肝素钠生产工艺

一、肝素分类 肝素是哺乳动物体内含的一种粘多糖，它与蛋白质结合在一起存在于 肠粘膜、肺、肝等器官内，肝素与蛋白质分离提取后，具有抗凝血、 抗血栓、降血脂等多种生理活性，是防止动脉粥样硬化，心脑血管疾 病的显效药物。 (1) 普通(标准)肝素是由猪或羊黏膜提取，平均分子量为 15000，相当 稳定。 (2) 通常把分子量小于 6000 的称为低分子肝素。低分子肝素与普通肝 素比较，其半衰期较长，抗血栓效果好，而抗凝出血倾向较弱，有取 代普通肝素的趋势。近年临床常用的有：达肝素钠(法安明)、依诺肝 素钠(克赛)、低分子肝素钙(速避凝、那屈肝素钙)。 (3) 目前正在深入研究的肝素制剂中还有低抗凝活性肝素、改构型肝 素、类肝素等, 这些药物特点是具有低抗凝、高抗栓、作用时间长和 出血作用少的优点，很有开发前途。 二、肝素钠简介 拼音名：Gansuna 英文名：Heparin Sodium 本品系自猪的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的钠盐，属粘多糖类物 质，通过激活抗凝血酶(AT-)而发挥抗凝作用。它对凝血过程的三 个阶段均有影响，在体内外均有抗凝作用，可延长凝血时间、凝血酶 原时间和凝血酶时间。口服不吸收，皮下、肌肉或静脉给药均吸收良 好。 三、肝素钠检测 （药典版） 拼音名：Gansuna 英文名：Heparin Sodium 本品系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属黏多糖 类物质，具有延长血凝时间的作用。按干燥品计算，每 1mg 的效价不 得少于 150 单位。 【性状】 本品为白色或类白色的粉末；有引湿性。 本品在水中易溶。 【比旋度】 取本品，精密称定，加水溶解并稀释制成每 1ml 中含 40mg 的溶液，依 法测定（附录 E），比旋度应不小于35。 【鉴别】 (1) 取本品与肝素标准品，分别加水制成每 1ml 中含 2.5mg 的溶液，照 电泳法（附录 F 第三法）试验，供试品和标准品所显斑 点的迁移距离之比应为 0.9 1.1 。 (2) 本品的水溶液显钠盐的鉴别 反应（附录）。 【检查】 酸碱度 取本品 0.10g ，加水 10ml 溶解后，依法测定（附录 H），pH 值应为 5.0 7.5 。 溶液的澄清度与颜色 取本品 0.50g ，加水 10ml 溶解后，溶液应澄清 无色；如显浑 浊，照分光光度法（附录 A），在 640nm 的波长处测 定，吸收度不得大于 0.018；如 显色，与黄色 1 号标准比色液（附录 A 第一法）比较，不得更深。 吸收度 取本品，加水制成每 1ml 中含 4mg 的溶液，照分光光度法 （附录 A）测 定，在 260nm 的波长处，其吸收度不得大于 0.20； 在 280nm 的波长处，其吸收度不得大 于 0.15。 黏度 精密称取本品（按实际测得的单位计算相当于 40 万单位），加 水适量研细 ，移入干燥并称定重量的 10ml 量瓶中，研钵用水冲洗并 移入量瓶中，将量瓶置 25水浴 内，俟温度平衡后，加 25水至刻 度，摇匀，称定重量，计算供试品溶液的密度。取溶 液，必要时用 0.45m 的滤膜过滤，照黏度测定法（附录 G 第一法），用内径约 为 1 mm 的毛细管，在 250.1 测定其动力黏度，不得大于 0.030Pa.s 。 总氮量 取本品，照氮测定法（附录 D 第二法）测定，按干燥品计算， 含总氮量应 为 1.3 2.5 。 硫 取本品约 25mg，精密称定，照氧瓶燃烧法（附录 C）进行有机破 坏，选用 1000ml 燃烧瓶，以浓过氧化氢溶液 0.1ml 与水 10ml 为吸收 液，俟生成的烟雾完全吸收后 ，置冰浴中 15 分钟后，加热缓缓煮沸 2 分钟，冷却，加乙醇醋酸铵缓冲液 (pH3.7)50 ml，乙醇 30ml，0.1 茜素红溶液 0.3ml 为指示液，用高氯酸钡滴定液(0.05mol/L) 滴 定 至淡橙红色。每 1ml 高氯酸钡滴定液(0.05mol/L) 相当于 1.603mg 的 S，按干燥品计算，含 硫量不得少于 10.0。 干燥失重 取本品，置五氧化二磷干燥器内，在 60减压干燥至恒重， 减失重量不得过 5.0%（附录 L）。 炽灼残渣 取本品 0.50g ，依法检查（附录 N），遗留残渣应为 28.041.0。 钾盐 取本品 0.10g ，置 100ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇 匀，作为供试品溶液（B）；另量取标准氯化钾溶液（精密称取在 150干燥 1 小时的分析纯氯化钾 191mg ，置 1000ml 量瓶中，加水溶 解并稀释至刻度，摇匀） 5.0ml，置 50ml 量瓶中，加（B）溶液稀释 至刻度，摇匀，作为对照溶液（A）。照原子吸收分光光度法（附录 D 杂质检查法）在 766.5nm 的波长处分别测定，应符合规定。 重金属 取本品 0.50g ，依法检查（附录 H 第二法），含重金属不 得过百万分之 三十。 热原 取本品，加氯化钠注射液制成每 1ml 中含 1000 单位的溶液，依 法检查（附录 D），剂量按家兔体重每 1kg 注射 2ml ，应符合规 定。 【效价测定】 照肝素生物检定法（附录 D）测定，应符合规定；测 得的结果应 为标示量的 91110 。 【类别】 抗凝血药。 【贮藏】 密封，在凉暗处保存。 【制剂】 肝素钠注射液 四、肝素钠生产工艺流程 1、盐解：将刮好的新鲜肠粘膜，每 100 斤肠粘膜加入清水 100 斤，按 肠粘膜和水的总重量，加入 4%的工业盐，搅拌均匀，再加烧碱液调 PH 值为 8-9，缓慢升温 50-55 度，加温时每 10-20 分钟加水搅拌一次， 恒温 2 小时，注意要间隔搅拌。恒温结束后，要快速升温到 96-98 度， 恒温 10 分钟，趁热捞出上层的渣子。用 100 目尼龙布过滤。 注意： 加盐过多会使下一步交换吸附含量超过规定，加盐过少，肝素和蛋白 质分离不完全，碱性过强，会使肝素降解破坏，收率下降。同时还能 使一些蛋白质溶解度增大，造成过滤困难。碱性不足造成提取液偏酸， 则在高温的情况下，肝素迅速破坏，升温过急会使蛋白质早凝固，影 响肝素的分解和溶出。 2、吸附：待提取液温度冷至 50-55 度，应检测盐浓度为 3。5-5%时， 即可加入 5%已处理号的树脂。如树脂上含有盐水，需用清水将树脂洗 净控干，方可使用。搅拌吸附 6-8 小时，转速 60-80 转/分钟为宜， 搅拌须使树脂上下翻动，否则吸附效果差，收率低。吸附完毕，弃去 上层吸附液，然后用 100 目的尼龙布过滤出树脂。加入提取液的树脂 量：新树脂可按提取液的 5-6%加入，旧树脂可按提取液的 8-10。 3、洗涤：过滤后的树脂用 40 度左右的温水，漂洗干净。再放入与树 脂重量相等的盐溶液中(盐溶液的浓度为 5%左右)洗涤 10-20 分钟，除 去低分子肝素和一些蛋白质，然后将树脂过滤。 4、洗脱：第一次洗脱将过滤号的树脂放入浓度为 20-22%的盐溶液中 搅拌洗脱 5-6 小时，树脂和盐水的比例为 1：0。7。过滤后将树脂控 干进行第二次洗脱，调盐溶液浓度为 16-18%，搅拌 3 小时以上，树脂 和盐水的比例与第一次相同，过滤后的水即是药液。 5、除杂：将稀碱水加入洗脱后的药液里，要快搅慢加，调 PH 值为 10- -12 搅拌 2 分钟，静止沉淀 20 小时后，抽出上层药液，下沉的是杂质， 且渣子放另外桶内过滤。过滤后的药液和下次药液除杂时合并待用。 6、沉淀：将抽出除杂后的药液加入盐酸调 PH 值为 7-7。5，即可加入 酒精进行沉淀。向药液里加入酒精要快搅慢加。(由于酒精的浓度不同， 因此沉淀肝素的酒精用量不等)用酒精计测量酒精度为 30-35%，加盖 密封，沉淀 20 小时。弃去废酒精收集糊状肝素。注意在抽出废酒精时， 不可抽动沉淀的肝素。将多次生产的肝素钠浆收集在一起，以备集中 脱水干燥。 7、脱水：将生产的肝素钠浆，用双层的确良布过滤后放入 95%的酒精 内浸泡 20 小时，加盖密封。过滤后按上述方法重复一次，使其充分的 将肝素上的水分交换下来。 8、干燥：待肝素钠浆沥干后，放在不锈钢盘中烘干，用铲子来回的翻 动，温度保持在 50-55 度，注意温度低于要求是不易烘干的，温度高 于 60 度时会使肝素钠的生物活性下降。干燥后的肝素很易吸潮，应及 时用双层塑料袋密封包装，于通风干燥处存放。 五、肝素钠精制新工艺 本工艺采用酶解结合氧化法精制肝素，在该过程中采用低温离心技术, 解决在除酸性蛋白过程中，粗品肝素钠中残留杂蛋白在纯化过程中很 难被除去的缺点。在粗品肝素钠中加入胰蛋白酶对这些杂蛋白进行酶 解,再结合一次氧化除杂过程,从而提高精品肝素钠的效价和效价回收 率。 1、工艺流程 2、溶解 称取适量肝素钠粗品加质量分数 3%左右 NaCI 溶液进行溶解。50水浴 加热，用 NaOH 溶液调 pH 至 8.0 静置 2 小时，过滤除不溶性杂质。 3、酶解法除蛋白 肝素在动物体内是以肝素-蛋白质复合物的形式存在，通过酶解或盐解 去除复合物的蛋白质成分，游离肝素。但在实际生产过程中，复合物 的解离，蛋白质的除去是不完全的，粗品中总存在数量不等的蛋白质。 粗品肝素钠必须经过精制，可以进一步去除粗品中残存的结合蛋白质， 不仅因杂蛋白的去除而提高效价，而且因被“掩蔽”的肝素活性得到释放 而获得较高活性。为此，利用蛋白水解酶专一水解蛋白的特点，并结 合调酸除蛋白和氧化除蛋白方法,采用酶解除蛋白法，该法能在除去蛋 白质时较少影响肝素总效价。 在肝素钠溶液中加入少量的胰蛋白酶，使残留在肝素中的少量蛋白质 降解成小分子肽,从肝素-蛋白质复合物中解离出来，再结合调酸碱和 氧化法除蛋白,制得精品肝素钠的效价和效加回收率均有不同程度提高。 酶解反应条件：蛋白酶加入量 0.05%， pH 79， 温度 40，反应时 间 5h。 4、调酸除蛋白 在调酸除蛋白过程中，为防止肝素失活,加入亚硫酸氢钠作保护剂。在