灵芝多糖启动人类属兔细胞的机制

灵芝多糖灵芝多糖 启动人类树突细胞的机制启动人类树突细胞的机制 现在科学界对于灵芝多糖如何影响殊途细胞并不清楚 而我们的研究团队则首都证实，灵芝多糖能活化 人类树突细胞内部负责传达信息的蛋白分子 NF-K8 和 P38 MAPK，进而加速树突细 胞的成熟，提高树突细胞的工作 效率，加快后续免疫翻译进行 的脚步，并有道 T 细胞朝 第一型免疫反应（TH1） 发展，相对压制了 过敏反应（TH2） 的产生 芝在中国和其他亚洲国家的使 用非常普遍，其已被证实具有免疫 调节和抑制肿瘤生长功能，对于慢 性肝病,高血压和糖尿病 也有不错 的资料效果。研究指出，灵芝能透 过火星免疫反应来提升动物或人体 的抗癌能力，其中主要的作用惩罚 是具有（16）- 葡萄糖基分支结 构的多糖体（PS-G） ，即所谓的活 性多糖，它不仅能提高自然杀手细 胞的毒杀能力， 还能促进巨噬 细胞和其他免 疫细胞分泌 TNF-（肿瘤 坏死因子 ） 和 IFN-（干 扰素 ） 。灵芝活性多糖甚至能活化 细胞内 Akt 蛋白分子的信息传播路 径，进而延长嗜中性白血球 （neutrophils）的寿命，是免疫系 统因有较多数量的嗜中性白血球守 卫而维持高度警戒。 (注：嗜中性白血球有类似巨噬细胞的作用机制， 能吞噬入侵人体的细菌，病毒与癌细胞) 免疫系统里还有一群很重要的防卫不 对叫做树突细胞（dendritic cell） ，它 和巨噬细胞一样，站在人类免疫系统里的 最前线。当任何病原体进入体内时，树突 细胞便以最快的速度赶到事故现场，把病 原吞入并切成碎片，再将这些碎片挂在细 胞表面呈现给 T 细胞看，好让这位免疫兵 团的总司令确切知道要对付的是什么样的 敌人，并拟定作战计划，排除合适的兵力 迎战。与此同时，树突细胞还会视捕捉到 的病原体释放不同的细胞激素，左右 T 细 胞的作战计划。所以，树突细胞可说是 T 细胞免疫反应类型与强烈程度的重要关键。 当树突细胞完成呈现抗原的任务时 （即所谓的成熟了， 细胞表面的 CD40，CD80,CD86 等分 子标志和第二型 MVH（major histocompatibility complex，主要组织相容 性复合体）的表达会升高。有报告指出， 树突细胞的成熟，与其细胞内的 NF- KAPPAB（NF-KB）分子密切相关。还有研究 指出，肿瘤坏死因子 和脂多糖（LPS,又 称内毒素，是细菌细胞壁的主要成分）能 透过活化树突细胞内 P38 MAPK,ERK 和 JNK 等蛋白分子的信息传播路径，促使树突细 胞发展成熟。 现今科学界对灵芝多糖如何影响树突 细胞并不清楚，而我们的研究团队则首度 证实，灵芝多糖能活化人类树突细胞内部 负责传播信息的蛋白分子 NF-KB 和 P38 MAPK,进而加速树突细胞的成熟（即提高树 3 突细胞的工作效率，加快后续免疫反应进 行的脚步） ，并诱导 T 细胞朝第一型免疫发 展（）这类型免疫反应有利于扫荡病毒， 细菌和癌细胞，相对抑制过敏反应的产生） 实验结果实验结果 2.2. PS-GPS-G 能促使树突细胞分泌能促使树突细胞分泌 IL-IL- 1212 p70p70、IL-12IL-12 p40p40 和和 IL-10IL-10 在含有树突细胞的上清液里加入 PS-G，结果 发现，不论计量高低（1200g/ml）PS-G 均能促进树突细胞分泌 IL-12 p70、IL-12 p40 和 IL-10，自不过 PS-G 的计量越高效果 越好，再以 PS-G（10g/ml）与树突细胞一 起培养 348 小时，结果发现，PS-G 须与树 养一段时间（至少 18 小时）才能发挥作用 （图 2A、2B） 。 以 RT-PCR 检测与 PS-G（10g/ml）培 养 324 小时的树突细胞，结果在 6 小时和 18 小时时，IL-12 p35、IL-12 p40 和 IL-10 mRNA 的表达显著增加，尤其是 IL-12 p40 mRNA（图 2C） ；未经 PS-G 处理的树突细胞则 测不到 IL-12 p35、IL-12 p40 和 IL-10 灵芝多糖与树突细胞的来源灵芝多糖与树突细胞的来源 本实验使用的灵芝多糖 PS-G 来自灵芝 （Ganoderma lucldum）子实体，先以热水 萃取，再加入酒精使多糖沉淀析出，为95% 多糖+5%蛋白质的化合物。以 LAL（Limulus amebocyte lysate）检测方法确定 PS-G 未受 脂多糖污染 实验所用的树突细胞这是自人类周边血 单核细胞（prelpheral blood mononuclear cells，PBMC）分离出 CD14+ 的 monocyte， 再以 GM-CSF（granulocyte Macrophage- colony stimulating factor）和 IL-4（白介素 4）培养而得 1.1. PS-GPS-G 能诱导树突细胞成熟能诱导树突细胞成熟 科学已证实，脂多糖能活化树突细胞并 促使其成熟。因此我们以脂多糖 （100mg/ml）引起的树突细胞反应作为指标， 观察 PS-G 是否 也有相同的功效。实验得到的结果是肯定的， 树突细胞在加入 10g/ml 的 PS-G 之后的 24 小时，其表面的 CD80、CD86、CD83、CD40、CD54 等分子标 志和第二型 MCH 表达升高，吃变化正是树突 细胞活化和成熟的表现（图 1） （图（图 1 1）不同条件下，树突细胞表面分子标志的变 化：控制组（静置 24 小时候的树突细胞） 、LPS 组 （限 100g/ml PS-G 一起培养 24 小时的树突细胞） 5 突细胞培mRNA。 3.PS-G3.PS-G 能调降树突细胞的吞噬活能调降树突细胞的吞噬活 性加速树突细胞成熟性加速树突细胞成熟 当任何病原体进入体内时，活化的树突 细胞会吞噬病原，并将其切割成碎片：一旦 树突细胞停止吞噬和切割病原时，就表示它 已经成熟并完成呈现抗原的任务把切 割的病原碎片挂在细胞表面，呈现给 T 细胞 看。我们以会发出荧光的 FITC-dextran 作 为检测的标的物，记过证实，树突细胞迈向 成熟的过程中，PS-G 会抑制树突细胞的吞噬 作用（图 3） 图 3.将培养至第六条 的未成熟树突细胞各 别与脂多糖 （100mg/ml） 、PS- G（10ug/ml）一起培 养 24 小时，然后再加 入 FITC-dextran 培养 一小时，虚线是在 4环境下的结果，这 个实验重复了三次，所得到的结果都相同 （X 轴 Fluorescence intensity“发光强度；Y 轴“树突细胞的数目” ） 4.经经 PS-G 处理的树突细胞能促进处理的树突细胞能促进 T 细胞活化细胞活化 先前的实验已经证实，PS-G 能提高树突 细胞表面分子标记的表达、促进树突细胞分 泌 IL-12,以及活化其细胞内的 NF-kappab 分 子，这些记过都说明了 PS-G 能促使树突细 胞在较短的时间内发展成熟，不过在 PS-G 鞭策下进入成熟状态的树突细胞，是否真能 启动 T 细胞的免疫反应 我们把 PS-G 处理过的树突细胞与 T 细 胞一起培养，结果就如（图 4A）和（图 4B）所示，PS-G 不仅促使 T 细胞增殖，还诱 导活化的 T 细胞分泌 IFN-，而且 PS-G 的 效果远胜与脂多糖的作用。 实验还发现，PS-G 处理过的树突细胞能 诱使 T 细胞分泌 IL-10（图 4C） ，而脂多糖则 无此作用，此外，各组均未测得 IL-4 （图 2A）在含有树突细胞的上清液加入不等计量的 PS-G 观察树突细胞分泌 IL-12 p35、IL-10 的量 （图 2B）在含有树突细胞的上清液里加入 10ug/ml 的 PS-G 一起培养 348 小时，观察树突细胞分泌 IL-12 p35、IL-12 p40 和 IL-10 的量。 （p0.05， 图表中的“ND”=not ） （图 2A）在含有树突细胞的上清液加入不等计量的 PS-G 观察树突细胞分泌 IL-12 p35、IL-10 的量 （图 2B）在含有树突细胞的上清液里加入 10ug/ml 的 PS-G 一起培养 348 小时，观察树突细胞分泌 IL-12 p35、IL-12 p40 和 IL-10 的量。 （p0.05， 图表中的“ND”=not ） 7 图 4A 以脂多糖（100ug/ml）和 PS-G 各别与未成熟的树突细胞一起培养 24 小时，之后树突细胞再与 T 细 胞一起培养，于五天后测量 T 细胞增殖的结果 图 4B 图 4C 脂多糖（100ug/ml）和 PS-G（10ug/ml）各别与未成熟的树突细胞一起培养 24 小时，之后树 突细胞再与 T 细胞一起培养，于二天后测量 T 细胞分泌 FN-（图 4B）与的 IL-10（图 4C）的浓度 5.TLR45.TLR4 受体是受体是 PS-GPS-G 启动树突细启动树突细 胞的关键胞的关键 为了了解 PS-G 是触动了树突细胞表面 的那种受体而活化了树突细胞，我们各别把 会与 TLR-2 或 TLR-4 受体结合的抗体加到树 突细胞里，一小时后再加入不等浓度的 PS- G（100ng/ml、1g/ml、10gg/ml）一 起培养 15 小时，结果发现，TLR-4 受体先 辈遮盖再以 PS-G 处理的树突细胞，所分泌 的 IL-12 p40 各别降低了 70%、31%。47%（依前述 PS-G 浓 度排列）且 IL-10 也减少了 55%、39%和 20%；至于 TLR-2 受体先被遮盖再以 PS-G 处 理的树突细胞，IL-12 p40 和 IL-10 的分泌量 则不受影响（原文富有图表，未图 5，在此 译文中省略） 。 显然 TLR-4 受体是 PS-G 启动树突细胞的 关键，换句话说，TLR-4 受体就像是树突细 胞某个大门的门铃，被 PS-G 这么一按，叮 咚使得原本在里面瞌睡的伙计们以为老板 来了，赶快上紧发条进入备战状态 6.PS-G6.PS-G 能活化能活化 IKKIKK 分子，进而引分子，进而引 起起 IKBIKB 的磷酸化的磷酸化 不过上述实验只做到灵芝多糖 PS-G 能触 动树突细胞表面的 TLR-4 受体，接下来树突 细胞内部会出现什么样忙碌的景象？这是后 续实验所要了解的。 一个细胞的行为举止是由细胞内许多蛋 白分子一起控制的，这些蛋白分子间的关系 就像骨牌一样环环相扣，前面那个没动后面 的也动不了 NK-KB 分子在树突细胞内的地位就像总管 一样，负责指挥调度细胞核内参与免疫反应 的基因，不过他平常并不在细胞核内，而是 位于细胞质，与另一个蛋白分子 LKB 绑在 一起形成 NF-KB-LKB 复合物，要启动树突 细胞的免疫反应，就要让 NF-kb 进到细胞核 里；要让 NF-KB 进到细胞核里，就得先松绑 NF-kb 与 lkB。 负责处理这件事的是 LKK 家族蛋白。被 活化的 LKK 分子能引起 LKB 磷酸化进而降 解，使得 NF-KB 得以从 NF-KB-LKB 复合物 被释放出来 7.PS-G7.PS-G 能活化能活化 NF-KBNF-KB 分子分子 已知，脂多糖是透过活化 NF-KB 促使树突细 胞产生免疫反应。未了确定 PS-G 也是透过 同样的路径启动树突细胞，我们将树突细胞 与 PS-G（10ug/ml）培养 2 小时后，萃取出 细胞核中的物质，在以 EMSA（凝胶阻滞实验） 进行检测，果然发现细胞核中的 NF-KB 能与 NF-B 结合区域结合图 7。显然 PS-G 能活 化 NF-KB，并促使其从细胞质转移到细胞核。 图 7将树突细胞 各别与脂多糖 （100ug/ml）与 PS-G（10ug/ml） 培养 2 小时后， 去除细胞核部分， 以 EMSA 检测 NF- KB 的活性 8.PS-G8.PS-G 能促进能促进 MAPKMAPK 激酶的磷酸激酶的磷酸 化化 除了 NK-KB 之外，活化的 MAPK 也是启 动树突细胞产生免疫反应的另一途径， MAPK 是一群由丝氨酸和羟丁氨酸组成的蛋 白激酶，其激酶的反应主要有 ERKs、JNK/SAPK 和 p38 MARK 三种类型，我 们选择 p38 MARK、 P42/44 ERK 和 p46/54 JNK 作为实验的指标藉 以观察 PS-G 是否也能开启 MARK 的讯号通 路。 先将树突细胞与 PS-G 培养一段时间，再 以 Westem blot 进行检测，结果上述三种 MARK 激酶均出现磷酸化反应，尤其是对 p38 MARK 向细胞核内转移 我们的实验证实，PS-G 能活化 LKK 分子， 进而引起 LKB 的磷酸化（磷酸化单表蛋 白分子活化的化学反应） ，先将树突细胞与 PS-G（10ug/ml0）培养一段时间，在从细胞 萃取出 LKK 蛋白，加入基因重组配制的 GST- LKB 融合蛋白里，30 分钟后 GST-LKB 出 现激烈的磷酸 化，显然 LKK 蛋白已经事先被 PS-G 活化才 能发挥此以作用（图 6A） 。 我们后来也利用 Westem blot 检测 PS-G 是否确能引起树突细胞内 LKB 的磷酸化， 结果证实，在树突细胞与 PS-G 培养 60 分钟 后，LKB 有显著的磷酸化现象图 6B 图 6A先将树突细胞与 PS- G（10ug/ml）培养一段时间，从细胞萃取出 LKB 蛋白，再与-25PATP 还有 GST-LKB 融合蛋白一起反应 30 分钟，发现 GST- LKB 出现明显的磷酸化 9 9.NF-KB9.NF-KB 和和 MAPKMAPK 激酶的抑制物会激酶的抑制物会 使使 PS-GPS-G 无法对树突细胞发挥作无法对树突细胞发挥作 用用 我们已经证明 PS-G 能促进树突细胞成 熟并分泌许多细胞激素，包括 IL-12 p70、IL- 12 p40 和 IL-10：同时也确认了 PS-G 能够活 化树突细胞内的 NF-KB 与 MAPK 两条讯息通 路，不过到底那一条信息通路扮演最重要的 角色？为此，我们透过 NF-KB、p38 MAPK、p42/44 ERK 和 p46/54 JNK 的抑制剂 作了进一步的了解。 我们先在树突细胞各别加入 NF-KB 的抑 制剂 helenalin、p38 MAPK 的抑制剂 SB98059、能阻断 ERK 通路的 OD98059 和抑 制剂，一个小时后再加入 PS-G 静置培养 24 小时后发现，NF-KB 和 p38 MAPK 受到抑 制的树突细胞，即使后来又 PS-G 刺激，IL- 12 p70、IL-12 p40 和 IL-10 的分泌量仍大幅 锐减，而 ERK 和 JBK 受到抑制的树突细胞， 在加入 PS-G 之后 IL-12 p70 和 IL-10 的分泌量 虽有减少，但 IL-12 p40 的量却只受到些微影 响图 9 同样利用这些抑制剂来检测 PS-G 启动 NF-KB 和 p38 MAPK 讯息通路与 PS-G 促使树 突细胞成熟的关系，结果发现，先使树突细 胞的 NF-KB 受到抑制，再与 PS-G 作用，所 得到的将诶过则是树突细胞表面的 标记不表达或滴表达（表示无法活化树突细 胞）：事先阻断 p38 MAPK 和 JNK 再以 PS-G 刺激的树突细胞，上述分子标记的表达则只 受到些微影响：至于 ERK 阻断剂则是对 PS-G 提高上述分子标记表达的作用毫无影响原 文附有图表，为图 10，在此译文中省略。 此实验结果告诉我们，灵芝多糖 PS-G 可能透过多种不同的讯息传导路径在调控树 突细胞的免疫反应，其中主要的讯息通路至 少包括 NF-KB 和 p38 MAPK 的效果最好图 8 MAPK 激酶磷酸化之后，就可以从细胞 质转移至细胞核，开启免疫相关基因的表达， 促使细胞激素的合成与分泌，显然 PS-G 之 所以能激起树突细胞的免疫反应，有一部分 是因为他开启了 MAPK 讯号通路 CD80、CD86、CD83、CD40、CD54 与 HLA- DR 等分子 11 上面的实验结果串起来大概 是以下的样貌：当灵芝多糖 PS-G 遇到人类 树突细胞时，会触动细胞表面的 TLR- 4 受体，藉此把类似于捕获入侵病 原菌的讯息传入细胞内，开启了细胞 内 NF-KB 和 MAPK（主要是 p38 MAPK）的讯息通路，树突细胞于是由 休息进入了战备状态，不仅细胞外表 出现了一些变化，像是 CD80、CD86、CD83、CD40、CD54 与 HLA-DR 等分子标记升高，以及细胞的 吞噬活性逐渐降低，这些都是树突细 胞成熟的特征：细胞核内负责免疫反 应的基因，也在接获战备讯息之后开 始运作，合成并释放 IL-12 p70、IL- 12 p40 和 IL-10 等细胞激素，进而启 动后续以 T 细胞为首的适应性免疫反 应。 树突细胞分泌的细胞激