食品科学与工程专业论文10124.doc

毕业设计(论文) 课题题目课题题目： 杜仲叶饲料添加剂的研究 杜仲叶饲料添加剂的研究 摘 要 杜仲是我国特有的木本植物和经济林树种。由于杜仲具有防治高血压、提 神抗劳、增强免疫功能、抗肌肉骨骼老化、清除体内“垃圾” 、防癌抗癌等药理 保健作用，杜仲被广泛应用于保健品、化妆品等的开发项目中。近些年来，杜 仲叶作为饲料添加剂的研究颇为热门。 本实验分别采用两种枯草芽孢杆菌以及两种酵母菌对杜仲叶进行发酵，并 对发酵后杜仲叶中绿原酸、多糖、蛋白质等成分的提取及测定。通过实验，我 们确定了对于杜仲叶应用于饲料添加剂最合适的发酵菌种，可促进杜仲叶的深 加工和利用。 关键词：关键词：杜仲 饲料添加剂 发酵 绿原酸 多糖 蛋白质 abstract eucommia ulmoides oliv is chinese endemic species of woody plants and economic forest tree species. due to the prevention and control of eucommia ulmoides has high blood pressure, refreshing, enhance the immune function of fatigue resistance, ageing, musculoskeletal cleared body “junk“, cancer prevention and fighting against cancer and pharmacological health care function, eucommia ulmoides oliv is widely used in health food, cosmetics, etc. in the development projects. in recent years, eucommia ulmoides oliv as feed additives research rather popular. the experiments were to use two kinds of bacillus subtilis and two yeast of eucommla ulmoides were, and after fermentation of eucommia ulmoides oliv chlorogenic acid in, polysaccharides, such as protein component of extraction and determination. through the experiment, we determined the eucommia ulmoides oliv for applied to feed additive the most appropriate fermentation strains, can promote the deep processing and use of eucommia ulmoides oliv.（不准确） key words：eucommia ulmoides oliv; feed additive; ferment; chlorogenic acid; polysaccharide; protein 目目 录录 摘摘 要要2 abstract.3 第一章第一章 文献综述文献综述.6 1.11.1 杜仲叶概述杜仲叶概述 6 1.1.1 杜仲叶的主要成分.6 1.1.2 杜仲叶的主要生理作用.6 1.21.2 杜仲叶饲料添加剂杜仲叶饲料添加剂 8 1.2.1 杜仲叶饲料添加剂的功能及特点8 1.2.2 杜仲叶饲料添加剂的加工9 1.31.3 本研究的目的和意义本研究的目的和意义 10 第二章第二章 实验部分实验部分.11 2.12.1 实验材料实验材料11 2.1.1 菌种来源11 2.1.2 杜仲叶样品来源：采集11 2.1.3 主要试剂11 2.1.4 主要仪器12 2.22.2 实验流程实验流程12 2.32.3 发酵方法发酵方法12 2.3.1 培养基12 2.3.2 菌种的扩大培养13 2.42.4 检测方法检测方法13 2.4.1 绿原酸含量测定.13 2.4.2 多糖含量测定蒽酮比色法14 2.4.3 蛋白质含量测定15 第三章第三章 结果与讨论结果与讨论 .18 3.13.1 实验数据实验数据18 3.1.1 绿原酸含量测定18 3.1.2 多糖含量测定19 3.1.3 蛋白质含量测定21 3.23.2 结果分析结果分析21 3.2.1 杜仲叶在夏、秋两季化学成分含量的比较 21 致谢致谢23 第一章 文献综述 1.11.1 杜仲叶概述杜仲叶概述 杜仲系杜仲科杜仲属植物，是我国特有的木本植物和经济林树种，亦是重 要的中药材。杜仲为落叶乔木，高达 20 米，胸径 50 厘米。树冠圆球形。树皮 深灰色，枝具片状髓，树体各部折断均具银白色胶丝。小枝光滑，无顶芽。单 叶互生，椭圆形，长 714 厘米，有锯齿，羽状脉，老叶表面网脉下限，无托叶。 其主要分布在陕西、甘肃、浙江、江西、河南、湖南、广西、广东、四川、贵 州、云南等省区。杜仲干燥皮入药，已有两千多年的历史， 神农本草经将其 列为上品，名为“思仙”1“。 “八五” 以来，国家对杜仲保健产品进行了系 列研究，取得了可喜进展。 我国杜仲资源约 300 多万亩，夏叶、秋叶可采摘量和秋后老叶合计约 100 多万吨，但大部分被浪费掉了3。中国占世界杜仲资源 99%，全球总产量只满 足需求 1/9，市场潜力巨大。因此，杜仲综合开发利用成为新的引人注目投资热 点之一。 1.1.1 杜仲叶的主要成分 杜仲富含氨基酸、维生素、矿物元素等多种常规成分，如矿物元素有镁、 钙、钾、钠、铜、锰、锌、铁、磷等。杜仲叶含蛋白质 14.5%、纤维素 11%， 还有 15 种氨基酸，其中包括人体必需的 6 种氨基酸。还含有钙、锌、铁、锰、 铜、镁等 20 种矿物质微量元素，丰富的维生素 e 和 胡萝卜素、维生素 b2 及微量的维生素 b1。除此之外、杜仲还含有自身独有的天然有效生物活性功效 成分，如绿原酸、杜仲苷、松脂素苷、桃叶珊瑚苷、多肽、熊果酸、鞣质及黄 酮类物质等。4 有研究发现杜仲的叶与皮等部分所含药效成分基本相同，只是含量有区别， 具有同等的药理效果，完全可以以叶代皮5。其中主要药效成份绿原酸、桃叶 珊瑚昔、氨基酸及微量元素在杜仲叶中的含量都比杜仲皮高。 1.1.2 杜仲叶的主要生理作用 近年来，国内外许多学者对杜仲的化学成分和药理作用进行了大量研究， 发现杜仲具有调节血压、降低血糖、调节血脂、抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞 生长等药理作用，以及延缓衰老、美白养颜、滋阴补肾、强壮筋骨等功效。正 因为如此，近年来国内外掀起了一股研究、开发杜仲的热潮。 (1) 抗氧化及抗衰老 用杜仲叶制作的保健品，其抗氧化效果比 ve 好得多，另外杜仲愈伤组织也 有很好的抗氧化效果。杜仲可促进人体皮肤、骨骼和肌肉中蛋白质胶原的合成 和分解，促进人体新陈代谢，预防衰老。 刘方,武子斌,牛淑敏,等. 中药材抗氧化及自由基清除活性的研究j . 中国药学杂志,2001 ,36 (7) :442-445. (2) 免疫调节功能 杜仲叶能显著改善人体免疫系统的免疫力，防御疾病、抗病原体的侵入， 并且还具有双向调节细胞免疫功能的作用，使人体的免疫功能处于良好状态。 (3) 抗突变、抗癌 现代药理实验证明杜仲有抗癌和抑癌的作用，其有效成分与其所含有木脂 素、苯丙素及环烯醚萜类化合物有关。 (4) 降压作用 杜仲叶和皮一样具有降压作用, 而巨叶较皮具有更佳的疗效。现代药理学证 明杜仲对血压具有双向调节(低血压者能升高血压，高血压者能降低血压)作用， 降压效果尤为明显，而且疗效平稳，无毒副作用，这是任何化学降压药物都无 法比拟的。 黄志新,岳京丽,赵凤生,等. 槲寄生、钩藤、杜仲降压作用及急性毒性的实验研 究j . 中西医结合心脑血管病杂志,2004 ,2(8) :4622464. (5) 抗菌消炎功能 杜仲叶中含有丰富的绿原酸，其含量达 2.5%5.28%。绿原酸具有广泛的抗 菌、兴奋中枢神经、利胆、增进胆汁分泌、止血、提高自血球数量和抗病毒的 作用。桃叶珊瑚苷有抑菌、利尿作用，并能促进伤口愈合，另外桃叶珊瑚苷具 有明显的保肝作用，它与葡萄糖苷酶一起培养后会产生明显的抗病毒作用，抑 制乙型肝炎病毒 dna 的复制，但其本身并不具有抗病毒功能。 (6) 清除体内垃圾 杜仲叶能清除肝、心、血清中的超氧阴离子，对自由基的清除率达 76.8%以 上，对降低肝组织过氧化脂质的作用达 64%。 (7) 其他功效 日本近年来研究表明，使用以杜仲叶为原料提取的化妆品后，可使肌肤美 白、消除老人斑，还能够增加头发的黑色素细胞，提高头发黑色素细胞的活性。 饮用杜仲茶还可消除肥胖、防止牙齿松动、预防牙周病及老年痴呆症，治疗畏 寒症等。 1.21.2 杜仲叶饲料添加剂杜仲叶饲料添加剂 由于杜仲具有防治高血压、提神抗劳、增强免疫功能、抗肌肉骨骼老化、 清除体内“垃圾” 、防癌抗癌等药理保健作用，杜仲被广泛应用于保健品、化妆 品等的开发项目中。近些年来，杜仲叶作为饲料添加剂的研究颇为热门。 随着人们生活水平的提高，保健与回归自然的意识不断增强，人们渴望无 污染、无残留的绿色畜禽产品，从而促使畜禽饲料添加剂由化工型逐渐转为中 草药型2。20 世纪 90 年代以来，随着人们对抗生素和某些化学合成药危害性 认识的加深，以及对食品安全性要求的提高，人们越来越重视植物源药和植物 源饲料添加剂的研究与应用。现在世界各国均加大科研力度，正在积极寻找来 源广泛、使用方便、成本低廉、应用范围广、效果显著、残留量低、不易产耐 药性、配伍性强等特点的新型添加剂代替抗生素类添加剂15。而对杜仲作为 动物饲料添加剂的研究和产品开发也随之加强。 1.2.1 杜仲叶饲料添加剂的功能及特点 杜仲叶经过处理后，可作为饲料添加剂添加到鸡、兔、牛、羊及鱼类的饲， 从而提高其产量和品质。如将 1%的杜仲粉添加到鸡饲料中，可使母鸡产蛋率提 高 28%以上，产蛋量提高 52.4%，鸡蛋中胆固醇含量降低 20%以上；将杜仲粉 添加到鱼饲料中，可使鱼肉中的胶原蛋白增加 1.6 倍；将杜仲粉添加到螃蟹饲 料中，可减少螃蟹病害的发生，并且其味道鲜美，口感近天然野生；添加到兔、 牛、羊饲料中，可使动物脂肪含量减少，瘦肉增加6。日本有学者以杜仲叶作 为蛋鸡饲料添加剂，生产低胆固醇和高密度脂蛋白的鸡蛋；王纪亭等报道了杜 仲叶作为饲料添加剂在肉鸡生产中的应用；杜仲叶提取物制剂对动物的镇痛作 用及免疫功能影响的研究均有报道。吕锦芳等报道了杜仲叶对肉杂鸡生产性能 及部分肉品质的影响7。因此，杜仲叶饲料添加剂具有以下产品特点8： 天然植物提取物，不含任何化学合成类物质；有效成分明确，功能确定， 活性成分能够量化控制；提高动物增重和饲料转化效率；有效改善动物产品的 肉质风味，提高产品质量；提高动物免疫力；符合安全、卫生、环保的条件要 求，有利人类健康；动物死亡率减少 5%以上。同时，有效减少抗生素用量，无 耐药性和残留，安全、无毒、纯天然。 1.2.2 杜仲叶饲料添加剂的加工 (1) 原料采集 绿原酸被认为是杜仲叶所含主要药用成分之。汤诗杰等（1999）研究指出， 不同地理种源杜仲叶片绿原酸含量有明显差异，季节性差异也极为明显。研究 同时对 17 个地理种源杜仲叶总黄酮含量进行了测定，结果表明，不同地理种源 杜仲叶总黄酮含量差异显著，但春叶与秋叶的总黄酮含量无显著差异9。陈芝 龙等（2000）初步揭示了杜仲原料叶内含胶药成分动态变化规律，证明采收时 间不同胶药品质差异较大，最佳采收季节为药用叶 8 月份，胶用叶 10 月至 11 月中旬10。 由于种（系） 、产地、采收时间和处理加工不同，杜仲叶及其产品中营养和 生物活性成分含量也存在不同程度的差异。因此，在科学研究、产品开发及实 际应用中应当综合考虑其影响因素，不能仅以用叶量为依据。 (2) 原料的预处理 原料的预处理可采用烘干法及沸水蒸法11。 蒸汽处理对鲜叶的穿透均匀，不会产生焦叶，叶子内部温度瞬时升高，使 多酚类物质充分氧化，从而减轻了杜仲叶提取液的苦涩味，有利于各种活性成 分的保留，提高了提取液的口感，且所用时间较短，因此，蒸发预处理要优于 烘干法。 (3) 杜仲叶的发酵 将杜仲叶经酵母菌、枯草芽孢杆菌进行发酵后，不仅可保持原有的营养成 分，产生出许多有益的代谢产物，而且还有利于一些有效成分的分离和提取12。 发酵培养基是微生物生长的物质基础，适宜的培养基可有效提高杜仲液中有效 成分如绿原酸的含量，改善口感、风味13。 1.2.3 杜仲叶饲料添加剂研究现状 杜仲提取液对畜禽有增强免疫机制、改善动物产品风味的效果，并有维生 素样促生长等作用，是很有发展前景的天然饲料添加剂16。杜仲添加剂具有 增强免疫和抗病力、抗应激、促生长、改善肉质等独特功效，具无毒、无公害、 无残留等优点，饲养效果良好，经济效益明显，是一种天然中药饲料添加剂17。 当然，在杜仲叶饲料添加剂的研究课题中尚有一些问题有需要进一步探讨： 对杜仲所含不同成分单独和联合的药理作用、食品动物食后反应、最适剂量进 行研究；加强以杜仲叶为原料的饲料添加剂研发，采取先进技术工艺和科学管 理，生产出高效、低适宜成本和使用方便的饲料添加剂产品，依产品性质或使 用对象对产品分类并制定标准；加强动物试验，试验动物应包括所有主要食品 动物，以及每种动物的不同生理生产阶段等19。总之，对于杜仲叶应合理开 发，制定科学的质量控制标准，完善加工工艺，使杜仲的有效成分真正进入生 产性应用中，推动我国畜牧业发展。 1.31.3 本研究的目的和意义本研究的目的和意义 本研究以杜仲叶为主要原料，利用酵母菌、枯草芽孢杆菌等生物能源对其 进行发酵，并对发酵前后杜仲叶中绿原酸、多糖、蛋白质等成分进行对比分析 其作为饲料添加剂的营养价值，从而获得对杜仲叶发酵最有利的菌株。 且我校浦口校区附近有近万亩的杜仲树林，若能合理开发，是极具经济效 益及发展前景的。是极有发展前景和具有较高开发利用价值的饲料添加剂原料。 第二章 实验部分 2.12.1 实验材料实验材料 2.1.1 菌种来源 2.1.2 杜仲叶样品来源：采集 2.1.3 主要试剂 表 2-1 发酵实验主要试剂 试剂名称纯度生产厂家 马铃薯 葡萄糖分析纯中国惠兴生化试剂有限公司上海 牛肉膏生化试剂北京奥博星生物技术有限责任公司 蛋白胨生化试剂国药集团化学试剂有限公司 氯化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司 氢氧化钠分析纯西陇化工股份有限公司 酵母浸膏生化试剂国药集团化学试剂有限公司 表 2-2 检测实验主要试剂 试剂名称纯度生产厂家 甲醇分析纯上海九亿化学试剂有限公司 绿原酸标样99.0%made in germany 蒽酮分析纯国药集团化学试剂有限公司 硫脲分析纯江苏永华精细化学品有限公司 标准纤维素 浓硫酸分析纯上海九亿化学试剂有限公司 盐酸分析纯上海九亿化学试剂有限公司 氢氧化钠分析纯西陇化工股份有限公司 硼酸分析纯江苏永华精细化学品有限公司 硫酸铜分析纯江苏永华精细化学品有限公司 硫酸钾(硫酸钠)分析纯江苏永华精细化学品有限公司 硫酸铵分析纯江苏永华精细化学品有限公司 无水碳酸钠分析纯江苏永华精细化学品有限公司 2.1.4 主要仪器 表 2-3 发酵实验主要仪器 仪器名称型号生产厂家 电炉 高压蒸汽灭菌锅 超净工作台 摇床培养箱 电烘箱 电子天平fa-2004上海舜宇恒平科学仪器公司 冰箱 三角瓶 接种环 培养皿 酒精灯 表 2-4 检测实验主要仪器 仪器名称型号生产厂家 超声波清洗器kh3200昆山禾创超声仪器有限公司 紫外可见分光光度 计 spectrumlab7 52s leng guang tech 恒温水浴锅hh-6江苏金坛荣华仪器制造有限公司 电炉 电热恒温鼓风干燥 箱 dhg-9076a上海精宏实验设备有限公司 量筒 滴管 电子天平fa-2004上海舜宇恒平科学仪器公司 容量瓶250ml 移液枪1ml、5ml 2.22.2 实验流程实验流程 杜仲叶 预处理 干燥 粉碎 摇瓶培养 发酵后检测 菌种 活化 启动发酵 2.32.3 发酵方法发酵方法 接种 发酵前检测 2.3.1 培养基 表 2-5 培养基 培养基名称pda 培养基普通肉汤培养基 配制成分马铃薯 200g，葡萄糖 20g，水 1000ml 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g， 水 1000ml，调节 ph 至 7.4 灭菌条件 121灭菌 20 分钟121灭菌 20 分钟 用途酵母菌的扩大培养枯草芽孢杆菌的扩大培养 2.3.2 菌种的扩大培养 1 菌种的活化 将保存的菌种转接到液体培养基，加塞置于摇床培养箱中，转速 140r/min。 酵母菌：pda 培养基，2730培养； 枯草芽孢杆菌：肉汤培养基，37培养。 培养 24h 后，将菌种转接到新鲜的培养基中，同条件培养。转接 23 次， 完成活化。 2 启动发酵 将杜仲叶粉碎后，称取 8 份 15g 置于 8 个 250ml 三角瓶中（杜仲叶平铺后 可高出瓶底 1.52cm） ，编号 18，分别加水 5ml。 配制含酵母膏 0.25%、葡萄糖 0.5%的水溶液。取 15ml 分别加入至上述三 角瓶中。 3 接种摇床培养 1、2 号三角瓶为酿酒酵母平行组，3、4 号三角瓶为假丝酵母平行组， 5、6 号三角瓶为枯草芽孢杆菌 1 平行组，7、8 号三角瓶为枯草芽孢杆菌 2 平行 组。菌种接种 10%，置于摇床培养箱中，转速 140r/min，培养 45 天。 酵母菌 2730培养，枯草芽孢杆菌 37培养。 观察叶片变化。 2.42.4 检测方法检测方法 2.4.1 绿原酸含量测定 绿原酸是一种具有广泛生理活性和药理活性的物质，具有利胆、抗菌、降 压、增加白血球及兴奋中枢神经系统、抗肿瘤、降脂、清除自由基等多种药理 作用，对消化系统、血液系统和生殖系统疾病均有显著疗效。 测定绿原酸含量的方法很多，常采用毛细管电泳法、hplc 法、可见分光光 度法和纸层析-紫外可见分光光度法等。但样品处理均采用索氏回流提取，后经 层析分离洗脱等步骤，时间长、效率低。本文采用紫外可见分光光度法测定绿 原酸含量，只需超声波提取一小时, 不经分离纯化而直接测定, 具有快速准确、 稳定性好等特点，适合大批量样品分析测试。 孙波等. 紫外可见分光光度法测定杜仲绿原酸含量的方法研究. 中国学术期刊电子出版社, 19942010, 18( 3) : 54 55 (1) 波长的选择 根据绿原酸可溶于水、甲醇的性质，精密称取绿原酸标样 0. 5000mg，用 50%甲醇溶液溶解定容至 10ml，稀释 10 倍后于 800200nm 范围内扫描，以 50% 甲醇溶液作参比，在 325nm 处有最大吸收峰。另将绿原酸标准液点条样于层析 纸上，用水作展开剂展开后，于紫外灯下去掉荧光部分( 即绿原酸部分)，其余 部分用 50%甲醇溶液超声提取 15 分钟，以 50 %甲醇作参比，在 800200nm 范围 内扫描，在 345nm 处有最大吸收峰，故选定 345nm、325nm，为测定波长，其绿 原酸吸光值为($a=a325-a345)。 (2) 标准曲线测定 精密称取绿原酸标样适量，用 50%的甲醇溶液稀释成每毫升含绿原酸 5.05、10.1、15.15、20.2、30.3、40.4lg 的标准溶液，以 50%甲醇溶液作参比， 在 345nm、325nm 处测定 a345、a325 值，求得 a($a=a325-a345)，以样品的浓 度 c(lg/ ml) 为横坐标，吸光度$a 为纵坐标，绘制 a-c 标准曲线，求得回归 方程为:c=k$a+b。 (3) 样品的测定 精密称取杜仲叶粉 0.5000g 于 60ml 试管中，加入 40ml 50%甲醇溶液，放 入超声波洗涤器中超声提取 15min 后过滤。滤渣再加入 40ml 50%甲醇溶液，超 声提取 15min，共重复上述操作四次( 三个平行)，合并滤液定容至 250ml。在 紫处可见分光光度计上以 50%甲醇为参比，测定 a325、a345 值，求得绿原酸含 量。 2.4.2 多糖含量测定蒽酮比色法 林炎坤. 常用的几种葱酮比色定糖法的比较和改进j. 植物生理学通讯 1989(4):5355 (1) 蒽酮试剂的配置 准确称取 0.2g 蒽酮和 1g 硫脲置于烧杯中，缓慢加入 100ml 浓硫酸，边加 边搅拌，试剂溶解后呈黄色透明溶液，储存于棕色瓶中备用。 (2) 纤维素标准溶液的配置 称取 200mg 标准纤维素，放入 100ml 容量瓶中，加 60%的浓硫酸 6070ml, 在 30下消化 20min，然后用 60%的浓硫酸定容至 100ml；吸取 5.0ml 放入另一 50ml 容量瓶中，冰浴条件下加蒸馏水稀释至刻度。 (3) 样品消化 称取杜仲叶 200mg，放入 100ml 容量瓶中，加 60%浓硫酸 6070ml，在 35 下消化 1h，然后用 60%的硫酸定容；过滤后吸取 5.0ml 放入另一个 50ml 容量瓶 中，冰浴条件下加蒸馏水稀释至刻度。 (4) 纤维素标准曲线的制作 取 6 支小试管，分别加入 0,0.4,0.8,1.2,1.6，2.0ml 的纤维素标准液，然 后分别加入 2.0,1.6,1.2,0.8,0.4,0ml 的蒸馏水，摇匀。每管沿管壁加入 5ml 冷的蒽酮试剂，摇匀，加塞，沸水浴中加热 10 min，取出在流动水中冷却 20min。以空白管调零，620nm 下测定各管的吸光值，以每管的纤维素的毫克数 为横坐标，以每管的 a620nm 值为纵坐标制作标准曲线。 (5) 样品的测定 吸取消化好的样品溶液 2ml，加入 5ml 冷的蒽酮试剂，如上操作，测 a620nm 值，对照标准曲线求出样品中的纤维素含量。 2.4.3 蛋白质含量测定 蛋白测定中所用的化学药品：浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、硼酸、硫酸铜、 硫酸钾(硫酸钠)、硫酸铵，标定盐酸标准溶液用的无水碳酸钠为基准试剂。在 配制试剂前一定要用 ph 试纸或酸度计检测一下蒸馏水是否为中性，所用的烧杯、 试剂瓶等配液设备清洗干净。凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部 分组成（见下图） 。 图 2-1 凯氏定氮蒸馏装置示意图 (1) 凯氏定氮蒸馏装置 1 电炉 2 蒸气发生器 3 安全管 4 橡皮管 5 碱液室 6 反应室 7 加样口 8 安 全管 9 冷凝管 10 接受瓶 11 棒状玻塞 12 夹子 (2) 固体样品 随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中，置于 105的烘箱中干 燥 4h 用坩锅钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重，随后继续干燥 样品，每干燥 1h，称重一次，恒重即可。 (3) 消化蛋白测定中所用的化学药品：浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、硼酸、硫酸 铜、硫酸钾(硫酸钠)、硫酸铵，标定盐酸标准溶液用的无水碳酸钠为基准试剂。 取 3 支消化管并编号，在 1、2 号管中各加入精确称取的干燥样品 0.51g，加催化剂（硫酸钾硫酸铜混合物）6.4g，浓硫酸 10ml 和 2 粒玻珠， 在 3 号管中各加相同量的催化剂和硫酸作为对照，用以测定试剂中可能含有的 微量含氮物质。摇匀后，将瓶口上放一小漏斗，再把烧瓶斜置铁筐内放在通风 厨内的电炉上消化。通常消化需要 13h。直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝 绿色，消化即告成功。为了保证消化彻底，再继续加热 0.5h。消化完毕，取出 消化管冷却至室温。加入 20ml 蒸馏水，无损的转入 100ml 溶量瓶中，用蒸溜水 定容至刻度，混匀，作为试样分解液。 (4) 蒸馏 取 3 个 100ml 锥形瓶，分别加入 2硼酸 20ml，混合指示剂（甲基红亚 甲蓝混合指示液）2 滴，溶液呈紫红色，用表面皿覆盖备用。 i 洗涤、加样：先煮沸蒸汽发生器，器中盛有 2/3 体积的用几滴硫酸酸化过 的蒸馏水，样品杯中也加入 2/3 体积蒸馏水进行水封。关闭夹子 (12)使蒸汽通 过反应室中的插管进入反应室，再由冷凝管下端逸出。在冷凝管下端放一空烧 杯以承受凝集水滴。这样用蒸汽洗涤 5min 左右，在冷凝管下口放一个准备好的 盛有硼酸-指示剂的锥形瓶，位置倾斜，冷凝管下口应完全浸泡于液体内，继续 用蒸汽洗涤 12min，观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，若不变色，则证 明蒸馏器内部已洗涤干净。下移锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约 1cm，继 续通蒸汽 1min。 ii 加样前先撤火，务必打开夹子(12)(这是本实验的关键，否则样品会倒抽 到反应室外，准确移取试样分解液 10ml，打开样品杯的棒状玻塞，将样品放入 反应室，用少量蒸溜水冲洗样品杯后也使之流入反应室，将夹子(12)夹紧。盖 上玻塞，并在样品杯中加蒸馏水进行水封。将装有硼酸-指示剂的锥形瓶放在冷 凝管口下方，打开存放碱液杯下端的夹子，放 10ml 40氢氧化钠溶液于反应 室后，立即上提锥形瓶，使冷凝管下口浸没在锥形瓶的液面下，目的是保证放 出的氨全部被硼酸吸收。 (5) 滴定 全部蒸馏完毕后，用 0.0100mol/l 标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨 量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。 第三章 结果与讨论 3.13.1 实验数据实验数据 3.1.1 绿原酸含量测定 (1) 绿原酸的标准工作曲线 绿原酸的标准工作曲线表达式为：c=k$a+b 式中：$a绿原酸标准溶液吸光度； c绿原酸标准溶液质量浓度，g/ml； k斜率； b截距。 表 3-1 标准曲线系列方程及相关系数 浓度 （g/ml） 吸光值（a）回归方程相关系数 0.000c=66.246a-0.5805r=0.9998 5.050.085 10.100.167 15.150.231 20.200.313 30.300.462 40.400.607 图 3-1 绿原酸标准工作曲线 (2)样品中绿原酸含量 样品中绿原酸含量的计算公式为： 绿原酸得率%c*n/(106*m) 式中：c在标准曲线上得到的试样中绿原酸含量，mg/l； n稀释倍数； m为样品重量，g。 表 3-2 发酵前不同时期杜仲叶绿原酸含量 编号夏叶样品量 （g) a325a345ac 绿原酸含量 10.50691.109 0.891 0.218 13.861 0.68% 20.50501.038 0.835 0.203 12.867 0.64% 30.50361.124 0.905 0.219 13.927 0.69% 编号秋叶样品量 （g) a325a345ac 绿原酸含量 10.50221.426 1.150 0.276 17.703 0.88% 20.50121.413 1.160 0.253 16.180 0.81% 30.50471.181 0.960 0.221 14.060 0.70% 表 3-3 发酵后样品中叶绿原酸含量 编号样品量 （g) a325a345ac 绿原酸含量备注 10.50280.622 0.541 0.081 4.785 0.24% 酿酒酵母 20.50250.623 0.540 0.083 4.918 0.24% 酿酒酵母 30.50170.553 0.494 0.059 3.328 0.17% 假丝酵母 40.50140.591 0.511 0.080 4.719 0.24% 假丝酵母 50.50200.450 0.360 0.090 5.381 0.27% 枯草1 60.50170.424 0.337 0.087 5.183 0.26% 枯草1 70.50100.435 0.343 0.092 5.514 0.28% 枯草2 80.50260.418 0.330 0.088 5.249 0.26% 枯草2 3.1.2 多糖含量测定 (1) 纤维素的标准工作曲线 纤维素的标准工作曲线表达式为：c=k$a+b 式中：$a纤维素标准溶液吸光度； c纤维素标准溶液质量浓度，g/ml； k斜率； b截距。 表 3-4 标准曲线系列方程及相关系数 浓度 （g/ml） 吸光值（a）回归方程相关系数 0.000c=4.1671a-0.0581r=0.9963 0.080.250 0.160.571 0.240.934 0.321.215 0.401.682 图 3-2 纤维素标准工作曲线 (2)样品中纤维素含量 样品中多糖含量的计算公式为： 可溶性糖含量（）x=cdm100 式中：x每百克样品总糖含量 c在标准曲线上查得的糖含量（g） d稀释倍数 m样品重量(g) 表 3-5 发酵前后多糖含量测定 时期序号样品量(g) a620nm 纤维素量(mg)杜仲叶多糖成分含量 发酵前 00.2012 1.1920.300 74.55% 发酵后 10.2070 1.2750.320 77.27% 20.2064 0.8220.211 51.16% 30.2054 0.5540.147 35.75% 40.2058 0.9570.244 59.18% 50.2062 0.5750.152 36.84% 60.2058 0.9270.236 57.43% 70.2052 0.7350.190 46.37% 80.2059 1.0740.272 65.97% 3.1.3 蛋白质含量测定 粗蛋白质= (v2v1)c0.01406.25mv/v100% 式中：v2滴定试样时所需标准酸溶液体积(ml) v1滴定空白时所需标准酸溶液体积(ml) c盐酸标准溶液浓度(mol/l) m试样质量(g) v试样分解液总体积(ml) v试样分解液蒸馏用体积(ml) 0.0140与 1.00ml 盐酸标准溶液c(hcl)=1.0000mol/l相当的、 以克表示的氮的质量 6.25氮换算成蛋白质的平均系数 实验数据记录：c =0.0100mol/l v=10ml v =100ml 表 3-6 发酵前夏、秋叶粗蛋白含量 v1(ml)v2(ml)m(g) 粗蛋白含量 秋叶 1.2 6.0 1.01740.0427% 夏叶 0.8 13.0 1.00510.1073% 3.23.2 结果分析结果分析 3.2.1 杜仲叶在夏、秋两季化学成分含量的比较 从图