺 陷 病 毒 、 可 萨 奇 病 毒 、 脊 髓 灰 质 类 病 毒 、 腺 病 毒 、 EB 病 毒 、 疱 疹 病 毒 、 人 巨 细 胞 病 毒 、 乳 头 状 病 毒 等 。 最 近 新 发 现 的 SARS 冠 状 病 毒 ， 在 基 因 组 （ RNA） 序 列 确 定 后 ， 便 很 快 建 立 了 RT-PCR 的 基 因 诊 断 法 。 细 菌 性 感 染 ： 可 应 用 基 因 诊 断 检 测 多 种 致 病 性 的 细 菌 ， 如 结 核 分 枝 杆 菌 、 痢 疾 性 大 肠 杆 菌 、 霍 乱 弧 菌 、 淋 球 菌 、 绿 脓 杆 菌 等 。 5 寄 生 虫 ： 恶 性 疟 原 虫 、 克 鲁 斯 锥 虫 、 利 什 曼 原 虫 、 血 吸 虫 、 弓 形 虫 等 都 有 基 因 诊 断 的 方 法 其 它 :如 衣 原 体 、 支 原 体 、 真 菌 性 感 染 也 均 用 基 因 诊 断 。 3.3 恶 性 肿 瘤 分 析 一 些 原 癌 基 因 的 点 突 变 、 插 入 突 变 、 基 因 扩 增 、 染 色 体 易 位 和 抑 癌 基 因 的 丢 失 或 突 变 ， 可 以 了 解 恶 性 肿 瘤 的 分 子 机 制 ， 有 助 于 对 恶 性 肿 瘤 的 诊 断 ， 对 肿 瘤 治 疗 及 预 后 有 指 导 意 义 。 4. 基 因 治 疗 4.1 基 因 治 疗 的 定 义 从 基 因 角 度 可 以 理 解 为 对 缺 陷 的 基 因 进 行 修 复 或 将 正 常 有 功 能 的 基 因 置 换 或 增 补 缺 陷 基 因 的 方 法 。 若 从 治 疗 角 度 可 以 广 义 地 说 是 一 种 基 于 导 入 遗 传 物 质 以 改 变 患 者 细 胞 的 基 因 表 达 从 而 达 到 治 疗 或 预 防 疾 病 的 目 标 的 新 措 施 。 导 入 的 基 因 可 以 是 与 缺 陷 基 因 相 对 应 的 有 功 能 的 同 源 基 因 或 与 缺 陷 基 因 无 关 的 治 疗 基 因 。 基 因 治 疗 有 两 种 形 式 ， 一 种 是 改 变 体 细 胞 的 基 因 表 达 ， 即 体 细 胞 基 因 治 疗 （ somatic gene therapy） ， 另 一 种 是 改 变 生 殖 细 胞 的 基 因 表 达 ， 即 种 系 基 因 治 疗 （ germline gene therapy） ， 从 理 论 上 讲 ， 若 对 缺 陷 的 生 殖 细 胞 进 行 矫 正 ， 不 但 当 代 可 以 得 到 根 治 ， 而 且 可 以 将 正 常 的 基 因 传 给 子 代 。 但 生 殖 的 生 物 学 极 其 复 杂 ， 且 尚 未 清 楚 ， 一 旦 发 生 差 错 将 给 人 类 带 来 不 可 想 象 的 后 果 ， 涉 及 一 系 列 伦 理 学 的 问 题 ， 目 前 还 不 能 用 于 人 类 。 在 现 有 的 条 件 下 ， 基 因 治 疗 仅 限 于 体 细 胞 ， 基 因 型 的 改 变 只 限 于 某 一 类 体 细 胞 ， 其 影 响 只 限 于 某 个 体 的 当 代 。 4.2 基 因 治 疗 的 方 式 基 因 治 疗 的 方 式 （ type of gene therapy） 主 要 有 3 类 ， 一 类 为 基 因 矫 正 或 置 换 ， 即 对 缺 陷 基 因 的 异 常 序 列 进 行 矫 正 ， 对 缺 陷 基 因 精 确 地 原 位 修 复 ， 或 以 正 常 基 因 原 位 置 换 异 常 基 因 ， 因 此 不 涉 及 基 因 组 的 任 何 改 变 ， 目 前 尚 无 体 内 成 功 的 报 道 。 另 一 类 为 基 因 增 补 ， 不 去 除 异 常 基 因 ， 而 是 通 过 外 源 基 因 的 导 入 ， 使 其 表 达 正 常 产 物 ， 从 而 补 偿 缺 陷 基 因 的 功 能 。 再 有 一 类 为 基 因 封 闭 ， 有 些 基 因 异 常 过 度 表 达 ， 如 癌 基 因 或 病 毒 基 因 可 导 致 疾 病 ， 可 用 反 义 核 酸 技 术 、 核 酶 或 诱 饵 （ decoy） 转 录 因 子 来 封 闭 或 消 除 这 些 有 害 基 因 的 表 达 。 除 上 述 3 大 类 外 ， 近 日 发 展 其 它 多 种 形 式 ， 如 导 入 病 毒 或 细 菌 来 源 的 所 谓 “自 杀 基 因 ”或 经 过 改 造 的 条 件 性 复 制 病 毒 ， 只 能 在 p53 缺 陷 的 肿 瘤 细 胞 繁 殖 以 达 到 溶 解 肿 瘤 细 胞 。 4.3 导 入 的 方 式 导 入 基 因 有 两 种 方 式 ， 一 种 是 体 外 导 入 （ ex vivo） ,即 在 体 外 将 基 因 导 入 细 胞 内 ， 再 将 这 种 基 因 修 饰 过 的 细 胞 回 输 病 人 体 内 ， 使 这 种 带 有 外 源 基 因 的 细 胞 在 体 内 表 达 ， 从 而 达 到 治 疗 或 预 防 的 目 的 。 被 用 于 修 饰 的 细 胞 可 以 是 自 体 ， 同 种 异 体 或 异 种 的 体 细 胞 。 合 适 的 细 胞 应 易 于 从 体 内 取 出 和 回 输 ， 能 在 体 外 增 殖 ， 经 得 起 体 外 实 验 操 作 ， 能 够 高 效 表 达 外 源 基 因 ， 且 能 在 体 内 长 期 存 活 。 目 前 常 用 的 细 胞 有 淋 巴 细 胞 、 骨 髓 干 细 胞 、 内 皮 细 胞 、 皮 肤 成 纤 维 细 胞 、 肝 细 胞 、 肌 细 胞 、 角 朊 细 胞 （ keratinocyte） 、 多 种 肿 瘤 细 胞 等 。 另 一 种 是 体 内 导 入 （ in vivo） ， 即 将 外 源 基 因 直 接 导 入 体 内 有 关 的 组 织 器 官 ， 使 其 进 入 相 应 的 细 胞 并 进 行 表 达 。 6 4.4 基 因 治 疗 的 临 床 试 验 目 前 临 床 基 因 治 疗 试 验 的 方 案 已 达 9 百 多 个 ， 受 治 疗 的 患 者 已 有 数 千 例 表 21-3 可 见 当 前 临 床 基 因 治 疗 （ gene therapy） 或 广 义 地 称 基 因 转 移 （ gene transfer） 试 验 ， 有 三 种 类 型 ， 即 治 疗 性 、 基 因 标 记 及 非 治 疗 性 试 验 。 后 者 将 腺 病 毒 载 体 注 射 于 健 康 自 愿 者 的 体 内 ， 观 察 机 体 对 腺 病 毒 载 体 的 反 应 。 这 些 方 案 的 临 床 试 验 期 （ trial phases） 极 大 多 数 为 期 临 床 试 验 ， 期 者 仅 仅 个 方 案 。 说 明 基 因 治 疗 临 床 试 验 尚 处 于 未 成 熟 阶 段 。 基 因 标 记 目 前 常 用 的 基 因 标 记 方 法 是 将 含 neoR 基 因 的 重 组 逆 转 录 病 毒 载 体 在 体 外 转 导 细 胞 ， 然 后 回 输 至 病 人 体 内 ， 可 以 很 方 便 地 跟 踪 这 种 标 记 细 胞 的 命 运 ， 用 来 研 究 许 多 其 他 方 法 不 能 回 答 的 体 细 胞 移 植 的 生 物 学 问 题 。 美 国 第 一 个 被 批 准 基 因 标 记 的 临 床 研 究 计 划 是 NIH 的 Rosenberg 等 的 肿 瘤 浸 润 淋 巴 细 胞 （ tumor infiltrating lymphocytes, TIL） 基 因 标 记 实 验 。 他 将 恶 性 黑 色 素 瘤 组 织 或 转 移 的 淋 巴 结 制 成 单 细 胞 悬 液 ， 在 IL-2 的 作 用 下 淋 巴 细 胞 可 成 倍 增 殖 而 肿 瘤 细 胞 及 其 他 类 型 细 胞 则 死 亡 。 这 种 TIL 能 特 异 杀 伤 肿 瘤 细 胞 。 先 在 体 外 将 含 有 neoR 基 因 的 逆 转 录 病 毒 载 体 转 导 TIL， 该 载 体 能 整 合 至 TIL 的 基 因 组 ， 故 子 代 的 TIL 也 含 有 neoR 基 因 ， 能 在 含 抗 生 素 G418 的 培 养 液 中 生 长 ， 便 于 筛 选 ； 也 可 用 PCR 检 测 neoR 基 因 是 否 存 在 ， 以 跟 踪 回 输 体 内 的 TIL 的 去 处 。 将 这 种 基 因 修 饰 过 的 TIL 注 射 于 黑 色 素 瘤 患 者 ， 可 以 研 究 TIL 在 体 内 各 组 织 器 官 、 血 循 环 细 胞 、 淋 巴 结 、 肿 瘤 组 织 的 分 布 情 况 ； 特 别 感 兴 趣 的 是 观 察 TIL 是 否 能 靶 向 肿 瘤 组 织 ； 同 时 也 可 以 研 究 TIL 在 体 内 存 活 期 的 长 短 ； 以 及 了 解 这 种 体 外 基 因 修 饰 过 的 TIL 是 否 会 自 主 生 长 和 恶 变 ？ 注 射 后 对 人 体 是 否 有 害 ？ 这 些 问 题 的 阐 明 可 为 基 因 治 疗 打 基 础 。 结 果 发 现 基 因 修 饰 过 的 TIL 在 体 外 不 会 自 主 增 殖 ， 说 明 没 有 恶 变 。 在 注 射 后 的 头 3 周 ， 用 PCR 可 测 出 外 周 血 存 在 着 含 有 neoR 基 因 的 单 核 细 胞 ， 有 的 长 至 60d 尚 可 测 出 。 在 注 射 后 3d 活 检 的 肿 瘤 组 织 也 可 测 出 有 基 因 修 饰 过 的 TIL 的 存 在 。 有 人 对 其 他 细 胞 如 骨 髓 细 胞 、 肝 细 胞 和 细 胞 毒 淋 巴 细 胞 等 进 行 标 记 研 究 。 单 基 因 疾 病 遗 传 性 单 基 因 疾 病 （ monogenic diseases） 是 基 因 治 疗 的 理 想 侯 选 对 象 ， 设 计 治 疗 方 案 时 应 考 虑 下 列 几 点 因 素 ： 对 造 成 该 疾 病 有 关 的 基 因 应 有 较 详 细 的 了 解 ， 并 能 在 实 验 室 克 隆 适 合 真 核 细 胞 表 达 的 有 关 基 因 的 cDNA 序 列 ， 供 转 导 用 。 经 有 功 能 基 因 转 导 的 体 细 胞 ， 只 要 产 生 较 少 量 原 来 缺 少 的 基 因 产 物 就 能 矫 正 疾 病 。 例 如 腺 苷 脱 氨 酶 （ ADA） 缺 乏 的 严 重 联 合 免 疫 缺 陷 （ SCID） ， 由 于 淋 巴 细 胞 缺 乏 ADA 酶 ， 造 成 腺 苷 及 dATP 的 堆 积 ， 可 破 坏 免 疫 功 能 ， 患 儿 很 少 活 至 成 年 。 若 淋 巴 细 胞 ADA 恢 复 至 正 常 水 平 的 5% 10% 即 能 维 持 免 疫 系 统 的 功 能 ， 对 病 人 症 状 就 有 改 善 ， 这 是 第 一 个 基 因 临 床 治 疗 7 的 方 案 。 血 友 病 B， 是 由 于 凝 血 因 子 缺 乏 所 致 。 现 知 只 要 因 子 水 平 达 到 正 常 的 10% 20%就 能 缓 解 严 重 的 血 友 病 。 对 血 友 病 A 而 言 ， 只 要 因 子 达 正 常 水 平 的 5%就 能 缓 解 症 状 ， 血 友 病 已 开 始 基 因 治 疗 临 床 试 验 。 即 使 导 入 基 因 过 度 表 达 ， 对 机 体 应 无 不 良 作 用 。 有 些 遗 传 疾 病 是 某 些 特 殊 细 胞 基 因 缺 损 造 成 的 ， 但 那 有 关 的 细 胞 不 易 取 出 供 体 外 基 因 工 程 操 作 用 。 例 如 Parkinson 症 是 脑 黑 质 细 胞 （ substantia nigra） 的 酪 氨 酸 羟 化 酶 缺 乏 ， 不 能 产 生 多 巴 胺 （ dopamine） ， 给 病 人 注 射 多 巴 胺 可 减 轻 症 状 。 动 物 模 型 试 验 表 明 ， 将 酪 胺 酸 羟 化 酶 基 因 转 导 成 纤 维 细 胞 ， 再 移 植 至 脑 内 ， 可 以 减 轻 动 物 模 型 的 异 常 行 为 。 现 在 采 用 的 以 正 常 有 功 能 的 同 源 基 因 来 增 补 体 内 的 缺 乏 基 因 ， 因 此 要 求 增 补 的 基 因 在 病 人 寿 命 期 间 能 稳 定 表 达 ， 或 重 复 治 疗 ， 所 以 应 考 虑 构 建 能 长 期 持 续 稳 定 表 达 外 源 基 因 的 载 体 ， 并 考 虑 将 外 源 基 因 转 导 干 细 胞 ， 如 造 血 干 细 胞 以 望 回 输 体 内 后 其 子 代 细 胞 也 含 有 外 源 基 因 。 目 前 应 用 基 因 治 疗 的 单 基 因 疾 病 已 有 二 十 多 种 。 恶 性 肿 瘤 恶 性 肿 瘤 属 复 杂 基 因 疾 病 (complex genetic diseases)， 可 能 涉 及 多 种 基 因 的 异 常 ， 发 病 过 程 是 多 步 骤 的 ， 至 今 虽 有 不 少 有 关 的 基 因 被 鉴 定 ， 但 肿 瘤 发 病 的 分 子 机 制 尚 未 清 楚 ， 因 此 治 疗 时 应 选 择 何 种 靶 基 因 不 明 确 ， 多 数 是 根 据 不 同 的 环 节 ， 设 计 不 同 的 治 疗 策 略 ， 目 前 临 床 恶 性 肿 瘤 的 基 因 治 疗 策 略 有 十 余 种 之 多 。 见 表 21-4。 免 疫 基 因 治 疗 (immunogene theray) 分 体 外 转 导 和 体 内 转 导 二 种 。 体 外 转 导 将 一 些 能 刺 激 免 疫 反 应 的 细 胞 因 子 基 因 ， 如 IL-2、 IL-12、 IFN- 等 转 导 肿 瘤 细 胞 作 为 基 因 工 程 “瘤 苗 ”， 给 肿 瘤 患 者 注 射 ， 宗 旨 为 提 高 肿 瘤 细 胞 的 免 疫 原 性 ， 有 利 于 被 机 体 免 疫 系 统 识 别 及 排 斥 ； 由 于 转 导 细 胞 因 子 基 因 的 肿 瘤 细 胞 在 体 内 能 持 续 不 断 分 泌 细 胞 因 子 ， 能 增 强 抗 肿 瘤 的 特 异 免 疫 和 非 特 异 免 疫 反 应 ， 在 肿 瘤 局 部 形 成 一 种 较 强 的 抗 肿 瘤 免 疫 反 应 微 环 境 ， 并 能 通 过 局 部 免 疫 反 应 ， 引 发 全 身 的 抗 肿 瘤 免 疫 机 能 ， 此 策 略 已 应 用 于 多 种 恶 性 肿 瘤 的 临 床 试 验 。 本 实 验 室 研 究 了 IL-2 基 因 转 导 的 人 肝 癌 和 胃 癌 细 胞 “瘤 苗 ”， 后 者 已 被 中 国 药 物 管 理 局 批 准 用 于 临 床 研 究 。 另 一 种 策 略 是 将 细 胞 因 子 基 因 或 MHC I 类 基 因 直 接 体 内 注 射 于 肿 瘤 局 部 ， 以 促 发 抗 肿 瘤 免 疫 反 应 。 自 杀 基 因 系 统 自 杀 基 因 （ suicide gene） 来 源 于 病 毒 、 细 菌 或 真 菌 ， 例 如 单 纯 性 疱 疹 病 毒 的 胸 苷 激 酶 （ thymidine kinase,TK） 基 因 ， 能 将 一 种 对 哺 乳 动 物 无 毒 害 的 嘌 呤 核 苷 的 类 似 物 甘 苷 洛 韦 （ gancilovir, GCV） 转 变 成 三 磷 酸 形 式 ， 后 者 可 掺 入 新 合 成 的 DNA 链 ， 造 成 DNA 链 的 断 裂 和 抑 制 DNA 聚 合 酶 的 活 性 ， 从 而 造 成 细 胞 死 亡 。 所 以 将 HSV-tk 基 因 体 内 转 导 肿 瘤 细 胞 ， 然 后 再 给 患 者 服 8 用 GCV 药 物 ， 肿 瘤 细 胞 表 达 TK 基 因 能 使 无 毒 的 GCV 转 变 成 有 毒 的 三 磷 酸 GCV， 达 到 杀 伤 肿 瘤 细 胞 的 目 的 。 抑 癌 基 因 (tumor suppressive gene) 抑 癌 基 因 p53 的 突 变 与 多 种 肿 瘤 的 发 生 有 密 切 的 关 系 。 将 野 生 型 (正 常 )的 p53 转 导 p53 缺 陷 的 恶 性 肿 瘤 ， 使 其 能 表 达 正 常 的 p53 产 物 ， 后 者 具 有 强 大 的 抑 制 肿 瘤 细 胞 生 长 和 诱 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 的 作 用 ， 从 而 达 到 抗 肿 瘤 效 果 。 裂 解 肿 瘤 病 毒 （ oncolytic virus） 利 用 基 因 工 程 改 造 过 的 腺 病 毒 突 变 体 ， 如 EIB 基 因 缺 失 的 腺 病 毒 能 选 择 性 在 p53 缺 陷 的 恶 性 肿 瘤 细 胞 中 进 行 复 制 、 繁 殖 ， 并 最 终 杀 伤 肿 瘤 细 胞 。 而 正 常 细 胞 能 表 达 p53， 使 这 种 病 毒 不 能 复 制 和 繁 殖 。 病 毒 性 感 染 目 前 病 毒 性 感 染 主 要 治 疗 对 象 为 人 免 疫 缺 陷 病 毒 （ HIV） 感 染 的 艾 滋 病 ， 接 受 基 因 治 疗 的 患 者 约 4 百 余 例 。 主 要 有 二 种 治 疗 策 略 。 增 强 机 体 的 抗 HIV 免 疫 反 应 抑 制 HIV 的 复 制 有 人 研 究 利 用 反 义 核 酸 来 封 闭 HIV 的 基 因 ， 使 mRNA 不 能 翻 译 蛋 白 质 ， 并 发 生 降 解 ， 或 制 备 有 关 的 核 酶 来 破 坏 HIV 的 mRNA， 使 HIV 不 能 复 制 繁 殖 ， 确 切 的 疗 效 尚 不 能 肯 定 ， 许 多 科 学 家 尚 在 研 究 其 他 更 有 效 的 抑 制 HIV 复 制 的 方 法 。 心 血 管 疾 病 目 前 心 血 管 疾 病 中 基 因 治 疗 最 多 的 临 床 方 案 为 外 周 血 管 疾 病 造 成 的 下 肢 缺 血 ， 及 心 脏 冠 状 动 脉 阻 塞 造 成 的 心 肌 缺 血 。 通 过 转 移 血 管 内 皮 细 胞 生 长 因 子 （ VEGF） 或 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 （ FGF） 或 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 （ PDGF） 等 基 因 于 血 管 病 疫 部 位 ， 通 过 这 些 因 子 的 表 达 ， 以 促 进 新 生 血 管 的 生 成 ， 从 而 建 立 侧 肢 循 环 ， 改 善 血 供 。 5. 问 题 及 展 望 基 因 治 疗 无 疑 是 近 30 年 来 生 命 科 学 发 展 的 一 种 结 果 。 从 理 论 上 讲 ， 若 能 将 与 疾 病 9 发 生 有 关 的 基 因 进 行 矫 正 或 修 复 ， 应 是 一 种 有 效 的 根 治 方 法 ， 可 惜 目 前 还 不 能 达 到 此 目 的 ， 这 应 是 今 后 研 究 的 一 个 重 要 方 向 。 在 这 当 中 ， 其 中 最 具 有 挑 战 性 的 问 题 是 运 送 治 疗 基 因 的 载 体 系 统 ， 理 想 载 体 应 具 备 下 列 条 件 ： 安 全 无 毒 害 ； 不 引 起 免 疫 反 应 ； 高 浓 度 或 高 滴 度 ； 能 高 效 转 移 外 源 基 因 ； 持 续 有 效 表 达 外 源 基 因 ； 可 靶 向 特 定 组 织 细 胞 ； 可 调 控 ； 容 纳 外 源 基 因 可 大 可 小 ； 可 供 体 内 注 射 （ 包 括 全 身 性 静 脉 注 射 ） ； 便 于 规 模 生 产 供 临 床 应 用 ， 可 惜 目 前 所 应 用 的 载 体 尚 没 有 一 个 能 符 合 上 述 全 部 的 条 件 。 这 是 今 后 努 力 研 究 的 方 向 。 6 结 论 随 着 “人 类 基 因 组 计 划 ”的 完 成 （ 即 在 阐 明 人 类 基 因 组 DNA3*109 核 苷 酸 的 序 列 ， 阐 明 所 有 人 类 基 因 并 确 定 其 在 染 色 体 的 位 置 ） 和 “后 基 因 计 划 ” 的 实 施 （ 即 是 对 基 因 功 能 的 研 究 和 基 因 与 人 体 疾 病 的 研 究 ） ， 分 子 生 物 学 技 术 将 会 越 来 越 普 及 ， 方 便 地 运 用 到 基 因 诊 断 领 域 。 虽 然 目 前 对 DNA 芯 片 的 应 用 仍 大 多 停 留 在 实 验 室 研 究 阶 段 ， 由 于 技 术 复 杂 、 成 本 高 、 离 临 床 检 验 及 疾 病 诊 断 的 普 及 性 应 用 还 有 一 段 距 离 。 但 是 可 以 预 见 ， 随 着 现 代 生 物 科 学 和 其 他 学 科 技 术 的 不 断 发 展 和 完 善 ， 在 不 久 的 将 来 ， 即 可 把 所 有 的 基 因 都 固 定 于 1 块 芯 片 上 时 ， 就 成 了 一 块 多 基 因 疾 病 检 测 得 万 能 芯 片 ， 它 可 适 用 于 任 何 多 基 因 疾 病 的 检 测 ， 为 临 床 检 测 工 作 带 来 极 大 的 便 利 。 总 之 ， 分 子 生 物 学 和 分 子 遗 传 学 的 飞 速 发 展 必 将 极 大 地 促 进 基 因 诊 断 技 术 的 进 步 ， 有 理 由 相 信 ， 以 基 因 诊 断 为 基 础 的 基 因 治 疗 必 将 成 为 人 类 治 疗 自 身 疾 病 的 主 流 技 术 ， 并