pdcd5基因在初诊graves病患者pbmcs中表达情况的初步研究(1)

PDCD5PDCD5 基因在初诊基因在初诊 GravesGraves病患者病患者 PBMCsPBMCs 中表达情况的初步研究中表达情况的初步研究(1)(1) 作者：金秀平，李明，赵杰，马绍杰，贾伟，陈冬，吴乃 君，张秀军 【摘要】目的探讨促凋亡基因 PDCD5mRNA 在初诊 Graves病患者外周血单个核细胞中的表达。方法 半定量 RTPCR 法检测 53 例初诊 GD 患者外周血单个核细 胞 PDCD5mRNA 表达的阳性率和表达水平。结果 35 例 PDCD5mRNA 在 GD 患者 PBMCs 中表达呈阳性，阳性率为%，较 正常对照者升高；其表达水平显著高于正常对照，且 GD 患 者高 T3 水平组 PDCD5mRNA 的表达显著高于低 T3 水平组。 结论 PDCD5mRNA 在 GD 患者 PBMC 表达升高，可能与 GD 淋巴 细胞凋亡异常有关。 【关键词】PDCD5；Graves病；凋亡；外周血单个核 细胞；反转录聚合酶链式反应 ApreliminarystudyontheexpressionofPDCD5inperipheral blood monocytesfrompatientswithuntreatedGravesdisease ABSTRACT:ObjectiveTostudytheexpressionofPDCD5inperi pheralbloodmonocytesfromnormalsubjectsandpatientswi thuntreatedGravesdisease.MethodsTheexpressionofPD CD5wasassayedbysemiquantitativereversetranscripta sepolymerasechainreaction.ResultsPositiveratewa ssignificantlyhigherinGDgroupsthaninnormaldonorgrou p.TherelativeexpressionlevelwasalsohigherinGDgrou psthaninnormaldonorgroup.Asignificantlyhigherexpr essionofPDCD5wasobservedinGDpatientswithahigherT3le velthanthatinthelowerT3levelpatients.ConclusionThes eresultssuggestthatthehigherexpressionofPDCD5mRNAma ybeinvolvedinabnormalapoptosisoflymphocytesinGDpati ents. KEYWORDS:programcelldeath5;Gravesdisease;apoptosi s;PBMC;RTPCR PDCD5 即程序性细胞死亡因子 5 是由北京大学人类疾病 基因中心从白血病细胞株 TF1 细胞中克隆得到的，是我 国拥有自主知识产权的新功能基因，具有促进多种细胞凋 亡和抑制增殖的效应。研究发现 PDCD5 在桥本病甲状腺滤 泡细胞中阳性表达，而在正常甲状腺细胞中几乎不表达1。 PDCD5 在初诊未治疗的 GD 患者中的表达情况尚未见报道。 为此，我们通过半定量 RTPCR 方法测定了 35 例 GD 患者 外周血单个核细胞 PDCD5mRNA 的表达情况，并探讨了 PDCD5 的表达与 GD 病的相关性。 1 材料与方法 研究对象与主要试剂研究对象：GD 组为目的基因阳性 表达的患者 35 例，平均年龄岁，均为就诊于我院内分泌科 门诊或病房的患者，均未给予抗甲状腺治疗。依临床表现、 甲状腺功能检测结果以及甲状腺核素扫描等临床诊断，确 定为 Graves病。所选对象均为初诊患者，且无其他自身 免疫性疾病、肿瘤及内分泌疾病病史。按 T3 水平分为 GD1 组 16 例，GD2 组 19 例。正常对照组 18 例，为本院健康查 体人员，其中 10 例目的基因呈阳性表达，平均年龄岁。主 要试剂：TrizolRNA 提取试剂和 2TaqPCRMasterMix 均购 自天根生化科技有限公司，MMLV 逆转录试剂盒购自 PROMEGA 公司。 细胞的分离取研究对象的静脉血，EDTA 抗凝，按常规 用 Ficoll 密度梯度离心分离单个核细胞。 半定量 RTPCR 检测 PDCD5 基因的表达 mRNA 的提取按 Trizol 总 RNA 分离试剂盒说明书进行。离心收集约 1106 细胞，顺次加入 Trizol 提取液、氯仿、异丙醇提取细胞的 总 RNA。紫外分光光度仪分别在 260nm 和 280nm 波长下分析 RNA 的吸光值，测定 RNA 的纯度并定量。cDNA 合成按 MMLV 逆转录酶产品说明书推荐的方法。在 Ep 管中分别加 入 2g 总 RNA、Oligo18、dNTP、5MMLV 逆转录酶缓冲 液、DTT、Rnasin、MMLV 逆转录酶和 DEPCH2O，反应体系 为 40L。逆转录条件为：371h，然后 7210min。PCR 反应：取 2LcDNA，加入 PDCD5 特异性的引物、 2TaqPCRMasterMix 和去离子水，反应体系为 50L。PDCD5 引物序列为：上游引物 5CAACAGGAAGCAAAGCAC3；下游引物为 5GATCTTAACTTCTGTCCTAGAC3，扩增片段长度为 384bp。以 actin 为内参照，其引物序列为：上游引物 5CCCAGGCACCAGGGCGTGATGGT3；下游引物为 5GGACTCCATGCCCAGGAAGGAA3，扩增片段长度为 701bp。PCR 反应条件为：943min 预变性，然后 9440s 变性，6145s 退火，7250s 延伸，共 35 个循环，最后 7210min 结束反应。将 8LPCR 产物加样至 10g/L 琼脂糖 凝胶样品孔中，在 1TAE 电泳缓冲液中电泳鉴定 PCR 产物， 紫外灯下观测电泳结果，BIORADGDXX 凝胶成像系统照相 记录实验结果，用 QuantityOne 软件测定每个条带的吸光 值，并计算样品 PDCD5 条带与内参照 actin 条带的吸 光度比值。用相对吸光度单位表示 mRNA 表达量,相对吸光 度单位=PDCD5 吸光度单位/actin 吸光度单位 100%。PCR 产物的测序与 DNA 同源性分析：为证实 PCR 产 物确为 PDCD5 扩增片段，对扩增产物进行直接序列测定， 将 50L 已纯化的 PCR 产物送上海生工生物工程技术服务 有限公司进行 DNA 序列测定。测序结果应用 BLAST 软件与 GenBank 序列进行同源性分析。 统计学处理应用统计软件进行数据统计与分析，各组 结果以s 表示，各组之间均数比较用 t 检验，PDCD5 基因 阳性率的比较用 2 检验。 2 结果 序列测定 PDCD5 基因 PCR 扩增产物进行双向序列测定， 经与 GenBank 序列对比，同源性均为 100%，证实 PCR 产物 的正确性。 正常人外周血单个核细胞 PDCD5 基因的表达在 mRNA 水 平上，用 RTPCR 方法研究了正常查体人员 PBMCsPDCD5 基 因的表达。结果表明，PDCD5 的 mRNA 在正常人外周血单个 核细胞中表达的阳性率%，表达量平均为。 Graves病患者外周血单个核细胞 PDCD5 基因的表达 35 例 GD 患者