维生素d受体基因多态性与慢性乙型肝炎患者的关联研究

描述：目的：探讨维生素 D 受体（VDR）Fok基因多态性与慢性乙型肝炎患者临床表型的关联。方法： 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR- RFLP）技术检测 VDR Fok基因的多态性在 44 例 慢. 【摘要摘要】 目的：探讨维生素 D 受体（VDR）Fok基因多态性与慢性乙型肝炎患者临 床表型的关联。方法：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR- RFLP）技术 检测 VDR Fok基因的多态性在 44 例慢性乙型肝炎重度患者、46 例中度患者和 40 例非活 动性 HBsAg 携带者中的分布，并进行基因型分析。结果：慢性乙型肝炎重 度组、慢性乙 型肝炎中度组 VDR Fok基因的基因型与对照组（非活动性 HBsAg 携带者）比较差异有统 计学意义（P0.05），具有可比性。 1.2 方法 1.2.1 实验室检查 肝功能相关指标，包括 AST/ALT、血清总胆红素 TBIL、凝血酶原 活动度 PTA、血清白蛋白；检测 HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe 和 anti-HBc 及 HBV- DNA 滴度。 1.2.2 基因组 DNA 的提取 留取慢性乙型肝炎中度及重度患者和非活动性 HBsAg 携带 者空腹 12 h 后，晨起静脉采血 4 mL（EDTA 抗凝），采用硅胶柱纯化方式，用血液 DNA 提取试剂盒（D3741-01 美国 OMEGA），从 700 ?L 抗凝血液中提取淋巴细胞基因组 DNA。利用 UV 计测定所提取的 DNA 浓度及纯度，并将其稀释至 10 ng/?L，分装保存于- 20 冰箱保存备用。 1.2.3 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP） VDR Fok基因的引 物序列：上游引物，5，-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3；下游引 物，5，- ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3。总反应体系均为 25 L：1 ?L 基因组 DNA，2.5 ?L 10PCR 缓冲液，上下游引物各 0.5 L，dNTPs 2 ?L，0.25 ?L Taq DNA 聚合酶，去离 子水 18.25 ?L。VDR FokPCR 扩增条件：95 预变性 4 min；98 变性 10 s，63 退 火 30 s，72 延伸 60 s，共 30 个循环；72 再延伸 5 min。取扩增的 PCR 产物 0.5 ?L，1 ?L 限制性内切酶 Fok，及 2 ?L 10M Buffer， 2 ?L 0.1% BSA（由大连 TaKaRa 公司提供）及 14.5 ?L 灭菌水组成酶切总反应体系 20 ?L，置于 37 水浴 1 h，进行 Fok 酶切，将酶切产物经 2%琼脂糖凝胶电泳，以 DL700 Marker 为参考，紫外凝胶成像仪下观 察结果。 1.3 观察指标 比较慢性乙型肝炎现症患者重度组、中度组和对照组 VDR 基因多态性 的差异；VDR Fok基因多态性与慢性乙型肝炎不同病情程度的关联程度。 1.4 统计学处理 分别统计 CHB 现症患者重度组、CHB 现症患者中度组和对照组非活 动性 HBsAg 携带者基因型和等位基因的分布频率数据，用 SPSS 13.0 统计软件分析， Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，P0.05 认为资料可靠，代表性好。计数资料采用 字 2 检 验，以 P0.05 为差异有统计学意义。 2 结结果果 2.1 扩增产物酶切结果电泳图谱 VDR Fok酶切后出现 3 种结果：纯合子 FF 为 270 bp，1 条带；杂合子 Ff 为 270 bp、195 bp，2 条带；纯合子 ff 为 195 bp，1 条带，见图 1。 2.2 VDR Fok基因的基因型和等位基因频率分布 经 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验 后，结果显示符合 Hardy-Weinberg 平衡，说明资料可靠，代表性好。CHB 重度组、中度 组 VDR Fok基因的基因型与对照组比较差异有统计学意义（字 2=34.816，P0.01）。 见表 1。期刊文章发表CHB 重度组、中度组患者与对照组 VDR Fok基因酶切位点的等 位基因 F/f 分布差异有统计学意义（字 2=50.674，P0.01），Pearson 列联系数=0.53， 提示等位基 因 F/f 分布与慢性乙型肝炎患者的不同临床表型存在相关性。CHB 重度组、中 度组 f 等位基因分布频率高于对照组，见表 1。 3 讨论讨论 VDR 基因定位于 12 号染色体长臂，其包含有 11 个外显子，在基因组上总长为 75 Kb，VDR 包含 427 个氨基酸残基，分子量为 50 KD。目前报导的 VDR 基因多态性与 4 个 单核苷酸多态性位点有关，分别为 2 号外显子的 Fok位点、第 8 内含子的 Bsm位点、 Apa位点及第 9 外显子的 Tap位点。近年来，人们逐渐认识到 VDR 的基因多态性除了 参与调节钙磷代谢外，其有着更广泛的生理作用，如：抗增殖、抗分化、调节细胞凋亡、 介导免疫反应及多种内分泌腺激素的分泌，调节造血组织造血等作用。 研究证明，Treg 细胞和 Th17 细胞这两种细胞亚型参与了免疫介导性肝炎的发病机制。 Treg 细胞为体内致免疫耐受的主要细胞，其有效控制 病原体的 T 细胞反应，而 Th17 细 胞主要通过产生细胞因子，如 IL-17 可促进炎症反应，这两种细胞亚型在特定的某些细胞 因子等因素的作用下，可相互转 换，相互制约。Sneha 等研究发现 1，25-（OH）2D3 可 以通过阻碍 IL-17 转录因子活化 T 细胞核因子（NF-AT）复合体的 形成，从而抑制 IL-17 的分泌，进而减轻 Th17 细胞介导的促炎症反应。另有研究表明，1，25-（OH）2D3 及其 类似物通过作用于树突状细胞的 nVDR，抑制了树突状细胞的成熟，使其处于未成熟状态， 因此其不能激活初始 T 细胞，进而使免疫反应不能继续。目前认为，不成熟树突状细胞 可分泌 TGF-b 和/或 IL-10 来诱导初始 T 细胞向 Treg 细胞转化，增加 Treg 细胞的水平，提 高了机体的免疫耐受性。 本实验结果显示，CHB 重度组、中度组患者的 f 等位基因分布频率高于对照组，提示 等位基因 f 分布频率的提高可能与 CHB 的炎症再活动存在一定 的关系。有研究表明， VDR 基因 Fok多态性的 C-T 替换（F 等位基因-f 等位基因），造成潜在的起始位点，f 等 位基因编码的 VDR 增加了 3 个氨基 酸，f 等位基因的转录效率比 F 等位基因降低了 1.7 倍， 故 ff 基因型的个体，其 VDR 表达量较低，可能导致使 ff 基因型结合 1，25-（OH）2D3 的 能 力降低，进而使其介导的免疫耐受反应减弱，从而使慢乙肝患者所受的炎症反应和免疫 反应的伤害从一定程度上有所增强。由此推测，等位基因 f 分 布频率的提高