rna干扰对流感病毒np和pa基因表达及病毒增殖的抑制(1)

RNARNA 干扰对流感病毒干扰对流感病毒 NPNP 和和 PAPA 基因表达基因表达 及病毒增殖的抑制及病毒增殖的抑制(1)(1) 作者：李瑶琛，赵志刚，李康生 【关键词】正粘病毒科 RNAinterferencemediatedinhibitionofinfluenzavirusNP andPAgeneexpressionsandmultiplicationinMDCKcells 【Abstract】AIM:ToapplythesmallinterferingRNAstarge tingNPor/andPAgeneofinfluenzavirustoinhibittheexpre ssionofNPor/andPAandmultiplicationofinfluenzavirusi nMadinDarbycaninekidneycells.METHODS:Therecombinant plasmids,pEGFP/NP,pGenesil/PAandpEGFP/NPPAwereconst ructedandtransfectedintoMDCKcells.ThetransfectedMDC KcellswereinfectedwithsubtypeH5N1strain.Thetransfec tionefficiencywasdeterminedusingfluorescencemicrosc opy.TheexpressionlevelsofNPgeneweredeterminedbyWest ernblotandthetranscriptionsofNPor/andPAgeneweredete ctedbysemiquantitativeRTPCR.Theculturesupernatantsw ereassayedforhemagglutinationactivityatdifferenttim epointsafterinfectioninordertodeterminetheeffectoft hesiRNAonthemultiplicationofinfectiousvirus.RESULTS:T heresultsfromfluorescencemicroscopysuggestedthatthe transfectionefficiencywasabout%.Theintroductionsofp lasmidspEGFP/NPandpEGFP/NPPAshowedefficientinspecif icallyinhibitingtheexpressionofNPaccordingtotheresu ltsofWesternblot,withinhibitoryratesof%and%.Semiqua ntitativeRTPCRshowedthatthetranscriptionofNPgenewas reducedbynearly%ininfectedMDCKcellsaftertransfected bypEGFP/NP,andPAgenewasreducedbynearly%ininfectedMD CKcellsaftertransfectedbypGenesil/PA.Thetranscripti onsofNPandPAgeneswerereducedbynearly%and%synchronou slyininfectedMDCKcellstransfectedbypEGFP/NPPA.Incon trast,thecontrolplasmiddidexhibitnoinhibitoryeffect ontheproteinexpressionsandthetranscriptionofNPor/an dPAgene.TheinhibitoryratesofinfluenzavirusinMDCKcel lstransfectedwithpEGFP/NP,pGenesil/PAandpEGFP/NPPAw ere%,%and%respectivelyaccordingtotheHAresults,which demonstratedthattheinhibitoryabilityofpEGFP/NPPAwas thestrongestamongthevariousgroups.CONCLUSION:Thesma llinterferingRNAstargetingNPor/andPAgeneshowsadrama ticinhibitiononproteinexpression,RNAtranscriptionan dmultiplicationofinfluenzavirusinMDCKcells. 【Keywords】RNAinterferece;orthomyxoviridae;MDCKcel lline;NPgene;PAgene 【摘要】目的：应用 RNA 干扰技术（RNAi）研究针对 流感病毒 NP 或/和 PA 基因的 siRNA 抑制 NP 或/和 PA 基因 的表达及抑制流感病毒在 MDCK 细胞中的增殖.方法：分别 构建针对 NP，PA 及同时干扰 NP 和 PA 的三种 siRNA 表达质 粒 pEGFP/NP，pGenesil/PA 和 pEGFP/NPPA，转染 MDCK 后， H5N1 亚型流感病毒感染细胞，荧光显微镜判断转染效率， 蛋白质印迹和半定量 RTPCR 检测 NP 及 PA 蛋白表达及基因 转录水平的变化，并在不同时间点检测细胞培养上清中的 血凝值（HA） ，观察 siRNA 抑制流感病毒增殖的能力.结果： 荧光显微镜结果表明，重组质粒转染效率达%.蛋白质印迹 结果表明，重组质粒 pEGFP/NP 和 pEGFP/NPPA 均能抑制 NP 蛋白在 MDCK 细胞内的表达，两者的抑制率分别为%和%.半 定量 RTPCR 检测到 pEGFP/NP 质粒在 MDCK 细胞内对 NP 基因 的转录抑制率为%；pGenesil/PA 质粒对 PA 基因的转录抑制 率为%；pEGFP/NPPA 质粒对 NP 和 PA 基因的转录同时抑制率， 分别为%和%.而对照质粒 pEGFP/HK 对 NP 或/和 PA 基因的蛋 白表达及转录均没有抑制作用.HA 结果表明，三种质粒均能 抑制流感病毒在 MDCK 细胞中的增殖，以 pEGFP6/NPPA 的作 用最为显著，它们抑制流感病毒增殖的能力分别为%，%和%.结 论：NP 或/和 PA 基因的 siRNA 质粒可明显抑制 NP 或/和 PA 基因的转录和表达，并有效地抑制流感病毒在 MDCK 细胞中 的增殖. 【关键词】RNA 干扰；正粘病毒科；MDCK 细胞株；NP 基因；PA 基因 0 引言 近来，禽流感在世界各地频繁爆发，不仅给养禽业造 成了巨大的经济损失1 ，也严重威胁到人类的健康2.高 致病性的 H5N1 亚型是较为严重的一类3.而现有的、针 对 HA 和 NA 的流感疫苗在流感病毒新亚型出现时却无能为 力4.我们利用 RNA 干扰技术5 ，选择在 A 型流感病 毒复制过程中起重要作用的 RNA 聚合酶 PA（polymeraseacidicprotein,PA）或/和核蛋白编码基因 中的高度保守序列作为 siRNA 靶序列，将其分别或同时克 隆入表达载体，在马丁达比狗肾 （MadinDarbycaninekidney，MDCK）细胞中，观察诱导 PA 或 NP 基因沉寂情况，以期具有更高的抑制效能，为预防与 治疗流感寻找一种有效的措施. 1 材料和方法 材料 pEGFP 和 pGenesil1 载体由武汉晶赛生物技术有 限公司提供.限制性核酸内切酶购自 NEB 公司.连接酶、 DNAMarker 由 Takara 公司提供.转染试剂 LipofectamineTMXX 购自 Invitrogen.兔抗人 NP 抗体购于 晶美生物工程有限公司，actinmAb 及 HRP 聚合的羊抗兔 IgG 购自 Sigma 公司. 方法选用流感病毒 A/Pheasant/Shantou/44/XX.将病毒 接种于 10d 鸡胚尿囊腔中，置于 37的孵箱中，于病毒接 种后的 48h 收获尿囊液，冻融、离心后分装贮存于-70备 用.测定其空斑形成单位（plaqueformingunits,PFU）及感 染复数（multiplicityofinfection，MOI）.据文献6 ， 结合 siRNA 序列设计原则，确定 PA2087 和 NP1496 各 19 个 单核苷酸作 RNA 干扰靶序列.正义链： 5gatccggatcttatttcttcggagttcaagacgctccgaagaaataag atccttttttgaattca3，反义链： 3gcctagaataaagaagcctcaagttctgcgaggcttctttattctagg aaaaaacttaagttcga5;PA2087，正义链： 5gatccgcaattgaggagtgcctgattcaagacgtcaggcactcctcaa ttgcttttttgagctca3，反义链： 3gcgttaactcctcacggactaagttctgcagtccgtgaggagttaacg aaaaaactcgagttcga5，上述两序列的 5端和 3端分别 引入 BamHI 和 HindIII 的酶切序列，也在 HindIII 位点内 侧分别引入 EcoRI 和 SacI 的酶切位点，以便将两个 RNA 干 扰序列以串连的方式克隆入同一个载体中的两个 U6 启动子 后，即 U6promoterNPU6promoterPA，这样可同时产生两个 RNA 干扰序列.等量的正反义寡核苷酸（长 65nt）混合、退 火后分别插入经 BamHI 和 HindIII 线性化的载体 pEGFP 和 pGenesil1 中，得到重组载体 pEGFP/NP 和 pGenesil/PA.两 载体经 SacI 和 SalI 双酶切后，分别回收载体与片段并连 接，构建成新的重组子 pEGFP/NPPA.实验中为了排除 siRNA 本身的影响，设计了一个与流感病毒基因组序列无关 的 HK 序列作为对照，寡核苷酸片段均由上海生工生物工程 技术服务有限公司合成.MDCK 细胞株常规培养于含有 100mL/LFCS,2mol/L 谷胺酰胺、105U/L 青霉素和 100mg/L 链霉素的 MEM 培养基中，每 23d 进行细胞传代.转染采用 LipofectamineTMXX，根据说明书进行操作.分为 pEGFP/NP,pGenesil/PA,pEGFP/NPPA,pEGFP/HK 和未转染对 照组进行实验.转染后 6h 更换正常培养基，12h 后在荧光显 微镜与流式细胞仪下观察 EGFP 的表达，计算转染效率.细 胞转染 12h 后，经 H5N1 感染 72h，g/L 的胰酶消化，收集 细胞，提取 RNA.在 RTPCR 反应体系中逆转录引物采用 Uni12 和 PolyT 进行，PCR 扩增的三对引物,第 1 对是内源 性对照 actin，第 2 对与第 3 对是被沉寂的目的基因引物， 即 H5N1/NP 和 H5N1/PA.GeneTools 软件判定靶基因的沉寂 程度.收集转染并经感染的细胞，提取总蛋白，紫外分光光 度计法进行蛋白质定量.50g 蛋白质进行 120mL/LSDSPAGE（BioRad,USA） ，之后转至 NC 膜上.NP 抗体 的浓度为 1400，二抗（羊抗兔 IgG/HRP）为 13000，辣 根过氧化物酶/LumiGLO 化学发光法进行 Western 检测. Ge