fmoc固相合成法合成黑色素细胞刺激素（msh）的工艺研究(1)

FmocFmoc 固相合成法合成黑色素细胞刺激素固相合成法合成黑色素细胞刺激素（MSHMSH）的工艺研究）的工艺研究(1)(1)【关键词】固相合成；肽类；MSH；芴甲氧羰基【Abstract】AIM:Tostudytheprocessandinfluencingfactorsofsynthesizingthemelanocytestimulatinghormone（MSH）peptidebyFmocsolidphasesynthesis.METHODS:WithFmoctoprotecttheaminoacid,TBTU/HOBT/DIEAwereusedascouplingreagentstosynthesizethepeptideofMSH.Thesynthesizedpeptidewaspurifiedbythechromatographandidentifiedbymassspectrograph.RESULTS:Thepeptideyieldwas63%.Thesynthesizedpeptidepurityreachedto%afterbeingpurifiedbyRPHPLC.ThemolecularmassofthesynthesizedpeptidewaskubyMALDIMSanditwasconsistentwiththetheoreticmolecularmassofku.CONCLUTION:Thismethodofsynthesisisrapid，simpleandeffectiveforthepeptideMSH,anditsfitforthelargescaleproduction.【Keywords】solidphasesynthesis;peptides;MSH;Fmoc【摘要】目的：研究 9 芴甲氧羰基（Fmoc）固相合成法合成黑色素细胞刺激素工艺的步骤及其影响因素.方法：采用 Fmoc 保护 氨基，以 TBTU/HOBT/DIEA 为缩合剂合成MSH.用色谱仪和质谱仪对合成的多肽进行纯化、鉴定.结果：多肽合成的得率可达 63%，经反相高效液相色谱仪（RPHPLC）对合成的多肽进行纯化后可得纯度为%的目标肽.通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪（MALDIMS）检测所合成多肽的分子质量为 ku，与其理论分子质量 ku 相符.结论：该合成法具有快捷、简便、高效地合成多肽 MSH 的特点，适合大批量生产.【关键词】固相合成；肽类；MSH；芴甲氧羰基0 引言多肽作为生物体内的重要组成部分之一，在体内各脏器中有许多复杂而特殊的生理活性1.黑色素细胞刺激素是由 13 个氨基酸组成的一种内源性的神经免疫调节肽，可抑制发热与主要类型的实验性炎症.固相法作为多肽合成领域的一个重大突破在合成多肽 MSH 中具有快速、简便、高效等优点2 ，但需要对不参与反应的氨基加以保护，同时氨基酸的侧链上的活性基团也要给予保护.保护基的选择既要保证侧链基团不参与反应，又要保证在肽链合成过程中不受破坏，同时还要保证在最后肽链裂解时能被除去3.国内外经常采用叔甲氧基（Boc）保护 氨基，却难以合成对酸不稳定的多肽.由于本次合成的多肽 MSH 中含有色氨酸，对酸不稳定.我们旨在采用 9 芴甲氧羰基（Fmoc）基团保护 氨基以合成 MSH.1 材料和方法材料 RPHPLC 型高效液相色谱仪;基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪（MALDIMS，Hewleftpackar 公司） ；台式离心机（北京仪器六厂） ；台式冻干机（军事医学科学院四环仪器厂） ；Fmoc 保护的氨基酸（Merck 公司） ；1 羟基苯并三氮唑（HOBT） ，1 氧 3 双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐（TBTU,ABI 公司） ；二异丙基乙胺（DIEA） ，三氟乙酸（TFA,Sigma 公司） ；乙腈（Fisher 公司） ；NN 二甲基甲酰胺（DMF） ，二氯甲烷（DCM） ，异丙醇，FmocRinkAmideMBHAResin吉尔生化（上海）有限公司.方法树脂的选择根据导入反应基团的不同，可以把树脂分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或烯肼型树脂等4.本次 Fmoc 固相合成的 MSH 的末端需要酰氨化,故需要选用一种 Rink 氨基树脂即 RinkAmideMBHAResin，在RinkAmideMBHAResin 中加入缩合剂 TBTU/HOBT/DIEA 使 MSH的 Val 与树脂之间形成酰胺键，以此来完成氨基酸的固定.与 FmocRinkAmideMBHAResin 的连接根据合成多肽的序列，将 RinkAmideMBHAResin 置于已用 DCM 浸泡过的反应器中，加入 DMF 浸泡 30min 左右，使其充分膨胀，然后用含200mL/L 哌啶的 DMF 溶液脱除树脂上的 Fmoc 基团，再用异丙醇洗涤树脂 2 次，最后用 DMF 洗涤树脂 3 次，当用 50g/L茚三酮检测呈阳性时将 FmocValOH，TBTU，HOBT,DIEA 及DMF 配成的反应液加入到树脂中，室温下反应 h，当用茚三酮检验呈阴性时再用异丙醇、DMF 溶液各洗涤 2 次.即完成第 1 个氨基酸与树脂的连接.接肽反应选用的接肽反应缩合剂为具有缩合效率高、反应速度快、不易发生消旋化反应的 TBTU/HOBT/DIEA 的混合液5,反应时间约为 h，每次反应后取少量树脂用茚三酮法检测，若呈阳性说明反应不完全，继续加入缩合剂，使其充分反应.若呈阴性说明反应完全，用含 200mL/L 哌啶的 DMF 溶液脱除新接入氨基酸的 Fmoc 基团以便于下一个氨基酸的羧基反应.重复此过程至 MSH 中所有氨基酸全部接入.树脂的切割 MSH 合成完毕后，用 N2 吹干 MSH 树脂，将其置于反应器中，加入切割试剂（10mLTFA，mL 苯甲硫醚，mL 巯基乙醇，mL 水，g 苯酚） ，室温下磁力搅拌反应 3h 左右，使 MSH 与树脂分离，再经砂芯过滤，将滤液加入冰乙醚中析出多肽，最后经离心分离获得 MSH 粗品.的纯化和质谱鉴定多肽合成过程中的各种副反应、消旋化以及脱保护的过程中由于保护基的残留、肽键的断裂、烷基化等原因会造成产品不纯.根据目的肽的要求可采用适当的方法进行纯化.我们选用的是具有快速、高效和较高回收率等特点的 RPHPLC 进行纯化6 ，采用 MALDIMS 鉴定所得产品.2 结果 氨基保护基团的选择及其脱除绘制 Fmoc 基团的脱除效果与哌啶的含量及其脱除时间关系曲线，可以看出随着哌啶含量的增加，脱除反应速度在加快，本次合成选用含200mL/L 哌啶的 DMF 溶液反应 25min，脱除率在 99%以上，可以很好的脱除 Fmoc 保护基团（图 1）.图 19 芴甲氧羰基的脱除率与哌啶含量及脱除时间的关系（略）粗品的分析图色谱图中峰数较多，利用色谱工作站软件可知，合成的多肽粗品中，主峰物质占 68%（图 2）.PRHPLC 色谱条件：mm25cm；流动相中 A 液:1mL/L 三氟乙酸的纯水溶液，B 液:1mL/L 三氟乙酸的乙腈溶液；梯度洗脱方式:900mL/LA 液 100mL/LB 液在 30min 内降为100mL/LA 液 900mL/LB 液，流速:1