自己总结：透彻易懂pcr+rt-pcr原理

PCR 原理原理 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称，简称 PCR，是一种分子生物学技术，用于，是一种分子生物学技术，用于 放大特定的放大特定的 DNA 片段。可看作生物体外的特殊片段。可看作生物体外的特殊 DNA 复制。复制。PCR 这项技术，被广泛地运这项技术，被广泛地运 用在医学和生物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病用在医学和生物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病 的诊断、基因复制以及亲子鉴定。的诊断、基因复制以及亲子鉴定。 DNA 变性变性 DNA denaturation : 加热或用碱处理双链加热或用碱处理双链 DNA，使氢链断裂，结果，使氢链断裂，结果 DNA 变成变成 为单链，此称为为单链，此称为 DNA 的变性。发生这种变化时的温度称为融解温度，鸟嘌呤和胞嘧啶含的变性。发生这种变化时的温度称为融解温度，鸟嘌呤和胞嘧啶含 量高的量高的 DNA 融解温度也高。由于变性的结果融解温度也高。由于变性的结果 DNA 的紫外线吸收增加，比旋光度和粘度降的紫外线吸收增加，比旋光度和粘度降 低，密度也增加。如果在加热后慢慢冷却，则低，密度也增加。如果在加热后慢慢冷却，则 DNA 可以再次恢复成双螺旋结构。另外，可以再次恢复成双螺旋结构。另外， 外部压力也能使外部压力也能使 DNA 变性变性. PCR(聚合酶链式反应）是利用聚合酶链式反应）是利用 DNA 在体外摄氏在体外摄氏 95高温时变性会变成单链，低温（经常高温时变性会变成单链，低温（经常 是是 60C 左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至 DNA 聚合酶最适聚合酶最适 反应温度（反应温度（72C 左右），左右），DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于的方向合成互补链。基于 聚合酶制造的聚合酶制造的 PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间 很好地进行控制。很好地进行控制。 引物（引物（primer），是一小段单链，是一小段单链 DNA 或或 RNA，作为，作为 DNA 复制的起始点，在核酸合成反复制的起始点，在核酸合成反 应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的 3-OH 上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的 3-OH，必须是游离的。，必须是游离的。 DNA 聚合酶（聚合酶（DNApolymerase）是细胞复制）是细胞复制 DNA 的重要作用酶。的重要作用酶。DNA 聚合酶聚合酶,以以 DNA 为为 复制模板，从将复制模板，从将 DNA 由由 5端点开始复制到端点开始复制到 3端的酶。端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。等的情况下）及其相辅的活性。 dNTP: deoxy-ribonucleoside triphosphate（三磷酸脱氧核糖核苷）的缩写。是（三磷酸脱氧核糖核苷）的缩写。是 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 的统称。在生物的统称。在生物 DNA 合成，以及合成，以及 PCR 聚合酶链反应中起原料作用。聚合酶链反应中起原料作用。 由等摩尔数的由等摩尔数的 dATP、dTTP、dGTP 和和 dCTP 混合而成。混合而成。 PCR 原理原理 DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性在多种酶的作用下可以变性 解旋成单链，在解旋成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。 在实验中发现，在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。 因此，通过温度变化控制因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，加入设计引物，的变性和复性，加入设计引物，DNA 聚合酶、聚合酶、dNTP 就可就可 以完成特定基因的体外复制。以完成特定基因的体外复制。 DNA 的复性指变性的复性指变性 DNA 在适当条件下在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的 现象现象,它是变性的一种逆转过程。热变性它是变性的一种逆转过程。热变性 DNA 一般经缓慢冷却后即可复性一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为此过程称之为“ 退火退火“(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后见后)。DNA 的复性不仅受温的复性不仅受温 度影响度影响,还受还受 DNA 自身特性等其它因素的影响。自身特性等其它因素的影响。 但是，但是，DNA 聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的 DNA 聚合酶，不仅操聚合酶，不仅操 作烦琐，而且价格昂贵，作烦琐，而且价格昂贵，制约了制约了 PCR 技术的应用和发展。技术的应用和发展。 发现发现耐热耐热 DNA 聚合酶聚合酶-Taq 酶酶对于对于 PCR 的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受 90以上以上 的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使 PCR 技术变得非常简捷、同时也大大降低了技术变得非常简捷、同时也大大降低了 成本，成本，PCR 技术得以大量应用，并逐步应用于临床。技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 寡核苷酸寡核苷酸: 是一类只有是一类只有 20 个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸 DNA 或核或核 糖核酸糖核酸 RNA 内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作 为探针确定为探针确定 DNA 或或 RNA 的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。寡的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。寡 核苷酸合成的核苷酸合成的 DNA（脱氧核糖核酸）可以用于链聚合反应，能放大确定几乎所有（脱氧核糖核酸）可以用于链聚合反应，能放大确定几乎所有 DNA 的的 片段，在这个过程中寡核苷酸是作为引物，和片段，在这个过程中寡核苷酸是作为引物，和 DNA 中标的的互补片段结合，作成中标的的互补片段结合，作成 DNA 的复制品。调控寡核苷酸用于抑制的复制品。调控寡核苷酸用于抑制 RNA 片段，防止其翻译成蛋白，在制止癌细胞活动方片段，防止其翻译成蛋白，在制止癌细胞活动方 面能起一定的作用。面能起一定的作用。 PCR 技术的基本原理类似于技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。寡核苷酸引物。PCR 由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步骤构成：延伸三个基本反应步骤构成：模板模板 DNA 的变性：模的变性：模 板板 DNA 经加热至经加热至 93左右一定时间后，使模板左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经双链或经 PCR 扩增形成的双链扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板模板 DNA 与引物与引物 的退火（复性）：模板的退火（复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；引物的延伸：引物的延伸：DNA 模板模板-引物结合物在引物结合物在 TaqDNA 聚合酶聚合酶的作的作 用下，以用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一 条新的与模板条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火退火-延伸三过程就可获得更延伸三过程就可获得更 多的多的“半保留复制链半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟，分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 碱基互补配对原则碱基互补配对原则 the principle of complementary base pairing 在在 DNA 分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和 DNA 两条链之间的距离保持两条链之间的距离保持 不变，使得碱基配对必须遵循一定的规律，这就是不变，使得碱基配对必须遵循一定的规律，这就是 Adenine（A，腺嘌呤）一定与，腺嘌呤）一定与 Thymine（T，胸腺嘧啶）配对，胸腺嘧啶）配对，Guanine（G，鸟嘌呤）一定与，鸟嘌呤）一定与 Cytosine（C，胞嘧啶），胞嘧啶） 配对，反之亦然。碱基间的这种一一对应的关系叫做碱基互补配对原则。配对，反之亦然。碱基间的这种一一对应的关系叫做碱基互补配对原则。 DNA 半保留复制是：半保留复制是：DNA 在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为 模板在其上合成互补链，经过一系列酶（模板在其上合成互补链，经过一系列酶（DNA 聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两 个新的个新的 DNA 分子。分子。 子代子代 DNA 分子其中的一条链来自亲代分子其中的一条链来自亲代 DNA ，另一条链是新合成的，另一条链是新合成的， 这种方式称半保留复制。这种方式称半保留复制。 Comment A1: 这段话没看懂。这段话没看懂。 摘要：摘要： 类似于类似于 DNA 的天然复制过程的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引 物物. PCR 由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步骤构成延伸三个基本反应步骤构成. PCR 技术的基本原理技术的基本原理 类似于类似于 DNA 的天然复制过程的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物. PCR 由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步骤构成：延伸三个基本反应步骤构成：模板模板 DNA 的变性：模板的变性：模板 DNA 经经 加加 热至热至 93左右一定时间后左右一定时间后,使模板使模板 DNA 双链或经双链或经 PCR 扩增形成的双链扩增形成的双链 DNA 解离解离,使之使之 成为单链成为单链,以便它与引物结合以便它与引物结合,为下轮反应作准备；为下轮反应作准备；模板模板 DNA 与引与引 物的退火物的退火(复性复性)：模板：模板 DNA 经加热变性成单链后经加热变性成单链后,温度降至温度降至 55左右左右,引物与模板引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：引物的延伸：DNA 模板模板-引物结合引物结合 物在物在 Taq DNA 聚合酶的作用下聚合酶的作用下,以以 dNTP 为反应原料为反应原料, 靶序列为模板靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复链互补的半保留复 制链重复循环变性制链重复循环变性-退火退火-延伸三过程延伸三过程,就可获得更多的就可获得更多的“半保留复制链半保留复制链”,而且这种新链又而且这种新链又 可成为下次循环的模板可成为下次循环的模板.每完成一个循环需每完成一个循环需 24 分钟分钟,23 小时就能将待扩目的基因扩增放小时就能将待扩目的基因扩增放 大几百万倍大几百万倍.到达平台期到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝所需循环次数取决于样品中模板的拷贝. PCR 的反应动力学的反应动力学 PCR 的三个反应步骤反复进行的三个反应步骤反复进行,使使 DNA 扩增量呈指数上升扩增量呈指数上升.反应最终的反应最终的 DNA 扩增量可扩增量可 用用 Y(1X)n 计算计算.Y 代表代表 DNA 片段扩增后的拷贝数片段扩增后的拷贝数,X 表示平均每次的扩增效率表示平均每次的扩增效率,n 代表代表 循环次数循环次数.平均扩增效率的理论值为平均扩增效率的理论值为 100%, 但在实际反应中平均效率达不到理论值但在实际反应中平均效率达不到理论值.反应初反应初 期期,靶序列靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式片段的增加呈指数形式,随着随着 PCR 产物的逐渐积累产物的逐渐积累,被扩增的被扩增的 DNA 片段不片段不 再呈指数增加再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期而进入线性增长期或静止期,即出现即出现“停滞效应停滞效应”,这种效应称这种效应称平台期数、平台期数、 PCR 扩增效率扩增效率及及 DNA 聚合酶聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素.大多数情大多数情 况下况下,平台期的到来是不可避免的平台期的到来是不可避免的. PCR 扩增产物扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分可分为长产物片段和短产物片段两部分. 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5端之间端之间,是需要扩增的特定片段是需要扩增的特定片段.短产物短产物 片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例以一个原始模板为例,在第一个在第一个 反应周期中反应周期中,以两条互补的以两条互补的 DNA 为模板为模板,引物是从引物是从 3端开始延伸端开始延伸,其其 5端是固定的端是固定的,3端端 则没有固定的止点则没有固定的止点,长短不一长短不一,这就是这就是“长产物片段长产物片段”.进入第二周期后进入第二周期后,引物除与原始模板结引物除与原始模板结 合外合外,还要同新合成的链还要同新合成的链(即即“长产物片段长产物片段”)结合结合.引物在与新链结合时引物在与新链结合时,由于新链模板的由于新链模板的 5 端序列是固定的端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段这就等于这次延伸的片段 3端被固定了止点端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点保证了新片段的起点和止点 都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段短产物片段”. 不难看出不难看出“短产物片段短产物片段”是按指数倍数增加是按指数倍数增加,而而“长产物片段长产物片段”则以算术倍数增加则以算术倍数增加,几乎可以几乎可以 忽略不计忽略不计, 这使得这使得 PCR 的反应产物不需要再纯化的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测片段供分析与检测 用用. 标准的标准的 PCR 反应体系：反应体系： 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 4 种种 dNTP 混合物混合物 各各 200umol/L 引物引物 各各 10100pmol 模板模板 DNA 0.12ug Taq DNA 聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素：反应五要素： 参加参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和、模板和 Mg2+ 引物：引物： 引物是引物是 PCR 特异性反应的关键特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程互补的程 度度.理论上理论上,只要知道任何一段模板只要知道任何一段模板 DNA 序列序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用利用 PCR 就可将模板就可将模板 DNA 在体外大量扩增在体外大量扩增. RT-PCR 技术概述技术概述 RT-PCR 为反转录为反转录 PCR（reverse transcription PCR）和实时）和实时 PCR（realtimePCR）共同的）共同的 缩写。逆转录缩写。逆转录 PCR，或者称反转录，或者称反转录 PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶，是聚合酶 链式反应链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。的一种广泛应用的变形。在在 RT-PCR 中，一条中，一条 RNA 链被逆转录成为互补链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过，再以此为模板通过 PCR 进行进行 DNA 扩增。扩增。 1 逆转录逆转录 PCR 由一条由一条 RNA 单链转录为互补单链转录为互补 DNA(cDNA)称作称作“逆转录逆转录”，由依赖，由依赖 RNA 的的 DNA 聚合酶聚合酶 （逆转录酶）来完成。随后，（逆转录酶）来完成。随后，DNA 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖 DNA 的的 DNA 聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的 PCR。原先的。原先的 RNA 模板被模板被 RNA 酶酶 H 降解，留降解，留 下互补下互补 DNA。 cDNA 是互补脱氧核糖核酸，是与是互补脱氧核糖核酸，是与 RNA 链互补的单链链互补的单链 DNA，以其，以其 RNA 为模板，在适当为模板，在适当 引物的存在下，由引物的存在下，由 RNA 与与 DNA 进行一定条件下合成的。进行一定条件下合成的。DNA(Deoxyribonucleic acid)， 中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为 “遗传微粒遗传微粒”。 Messenger RNA (mRNA）信使核糖核酸信使核糖核酸: 携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板的携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板的 RNA。从脱氧核糖核酸（。从脱氧核糖核酸（DNA）转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸（）转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸（RNA）。）。 它在核糖体上作为蛋白质合成的模板，决定肽链的氨基酸排列顺序。它在核糖体上作为蛋白质合成的模板，决定肽链的氨基酸排列顺序。mRNA 存在于原核生存在于原核生 物和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器（如线粒体和叶绿体）中。物和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器（如线粒体和叶绿体）中。 cDNA 互补脱氧核糖核酸互补脱氧核糖核酸: 为具有与某为具有与某 mRNA(信使信使 RNA)链呈互补的碱基序列的单链链呈互补的碱基序列的单链 DNA 即即 complementaryDNA 之缩写，或此之缩写，或此 DNA 链与具有与之互补的碱基序列的链与具有与之互补的碱基序列的 DNA 链所形链所形 成的成的 DNA 双链。双链。与与 RNA 链互补的单链链互补的单链 DNA，以其，以其 RNA 为模板，在适当引物的存在下，为模板，在适当引物的存在下， 由依赖由依赖 RNA 的的 DNA 聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链 cDNA 后，在用后，在用 碱处理除去与其对应的碱处理除去与其对应的 RNA 以后，以单链以后，以单链 cDNA 为模板，由依赖为模板，由依赖 DNA 的的 DNA 聚合酶或聚合酶或 依赖依赖 RNA 的的 DNA 聚合酶的作用合成双链聚合酶的作用合成双链 cDNA。真核生物的信使真核生物的信使 RNA 或其他或其他 RNA 的的 cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA 的的 cDNA，与原来基因的，与原来基因的 DNA（基因组（基因组 DNA，genomicDNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的 而在而在 mRNA 存在的存在的 3末端的多末端的多 A 序列等的核苷序列上，与序列等的核苷序列上，与 exon 序列、先导序列以及续序列、先导序列以及续 序列等一起反映出序列等一起反映出 mRNA 结构。结构。cDNA 同样可以被克隆。同样可以被克隆。 RT-PCR 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的 RNA。RT-PCR 广泛应广泛应 用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种 RNA 的含量。（检测基因表达的方法，的含量。（检测基因表达的方法， 参见参见 Northern Blot 法。法。 RT-PCR 的的关键步骤是在关键步骤是在 RNA 的反转录的反转录，要求，要求 RNA 模版为完整的且不含模版为完整的且不含 DNA、蛋白质、蛋白质 等杂质。等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia virus,MMLV）反转录酶。）反转录酶。 RT-PCR 有时候也会指代实时有时候也会指代实时 PCR(real-time PCR)。为了与逆转录。为了与逆转录 PCR 相区别，通常被相区别，通常被 写作写作“定量定量 PCR”(quantitative PCR)或者或者 RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 2 实时实时 PCR 实时实时 PCR(real-time PCR)，属于定量，属于定量 PCR（Q-PCR）的一种）的一种，以一定时间内，以一定时间内 DNA 的增幅的增幅 量为基础进行量为基础进行 DNA 的定量分析。的定量分析。 ds-cDNA 是基因文库技术中，通过是基因文库技术中，通过 mRNA 反转录所获得的反转录所获得的 cDNA（第一链），依靠（第一链），依靠 DNA 聚合酶，在一定条件下所延伸的与聚合酶，在一定条件下所延伸的与 cDNA 相互补的第二条相互补的第二条 cDNA 链的英文简称。通过链的英文简称。通过 ds- cDNA 的合成，可以得到源的合成，可以得到源 mRNA 的双链的双链 cDNA 模板，用于后续的酶切处理和基因文库的模板，用于后续的酶切处理和基因文库的 建立。建立。 探针探针是一小段单链是一小段单链 DNA 或者或者 RNA 片段（大约是片段（大约是 20 到到 500bp），用于检测与其互补的核），用于检测与其互补的核 酸序列。双链酸序列。双链 DNA 加热变性成为单链，随后用加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料）、萤光染料 或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。磷。磷-32 通常被掺入组成通常被掺入组成 DNA 的四种核苷酸之的四种核苷酸之 Comment A2: 这里没看懂啊。这里没看懂啊。 。 一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。当将探针与样品杂交时，探一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。当将探针与样品杂交时，探 针和与其互补的核酸（针和与其互补的核酸（DNA 或或 RNA）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探 针被洗去。最后，根据探针的种类，可进行放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来针被洗去。最后，根据探针的种类，可进行放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来 判断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列）。判断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列）。 real time PCR 的定量使用荧光色素，的定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种是在目前有二种方法。一种是在 ds DNA 中插入特异的荧中插入特异的荧 光色素，例如光色素，例如 SYBR Green 荧光染料；另一种使用一种能与增幅荧光染料；另一种使用一种能与增幅 DNA 序列中特定寡核酸序列中特定寡核酸 序列相结合的一种荧光探针（序列相结合的一种荧光探针（probe），如），如 Taqman 探针。两种方法原理不同。探针。两种方法原理不同。 SYBR Green 荧光染料荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链游离时不发光，当反应体系中存在双链 DNA 时，时，SYBR Green 与双与双 链链 DNA 结合，此时才发光。结合，此时才发光。 Taqman 探针探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的 5末端，而淬末端，而淬 灭基团则在灭基团则在 3末端。末端。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探 针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，扩增时，Taq 酶的酶的 53外切外切 酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光 信号可以被检测到。信号可以被检测到。 TaqMan 荧光探针荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的 5末端，而淬灭剂则在末端，而淬灭剂则在 3末端。末端。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，扩增时，Taq 酶的酶的 53外切酶活性将探外切酶活性将探 针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号， 即每扩增一条即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成产物形成 完全同步。常用的荧光基团是完全同步。常用的荧光基团是 FAM，TET，VIC，HEX。 而新型而新型 TaqMan-MGB 探针使探针使 该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化），有望成为基因诊断和个体化 用药分析的首选技术平台。用药分析的首选技术平台。 淬灭剂淬灭剂指通过分子间的能量转移，迅速而有效地将激发态分子（单线态氧和三线态物质）指通过分子间的能量转移，迅速而有效地将激发态分子（单线态氧和三线态物质） 淬灭，使转变成热能或转变成荧光或磷光，而辐射散失，回到基态的一类物质，通过这一淬灭，使转变成热能或转变成荧光或磷光，而辐射散失，回到基态的一类物质，通过这一 过程，使其免遭紫外线破坏，从而达到稳定高分子材料的目的。因此，它有别于紫外线吸过程，使其免遭紫外线破坏，从而达到稳定高分子材料的目的。因此，它有别于紫外线吸 收剂（并不强烈吸收紫外线），且作用机理也不同于紫外线吸收剂（通过分子内的结构变收剂（并不强烈吸收紫外线），且作用机理也不同于紫外线吸收剂（通过分子内的结构变 化转移能量），如常用镍的有机化合物。化转移能量），如常用镍的有机化合物。 real time PCR 与与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的相结合，能用微量的 RNA 来找出特定时间、来找出特定时间、 细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种 RT PCR 的组合又被称之为的组合又被称之为“定量定量 RT- PCR（quantitative RT-PCR）” 3 RT-PCR 技术相关试剂技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于多聚体，相当于 mRNA 引物引物 AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶 MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 dNTPs：脱氧核苷酸：脱氧核苷酸 RNase：RNA 水解酶水解酶 PCR Buffer：RT-PCR 缓冲液缓冲液 MgCl2：2 价镁离子价镁离子 4 PCR 各步骤的目的各步骤的目的 预变性预变性：破坏破坏 DNA 中可能存在的较难破坏的二级结构。使中可能存在的较难破坏的二级结构。使 DNA 充分变性，减少充分变性，减少 DNA 复复 杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的特别是对于基因组来源的 DNA 模模 板，板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动 Taq 酶的反应中，还可激活酶的反应中，还可激活 Taq 酶，酶， 从而使从而使 PCR 反应得以顺利进行。反应得以顺利进行。 三种循环三种循环 模板模板 DNA 的变性：模板的变性：模板 DNA 经加热至经加热至 93左右一定时间后，使模板左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经双链或经 PCR 扩增形成的双链扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板模板 DNA 与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至经加热变性成单链后，温度降至 55左右，左右， 引物与模板引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：引物的延伸：DNA 模板模板-引物结合物在引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保链互补的半保 留复制链。留复制链。 延伸时间原因延伸时间原因 用用 PCR 仪扩增时仪扩增时,(变性变性.退火退火,延伸延伸)循环完成后循环完成后,继续继续 72 度延伸了度延伸了 10 分钟的原因：分钟的原因： 1.延伸时间取决于待扩增延伸时间取决于待扩增 DNA 片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使 用用 TaqDNA 聚合酶，聚合酶，72 度时的碱基掺入率为度时的碱基掺入率为 35-100bp/s，因此延伸速率为，因此延伸速率为 1kb/min。 2.根据延伸速率推得，扩增根据延伸速率推得，扩增 1kb 以内的以内的 DNA 片段片段 1min 即可，而即可，而 3-4kb 则需要则需要 3-4min，依，依 次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至 4-10min，这样做是使，这样做是使 PCR 反应完全反应完全 以提高扩增产量。以提高扩增产量。 3.继续继续 72 度延伸了度延伸了 10 分钟除了可以使分钟除了可以使 PCR 反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是： 在用普通在用普通 Taq 酶进行酶进行 PCR 扩增时在产物末端加扩增时在产物末端加 A 尾的作用，可以直接用于尾的作用，可以直接用于 TA 克隆的进克隆的进 行。行。 DNA 二级结构：二级结构： 1.两条多核苷酸链以相同的旋转绕同一个公共轴形成右手双螺旋，螺旋的直径两条多核苷酸链以相同的旋转绕同一个公共轴形成右手双螺旋，螺旋的直径 2.0nm 2.两条多核苷酸链是反向平行的，一条两条多核苷酸链是反向平行的，一条 5-3，另一条，另一条 3-5 3.两条多核苷酸链的糖两条多核苷酸链的糖-磷酸骨架位于双螺旋外侧，碱基平面位于链的内侧磷酸骨架位于双螺旋外侧，碱基平面位于链的内侧 4 相邻碱基对之间的轴向距离为相邻碱基对之间的轴向距离为 0.34nm，每个螺旋的轴距为，每个螺旋的轴距为 3.4nm DNA 二级结构的稳定作用力二级结构的稳定作用力 1.两条多核苷酸链间的互补碱基对之间的氢键两条多核苷酸链间的互补碱基对之间的氢键 2.碱基对疏水的芳香环堆积所产生的疏水作用力，以及堆积的碱基对间的范德华力，碱基对疏水的芳香环堆积所产生的疏水作用力，以及堆积的碱基对间的范德华力， 3.磷酸集团上的负电荷与介质中的阳离子化合物之间形成的盐键磷酸集团上的负电荷与介质中的阳离子化合物之间形成的盐键 所谓的所谓的 DNA 的一级结构的一级结构，就是指，就是指 4 种脱氧核苷酸的链接及排列顺序，表示了该种脱氧核苷酸的链接及排列顺序，表示了该 DNA 分子分子 的化学构成。核苷酸相互连接形成长的多核苷酸链。两个核苷酸之间的连接通常是通过磷的化学构成。核苷酸相互连接形成长的多核苷酸链。两个核苷酸之间的连接通常是通过磷 酸二酯键（酸二酯键（phosphodiester bond），该键将一个核苷酸的磷酸基团与另一个核苷酸的脱氧），该键将一个核苷酸的磷酸基团与另一个核苷酸的脱氧 核糖连接。由四种脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的长链高分子多聚体为核糖连接。由四种脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的长链高分子多聚体为 DNA 分子分子 的一级结构。的一级结构。DNA 分子中第一个核苷酸的分子中第一个核苷酸的 3-羟基与第二个核苷酸的羟基与第二个核苷酸的 5-磷酸基脱水形成磷酸基脱水形成 3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键,第二个核苷酸的第二个核苷酸的 3-羟基又与第三个核苷酸的磷酸基脱水形成羟基又与第三个核苷酸的磷酸基脱水形成 3,5-磷酸二磷酸二 酯键，依此类推，形成线性多聚体。酯键，依此类推，形成线性多聚体。DNA 分子中第一个核苷酸的分子中第一个核苷酸的 5-磷酸与最末一个核苷磷酸与最末一个核苷 酸的酸的 3-羟基都未参与形成羟基都未参与形成 3,5-磷酸二酯键，故分别称为磷酸二酯键，故分别称为 5-磷酸端磷酸端(或或 5-端端)和和 3羟基端羟基端 (或或 3-端端)。 DNA 的三级结构：的三级结构： 1 超螺旋结构超螺旋结构：环状分子的额外螺旋可以形成超螺旋环状分子的额外螺旋可以形成超螺旋 2 其他三级结构其他三级结构：与蛋白质结合形成复合体与蛋白质结合形成复合体(病毒病毒)；核小体结构核小体结构 生物的绝大部分遗传信息储存于生物的绝大部分遗传信息储存于 DNA 序列中，核苷酸的不同排列顺序决定了生物的多样序列中，核苷酸的不同排列顺序决定了生物的多样 化。研究化。研究 DNA 的一级结构有助于了解的一级结构有助于了解 DNA 的生物学功能。的生物学功能。 PCR 引物的选择引物的选择 对靶序列中潜在的引物位点进行分析，对靶序列中潜在的引物位点进行分析， 这些位点应该不会形成同源多聚体机构，也没有明这些位点应该不会形成同源多聚体机构，也没有明 显的形成二级结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。显的形成二级结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。 （1）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物计算各引物 的熔解温度。的熔解温度。 （2）选择一对匹配完好的正向和反向引物选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的。两条引物的 G+C 含量相似，将产生一种大小含量相似，将产生一种大小 和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的 GC 含量都应在含量都应在 40%-60%之间。之间。 （3）对寡核苷酸的长度和）对寡核苷酸的长度和/或位置进行细调。使得引物的或位置进行细调。使得引物的 3末端核苷酸为末端核苷酸为 G 或或 C。检查。检查 两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律，一条引物上不该含有三个两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律，一条引物上不该含有三个 连续的与另一条引物互补的核苷酸。连续的与另一条引物互补的核苷酸。 注意事项注意事项 (1)双链双链 DNA 的变性温度是由双链中的变性温度是由双链中 C+G 的含量决定的，的含量决定的，C+G 含量越高，模板含量越高，模板 DNA 的溶的溶 解温度就越高。解温度就越高。在选择的变性温度下，在选择的变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过如果变性温度过 低或变性时间过短，会使仅仅富含低或变性时间过短，会使仅仅富含 A+T 区域变性。区域变性。当模板当模板 DNA 的的 G+C 含量超过含量超过 55%的的 时需要更高的变性温度。时需要更高的变性温度。 (2) 复性过程采用的温度至关重要复性过程采用的温度至关重要。 如果复性温度如果复性温度太高太高，寡核苷酸，寡核苷酸引物不能与模板很好的复性引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。，扩增效率将会降低。 如果复性温度如果复性温度太低太低，引物将产生，引物将产生非特异性复性非特异性复性，从而导致非特异性的，从而导致非特异性的 DNA 片段的扩增。片段的扩增。 复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低低 35的条件下进行。的条件下进行。 （3）PCR 扩增所需的循环数目决定于扩增所需的循环数目决定于：反应体系中起始的模板拷贝数反应体系中起始的模板拷贝数；引物延伸和引物延伸和 扩增的效率。扩增的效率。 一旦一旦 PCR 反应进入几何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因反应进入几何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因 素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增 产物应该低到难以检测到的程度。用产物应该低到难以检测到的程度。用 TaqDNA 聚合酶（效率为聚合酶（效率为 0.7）在一个含有）在一个含有 10 的的 5 次次 方个拷贝的靶序列的反应体系中进行方个拷贝的靶序列的反应体系中进行 30 个循环后往往可以做到上述的理想情况。个循环后往往可以做到上述的理想情况。 RT-PCR 是将是将 RNA 的反转录（的反转录（RT）和）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术）相结合的技术.首首 先经反转录酶的作用从先经反转录酶的作用从 RNA 合成合成 cDNA,再以再以 cDNA 为模板为模板,扩增合成目的片段扩增合成目的片段.RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中细胞中 RNA 病毒的含量和直接克病毒的含量和直接克 隆特定基因的隆特定基因的 cDNA 序列序列. 核糖核酸核糖核酸(缩写为缩写为 RNA，即，即 Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中 的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核 糖而得名，简称糖而得名，简称 RNA。RNA 普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。 RNA 和蛋白质生物合成有密切的关系。在和蛋白质生物合成有密切的关系。在 RNA 病毒和噬菌体内，病毒和噬菌体内，RNA 是遗传信息的载体。是遗传信息的载体。 RNA 一般是单链线形分子；也有双链的如呼肠孤病毒一般是单链线形分子；也有双链的如呼肠孤病毒 RNA；环状单链的如类病毒；环状单链的如类病毒 RNA；1983 年还发现了有支链的年还发现了有支链的 RNA 分子。分子。 DNA 和和 RNA 的区别是什么的区别是什么? 1、组成单位不同：组成单位不同：DNA 的组成单位是脱氧核苷酸，的组成单位是脱氧核苷酸，RNA 的组成单位是核糖核苷酸，的组成单位是核糖核苷酸， 2、组成碱基不同：组成碱基不同：DNA 的组成碱基是的组成碱基是 ATGC，RNA 的组成碱基是的组成碱基是 AUGC 3、组成五碳糖不同：组成五碳糖不同：DNA 的组成五碳糖是脱氧核糖，的组成五碳糖是脱氧核糖，RNA 的组成五碳糖是核糖，的组成五碳糖是核糖， 4、空间结构不同：空间结构不同：DNA 是双螺旋结构，是双螺旋结构，RNA 一般是单链。一般是单链。 5、功能不同：功能不同：DNA 是遗传物质，是遗传物质，RNA 一般在细胞中不作为遗传物质。一般在细胞中不作为遗传物质。 RNA 大体可以分为三类大体可以分为三类 mRNA(信使信使 RNA) rRNA(核糖体核糖体 RNA) tRNA(转运转运 RNA) 不同的不同的 RNA 有着不同的功能有着不同的功能 rRNA 是核糖体的组成成分，由细胞核中的核仁合成，而是核糖体的组成成分，由细胞核中的核仁合成，而 mRNA tRNA 在蛋白质合成的不在蛋白质合成的不 同阶段分别执行着不同功能。同阶段分别执行着不同功能。 mRNA 是以是以 DNA 的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要的一条链为模板