深部感染真菌的实验诊断课件

深部感染真菌的实验诊断 常见深部真菌感染 条件致病性真菌 致病性真菌 一、假丝酵母菌 假丝酵母菌 假丝酵母菌属。该属菌有81个种 ，其中有11种对人类有致病性，以白假丝酵母菌为最常见 的致病菌。 （一）分类 （二）临床意义 1皮肤粘膜感染 有鹅口疮、口角糜烂、 外阴与阴道炎等。 口腔黏膜感染 2内脏感染 支气管炎和肺炎、食管炎、肠炎、膀胱炎和肾盂肾炎等 。 3中枢神经感染 脑膜炎、脑膜脑炎、脑脓肿等 （三）形态和培养特征 假菌丝 厚膜孢子 类酵母型菌落 （一）分类 隐球菌属种类繁多，包括17个种和7个变种，其中新 生隐球菌及其生物变种是隐球菌属中唯一致病的真菌，正 常人的体表、口腔、粪便中也可分离到此菌。 二、隐球菌 （二）临床意义 初感染灶多为肺部，引起轻度炎症。 最易侵犯的是中枢神经系统，引起慢性脑膜炎，出现 脑膜刺激症状。 新生隐球菌脑膜炎常发生于体质虚弱免疫力低下者。 如白血病、艾滋病、类肉瘤等病人。 荚膜多糖是新生隐球菌重要的致病物质。 （三）形态和培养特征 墨汁染色 酵母型菌落 （一）分类 曲霉菌种类很多，目前已知曲霉菌及其相关的有性型 近190种，大约20种可引起人或动物感染，其中烟曲霉、黄 曲霉和黑曲霉为最普遍的致病曲霉菌。 （二）临床意义 本菌可以引起原发性感染，也可致继发性感染，出现 过敏性反应、浅部感染、肺曲霉菌病、侵袭性（播散性） 曲霉菌病等， 三、曲霉菌 1肺曲霉菌病 (1)真菌球型肺曲霉菌病 (2)肺炎型曲霉菌病 (3)过敏性支气管曲霉菌病 2全身性曲霉菌病 3中毒与致癌：有些曲霉菌产生的毒素，可引 起人或动物急、慢性中毒，损伤肝、肾、神经 等组织。特别是黄曲霉毒素与人类肝癌的发生 有密切关系。 （三）形态和培养特征 曲霉菌在沙保培养基上， 室温及3745均能生 长，形成绒毛状或絮状菌 落。菌落开始为白色，随 着孢子的产生，不同菌种 可呈现各种不同的颜色。 多数菌种只有无性阶段， 少数菌种存在有性阶段。 黄曲霉菌 烟曲霉菌 四、毛霉菌 （一）分类 毛霉目真菌有7个科，主要是毛霉科。毛霉科中的根霉属 、梨头霉属、毛霉属、根毛霉属常引起毛霉病。其中根霉属 中的少根根霉和米根霉两种最多见。 （二）临床意义 毛霉菌病为机会感染，常出现在糖尿病及白血病病人和 接受器官移植者。 毛霉菌感染大多首先发生在鼻或耳部，经口腔唾液流入 上颌窦和眼眶，形成肉芽肿。后经血流入脑部，引起脑膜 炎。严重病例毛霉菌扩散至全身，可导致死亡。多通过尸 体病理组织检查才能确诊。 （三）形态和培养特征 孢子囊 本菌在沙保培养基上生长迅速 ，形成丝状菌落，有些霉菌有匍 匐菌丝，在培养基表面横向生长 ，其产生的假根伸入培养基内， 孢囊梗与假根对生。 五、组织胞浆菌 （一）分类 组织胞浆菌属半知菌亚门，有两个种： 一是荚膜组织胞浆菌，是Darling于1905年在美洲巴拿马运 河区患者病灶中检出，故又称美洲型组织胞浆菌； 二为组织胞浆菌的杜波变种，或称杜波组织胞浆菌，是 Dubois于1957年在南非发现，故又称为非洲型组织胞浆菌 。 （二）临床意义 正常人吸入该菌后引起轻微一过性的肺部感染，在易 感个体内可引起肺部慢性感染或播散性感染。 本菌主要侵犯网状内皮系统，有时也可引起血行播散 而侵犯全身各脏器。荚膜组织胞浆菌引起的临床病症有： 1急性肺组织胞浆病 2慢性肺组织胞浆菌病 3播散性组织胞浆菌病 （三）形态和培养特征 厚壁孢子，四周有棘突，排列如齿 轮，这种孢子有诊断价值。 在沙保培养基上室 温下生长缓慢，形 成白色棉絮样菌落 ，逐渐从黄色转变 为褐色。 六、卡氏肺孢菌 （一）临床意义 卡氏肺孢菌广布于自然界，可引起健康人 的亚临床感染。但对一些先天免疫缺陷或因各种原 因受到免疫抑制的患者，可引起肺炎。艾滋病患者 当CD4+T细胞降至200/mm3时，80%以上可受感 染。发病为渐进性，开始引起间质性肺炎，最终患 者因窒息而死。 （二）形态和培养特征 卡氏肺孢菌的生物学特性与一般真菌有些不同，可 分几个阶段：最初为营养型，呈单核的孢子囊(45m)； 成熟的孢子囊(5.0m)内含8个球状、卵圆状或梭状孢子 ；孢子囊成熟后破裂，释放出其中的孢子。 第二节 标本的采集 一、采集标本的类别 1深部真菌感染应取血液、脑脊液、脓汁等。 2各种分泌物和排泄物：生殖道、分泌物、耳 垢、痰、粪便、尿液等。 3血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴 穿刺液等。 4脓汁及渗出物。 二、采集的注意事项 采集的标本要适宜，不同真菌感染应采取不同的临 床标本。怀疑深部真菌感染应取血液、脑脊液、脓汁等 。 在用药前采集标本，一般真菌标本须在用药前采集 ，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。 采集的标本量要足，血液和脑脊液标本5ml，胸腔液 20ml，并且应立即送检 ， 深部真菌标本最长不得超过2h 。 严格无菌操作，并进行消毒处理，尤其是采集血液 和脑脊液标本，要避免污染杂菌。 第三节 实验诊断 一、标本的直接检查 显微镜检查 曲霉菌 卡氏肺胞菌 用荧光染色法进行染色后，在荧光显微镜下观察，白 假丝酵母菌黄绿色 二、分离培养与鉴定 真菌培养是目前鉴定真菌的 唯一方法。菌落是鉴别真菌 的方法， 37 25 表28-1 深部感染性真菌的鉴定 深部真菌 菌落特征镜检镜检 特征鉴鉴定特征或试验试验 假丝丝酵母菌 沙保弱培养基25或37培 养1-4d后，培养基表面可出 现现奶油色类类酵母型菌落。 镜检镜检 可见见假菌丝丝和芽生孢孢子 。 1.芽管形成试验试验 2.厚膜孢孢子形成试验试验 3.糖同化或发发酵试验试验 4.动动物试验试验 新生隐隐球菌 病原性隐隐球菌在25和37 孵育均可生长长,而非病原性 隐隐球菌在37时时不生长长。 培养2-5d后生长长成酵母型菌 落。 取菌落作墨汁负负染色镜检镜检 可 见见透亮菌体及菌体外透明的 宽宽厚荚荚膜。 1.氧化酶试验试验 2.脲脲酶试验试验 3.糖同化试验试验 4.动动物试验试验 曲霉菌 标标本经经沙保弱培养基室温培 养后形成黄绿绿色毛状菌落。 涂片镜检镜检 可见见特征性的分生 孢孢子头头和足细细胞 1.形态态和菌落特征 2.免疫学试验试验 （ELASA等 ） 毛霉菌 临临床标标本接种不含放线线菌 酮酮的麦芽糖培养基、马铃马铃 薯培养基及沙保弱培养基， 25或37培养，初起菌落 表面呈棉花样样、白色，渐渐 变为变为 灰褐色或其他颜颜色， 顶顶端有黑色小点。 镜检镜检 菌丝丝无隔或极少分隔， 孢孢囊梗直接由菌丝长丝长 出，常 单单生，分枝或极少不分枝。 1.培养、形态态特征 2.免疫荧荧光技术进术进 行组织组织 切片染色 组织组织 胞浆浆菌 37培养时时呈酵母型菌落， 室温下或人工培养时变为时变为 丝丝状型菌落。 姬姆萨萨染色镜检镜检 在巨噬细细胞 发现发现 卵圆圆形的较较小一端有出 芽可疑为荚为荚 膜组织组织 胞浆浆菌。 皮损损、脓脓液等标标本经经20 KOH涂片后镜检镜检 ，见见厚壁酵 母细细胞，细细胞内可见见脂肪小 滴者可疑为为杜波组织组织 胞浆浆菌 。 1.脲脲酶试验试验 2.明胶液化试验试验 卡氏肺孢孢菌 最成功的培养基是用Uero细细 胞系和极少的必需介质质以及 胎牛血清 果氏环环六亚亚甲基四胺银银（ GMS）染色确认认卡氏肺孢孢虫 包囊。金标标染色为亚为亚 甲胺蓝蓝 染色包囊囊壁呈深褐色或黑 色，囊壁可见见特征性括弧样样 结结构，囊内小体不着色。荧荧 光素染色孢孢囊壁呈明亮蓝绿蓝绿 色光环环，同样样可辨囊壁上括 弧样结样结 构。 1.卡氏肺孢孢菌抗原检测检测 2.染色 3.核酸检测检测 无选择性 选择性 鉴别 常 用 的 培 养 基 沙保培养基 脑心浸液培养基 血琼脂培养基 加入适量配伍的抗生素 马铃薯葡萄糖琼脂 酵母浸膏琼脂 玉米粉琼脂 蔡氏琼脂 分离培养常用的培养基为沙保培养基。 培养的方法有试管培养法、大培养法和小培养法。 三、免疫学检测 竞争性ELISA 免疫印迹法 胶乳凝集试验 单克隆抗体法 卡氏肺孢菌抗原 曲霉抗原 免疫荧光法组织胞浆菌的抗原 半定量放射免疫法荚膜组织胞浆菌循环多糖抗原 新生隐球菌抗原 白假丝酵母菌抗原 采用IFA、ELISA、CFT、RIA等免疫学检测技术，检测可疑 深部真菌感染患者体内的特异性抗体，用于流行病学调查 四、核酸检测 lDNA(RAPD)以及DNA 特殊片段测序 l核酸碱基G+C mol分析 l限制性片段长度多态性(RFLP) lSouthern印迹分析 l脉冲场凝胶电泳(PFGE) lPCR指纹、随机扩增多态性 五、组织病理学检查 l传统的HE染色 l特殊染色方法（PAS、嗜银染色、粘蛋白卡红染 色等） l免疫组织化学技术 六、真菌毒素的检测 生物学方法 薄层层析法 高效液相色谱法 间接竞争ELISA 七、药物敏感试验 常见抗真菌药物有两性霉素B、制霉菌素、曲古霉素、克 念霉素、哈霉素、酮康唑等 绝大多数深部真菌如假丝酵母菌、隐球菌、曲霉菌及双向 真菌等对两性霉素B敏感。 部分真菌如假丝酵母菌、隐球菌等对氟胞嘧啶(5-FC)、氟 康唑等药物敏感，但对5-FC极易产生耐药性，故提倡联合 用药。 初步报告 症状及显微镜直接检