白喉实验室诊断技术课件

二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 白喉实验室检测技术白喉实验室检测技术 免疫所 黄鹤 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 内容提要 一、流行病学 二、病原学 三、微生物学检查法 四、其它检测方法 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 一、流行病学 白喉（Diphtheria）是由白喉棒状杆菌 引起的急性呼吸道传染病。以咽、喉等 处黏膜充血、肿胀，并有灰白色假膜形 成等为主要临床特征，可有外毒素引起 的发热、无力等中毒症状。白喉曾严重 危害人群，尤其对儿童健康威胁极大。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 u传染源： 白喉杆菌为严格寄生于人的细菌，迄今为止人类是已 知 的唯一宿主。因此，病人和有毒菌株的带菌者为唯一 的 传染源。患者在潜伏期即有传染性，不典型和轻型者 ， 由于容易误诊，在传播白喉中的危险更大。带菌者又 可 分为恢复期带菌者和健康带菌者两种。曾受过免疫接 种 的人群也有可能得病，部分免疫的人群更常得病而且 病 情也更严重。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 u传播途径：飞沫或污染 l白喉主要通过呼吸道飞沫传播 l其次可通过被污染的手、玩具、文具、食品、 手帕等传播，污染食物有时也可能引起流行。 l创伤性感染主要通过撕裂、擦伤、溃疡、灼伤 破损的皮肤或呼吸道以外的黏膜感染。 l不良的个人卫生和公共卫生状况均有利于皮肤 白喉的传播。 l气候温暖有助于本病传播，但它不仅仅限于热 带地区，在温暖的气候时也有过大规模的暴发 流行。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 u易感性： 人群普遍易感，儿童易感性最高 u白喉抗毒素可通过胎盘传递给婴儿，但到达1 岁时几乎消失。以后随着年龄的增长，可由于 感染和免疫接种而获得免疫。一般来说，患病 后可获得较持久的免疫，但也有多次患病的情 况。 u人群的免疫水平取决于人体血清中的抗毒素水 平，主要是LgG型，患病和带菌对白喉杆菌产 生的毒素刺激，或用白类免疫均产生白喉抗毒 素，产生的抗体是相同的。一般当血清中的抗 毒素水平达到0.01IU/mL时，便具有了免疫力 。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 u临床表现 白喉临床特征为鼻、咽、喉等处黏膜充血、肿胀、并 有灰白色假膜形成，导致呼吸障碍以及外毒素引起的 中毒症状。 l细菌-上呼吸道粘膜， 生长繁殖，产生毒素, l细菌与毒素共同作用引起局部症状： 炎症，坏死，纤维蛋白渗出 假膜窒息 l毒素入血引起全身中毒症状 外周N-N炎：膈肌麻痹-呼吸困难 声带麻痹-声音嘶哑 软颌麻痹-吞咽困难 心肌-心肌炎 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 u流行特征 （1）实施计划免疫前世界各地均有白喉发生，尤其是温带地区，我 国各地均有白喉发生。白喉发病率北方高于南方，城市高于农村 。 大规模免疫后由于广泛使用DPT、白喉破伤风类毒素混合制剂（ DT）和白类，人群的免疫水平提高，白喉的发病率大幅度下降， 流行病学特征也发生了一些改变。 （2）白喉一年四季均可发生，但夏季发病较少。 （3）病死率高，在未使用抗毒素治疗前，病死率高达50%左右，使 用 抗毒素后病死率明显下降，但仍维持在5%-15%左右。 （4）白喉为儿童传染病，由于6个月以下的婴儿有母体抗体存在， 发病率较低，1-5岁发病最高。广泛推行免疫预防后，患者年龄构 成明显向大年龄推移。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 二、病原学 1、生物学性状 2、培养特性 3、生化反应 4、抵抗力 5、致病性 6、免疫性 7、防治原则 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 u白喉棒状杆菌俗称白喉杆菌，是白喉的病原菌 u棒状杆菌属是放线菌属中细胞壁含短链分枝菌 酸的菌属，细菌种类较多，除白喉棒状杆菌的 致病性最强外，还有假白喉棒状杆菌、结膜干 燥杆菌、阴道棒状杆菌、痤疮棒状杆菌等 ， 一般统称为类白喉杆菌 。这些菌分别寄生于 人鼻腔、咽喉、眼结膜、外阴和皮肤等处，一 般无致病性，多为条件致病菌 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 形态与染色 u菌体细长微弯，一端或两端膨大 呈棒状,常排列呈V、L形无荚膜 ，无芽胞，无鞭毛 u革兰氏染色阳性，美兰染色菌体 着色不均匀，用Neisser染色菌 体黄褐色，颗粒程紫黑色， Albert染色，菌体蓝绿色，颗粒 蓝黑色菌体着色不均匀，出现颗 粒状，即异染颗粒，为本菌的鉴 别特征。 1、生物学性状 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 G；菌体细长微弯，一端或两端膨大呈 棒状,排列不规则，常呈X、V、L、Y或栅状。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 2、培养特性 需氧或兼性厌氧。最适温度35-37，Ph7.2-7.8营 养要求高，在普通培养基上不生长。 常用的几种培养基如下： 吕氏培养基 血细胞琼脂培养基 亚碲酸钾血琼脂培养基 哥伦比亚血琼脂培养基 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 3、生化反应 u分解葡萄糖，麦芽糖，果糖，半乳糖 u产酸不产气 u不分解乳糖，大多数不分解蔗糖，不产 生吲哚，不消化蛋白，不液化明胶，不 分解尿素 u触酶阳性，氧化酶阴性 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 4、抵抗力 u对干燥、寒冷和日光的抵抗力较其他无芽胞 细菌强。在衣物、床单、儿童玩具等各种物 品中生存数日至数周。在干燥的假膜中能存 在3个月以上。 u对湿热的抵抗力不强，对一般消毒剂敏感， 1%石炭酸、3%来苏儿10min均可将其杀死。 u 对青霉素、红霉素及多数广谱抗生素敏感， 但对磺胺不敏感。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 5、致病性 致病物质 1白喉外毒素 (diphtherotoxin) 2. 索状因子 3. K 抗原 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 （1）白喉外毒素 (diphtherotoxin) l白喉棒状杆菌的主要致病物质是白喉外毒素，有A和B 两个亚单位 lB 亚单位-能与宿主靶细胞表面的特异受体结合,介导 A 亚单位进入靶细胞。 lA 亚单位-具有毒性,能抑制靶细胞蛋白质的合成;白 喉外毒素 A 片段进入细胞后 , 使延伸因子 2 (EF-2) 失活 , 抑制氨基酸转移至肽链,阻断宿主细胞蛋白质 的合成,从而引起组织坏死和病变。 白喉毒素具有强烈的细胞毒作用,能抑制细胞蛋白质 的合成,从而破坏细胞的正常生理功能,引起组织细胞 的变性、坏死。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 （2）索状因子 u细菌表面的一种毒性糖脂,能破坏细胞的线粒体,影响 细胞的呼吸与磷酸化。 （3）K 抗原 u细胞壁外面的一种不耐热糖蛋白 ,具有抗吞噬的作用 。 u有利于细菌在粘膜表面定植。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 主要是抗毒素免疫 6、免疫性 u病后、隐性感染及预防接种后均可获 得免疫力 u抗毒素的作用是阻止白喉毒素B链与易 感细胞结合，使A链不能进入细胞内发 挥毒性作用 u新生儿通过胎盘可由母体得到抗毒素 。出生后这种被动免疫逐渐消失，至1 周岁时几乎全部易感 u以往50%白喉患者是5岁内儿童，近年 来由于婴幼儿及学龄前儿童普遍进行 预防接种，故儿童与少年发病率有所 降低而成年人发病率有上升的趋势 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 锡克试验(Schick test) 调查人群对白喉的免疫力可用锡克试验（Schick test）进行测定。 u原理：毒素抗毒素中和反应 u方法：注射毒素（毒性、蛋白质） 试 验 加热破坏的毒素（无毒、蛋白质） 对 照 u结果：48小时观察结果， 有红肿 阳性反应 无免疫 力 无红肿 阴性反应 有免疫 力 u应用：检查机体对白喉的免疫力 预防接种前的筛选与接种后效果观察 流行病学调查 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 7、防治原则-与破伤风类似 u预防 l人工主动免疫：注射白喉类毒素（白百破三 联疫苗） 目前国内应用白喉类毒素、百日咳菌苗、破伤 风类毒素的混合制剂 (DPT 混合疫苗，又称白 百破三联疫苗) 。效果良好。婴儿3月即可接种 白百破疫苗，以后在18-24月加强注射一次，以 后在6岁时加强一针白破疫苗。锡克试验阳性的 青少年及成年人也需接种白喉类毒素 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 7、防治原则-与破伤风类似 u预防 l人工被动免疫：注射白喉抗毒素 与白喉病人密切接触的易感儿童应肌肉注射白 喉抗毒素进行紧急预防。除上述特异性预防外 ，还要注意带菌者检查及对病人的隔离治疗。 l药物预防：如注射青霉素或口服红霉素 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 u治疗 1.抗生素的应用 青霉素、红霉素,不仅能抑制白喉棒状杆菌的感染 ，也能预防恢复期带菌者的出现。 2.抗毒素 应尽早注射足量白喉抗毒素,注射前作皮肤试验，阳 性者进行脱敏治疗。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 三、微生物学检查法 （一）标本采集 （二）图片镜检 （三）分离培养 （四）生化鉴定 （五）菌种复苏 （六）菌种的冻存 （七）毒力实验 （八）有关试剂配制 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 三、微生物学检查法 白喉棒状杆菌检验程序 咽拭 标本 亚碲酸钾 血平板 观察菌落特征 直接涂片 革兰染色 异染颗粒染色 血平板 吕氏血清斜面 直接涂片 革兰染色+异染颗粒染色 生化反应涂片染色镜检 毒力试验 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 (一) 标本采集 病人 以无菌棉拭子或无菌棉拭子吸附新鲜配制的亚碲酸钾、甘油盐水保存 液从疑似患者咽喉假膜边缘蘸取标本或同时采取鼻咽拭子，放入灭菌试 管内同时送检。 带菌者或疑似病人 由于未见到明显的假膜，故应采集鼻咽部或扁桃体粘膜上的分泌物送 检。 采集标本时，要避免污染 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 (二) 涂片镜检 l用美蓝、革兰染色法或奈瑟染色法染色、镜检。镜检 如果发现革兰氏阳性菌，形态典型，并有异染颗粒， 可初步报告“检出形似白喉棒状杆菌”，结合临床做出 初步诊断 注意： 细菌染色的基本步骤为涂片干燥固定染色。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 革兰氏染色 u待测菌 u革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液 、95乙醇、石炭酸复红液等)、 u 香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接 种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管 、酒精灯。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 革兰氏染色的基本步骤 u涂片：取一张清洁无油脂的载玻片，加上一环生理盐水，用灭菌 的接种环取菌落少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜。 u干燥：一般在室温中使自然干燥。若须加速干燥，可在火焰上方 的热空气中加温干燥，但切勿紧靠火焰，以免标本烤焦，不堪检 视。 u固定：一般用加热法，即将涂片迅速通过火焰23次，以玻片反 面接触，热而不烫为度。 u初染：将结晶紫染液滴加在已固定的涂片上，染1分钟后，用水冲 洗。 u媒染：滴加碘液，1分钟后水洗。 u脱色：滴加95酒精，摇动玻片至紫色不再为酒精脱退为止（根 据涂片之厚薄约需0.51分钟），用水冲洗。 u复染：滴加复红，1分钟后水洗，待干，镜检。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 革兰氏染液 冲洗 碘液分钟 酒精脱色30秒复染1分钟100倍油镜 结晶紫1分钟 过火焰三次固定 革兰氏染色 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 关键点： 1、载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时 ，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌 过厚。 2、在染色过程中，不可使染液干涸。 3、严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性 菌被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌被误 染为阳性菌。 4、菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间很 长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反 应。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 (三) 分离培养 常用的几种培养基如下： 吕氏培养基 血细胞琼脂培养基 亚碲酸钾血琼脂培养基 哥伦比亚血琼脂培养基 涂布划线 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 吕氏血清斜面 将标本接种于吕氏血清斜面上，37培养至8 -12h，可见灰白色小菌落 为快速诊断，可在吕氏血清斜面培养基培养6 -12h后，用培养物做涂片、镜检，检出率比直 接涂片高 涂片染色镜检，本菌在此培养基上形成异染 颗粒明显，必要时用生化反应和毒力试验进一 步鉴定 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 斜面接种示意图 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 血琼脂平板 u白喉杆菌在血平板上形成灰 白色、圆形光滑菌落，有溶 血环。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 鉴别选择培养 基 亚碲酸钾血平板-黑色菌 落 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 选择培养：含0.03%0.04%亚碲酸钾的血平板 亚碲酸钾血琼脂平板上形成黑色菌落 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 根据在亚碲酸钾培养基生长情况和生化反应特点 将白喉棒状杆菌分为三型： l 重型 l 中间型 l 轻型 我国以轻型多见，但型别与疾病的严重程度无相 关性 三型均可产毒，一般重型和中间型产毒多，毒力 强，常引起麻痹症状，并可引起严重或致死白喉 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 纯培养：哥伦比亚血琼脂平板 u选取亚碲酸钾血平板上形成黑色和灰黑色的菌落。 u在挑取单个菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板上，进行 纯培养 u37培养24h，形成奶白色，边缘光滑的圆形菌落。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 u 微生物代谢与其他生物代谢有着许多相似之处 ，也有不同之处。微生物代谢重要特征之一， 就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自 然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为 人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途 径。人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用 其生理生化反应作用作为重要依据。 u利用微生物对生物大分子的分解（淀粉水解实 验水解试验、明胶液化试验），对含碳化合物 的分解利用（糖发酵试验）以及对含氮化化合 物的分解利用（吲哚试验），利用微生物形态 、结构以及生化反应的特征对某些细菌进行初 步的分类。 （四）生化鉴定 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 (四)生化鉴定 API 试剂盒：微量多项试验鉴定系统 API 20 系统：法国 Bio-梅里埃公司生产，有 20 种不同的生化反应， 可鉴定 700 多种细菌，分不同系列，如 20A厌氧菌，20E 肠道菌 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 (四)生化鉴定（梅里埃试剂盒） 1.使用无菌的拭子，收集哥仑比亚血琼脂平板上的全部 培养物，制备浊度大于6个麦氏单位的浓的菌悬液。 2.在试条的前11个测试中，试验NIT至ESC每杯加入大约 100-150ul菌悬液；对于试验URE仅充满管部；对于GEL 试验均匀充满充满管部和杯部；将剩余的菌悬液加入 一个新打开得API GP培养基，将新的菌悬液加到试条 后9个试验中，菌悬液仅充满管部，用矿物油充满试验 URE和0至GLYG的杯部，形成稍微凸起的新月形。该好 盖，在氧的条件下362孵育24小时（2小时） 。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 3.经过孵育后，加入试剂，NIT试验各加1滴NIT1和NIT2 ；PYZ试验加入1滴PYZ，PyrA、PAL、GUR、GAL、 GLU、NAG各加1滴ZYMA和ZYMB。等候10分钟，然后 根据结果判读表观察所有反应。 4.触酶试验：加1滴过氧化氢到ESC或GEL试验，等待1分 钟，出现气泡为阳性反应 5.在结果报告单上，所有试验每3个为一组，每个以1、2 和4标明。在每组中阳性反应以相应得数字相加，可以 得到一个7位数字，触酶试验的结果组成第21个反应， 如果阳性记为4。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 鉴定拭条 6麦氏单位 加水湿润环境 刮取菌落0.85%生理盐水 放入槽内滴加菌液 石蜡油封闭 盖上盖子 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 白喉杆菌 APIAPI结果判定结果判定 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 （五）菌种复苏 白喉标准菌株的复苏： （1）复苏菌种前应准备适于该菌种生长的固体、液体培 养基及培养设备，所有操作均在符合生物安全保护及 无菌条件下进行。 （2）启开菌种宜采用锯开法，用吸管将脑心浸液培养基 0.3ml左右注入被启开菌种安瓶中并吹打，是安瓶中冻 干菌种溶解成菌悬液。 （3） 将上部菌悬液全部吸出，分别接种到固体斜面， 及液体培养管中，一般放置在37培养箱中培养18-24 小时。 （4）次日观察菌种生长情况，如菌种生长应继续培养至 72小时。 （5）复苏后的菌种在传1-2代后使用。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 （六）菌种保存 脱脂牛奶： 牛奶煮沸冷却后去上层脂，反复三次，离心去上层脂 ，分装小管12ml左右，将新鲜的纯菌苔用接种环或 棉拭子刮入牛奶管靠壁研磨开并混匀20或更低可 长期保存。 刮取菌苔混于牛奶中 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 长期保存 菌种保存管：市售的商品化试剂盒 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 （七）毒力实验 它是鉴别产毒白喉棒状杆菌与其他棒状杆菌的重要试验 1.豚鼠试验： 选体重250g的豚鼠2只，其中一只于试验前12h由腹 腔注射白喉抗毒素250-500单位作为对照。然后2只豚 鼠均于皮下注射待检菌的48h培养液2ml。若于2-4d试 验动物死亡而对照动物存活，表明待检菌能产生毒素 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 u白喉抗毒素的稀释：用1ml生理盐水溶解冻干的白喉 抗毒素，稀释成1000国际单位备用。 u用白喉抗毒素(每毫升含5000-10000u)溶液将无菌滤 纸条（高压灭菌）浸湿后置37孵箱略烘干后（时间 不宜过长，以免影响结果）。将滤纸条贴于平板中央 表面，将试验菌株划线接种于平板上成一直线，使其 与抗毒素滤纸成直角相交。同一平板可同时接种4-5 个标本。同时要用已知有毒菌株作阳性对照。于37 培养48-72h，如发育良好即可观察结果。阳性者于距 纸条稍远处沿接种线开始有絮状沉淀弧出现。若干 72h仍未出现沉淀弧者可作阴性报告。 2.Elek平板检测外毒素实验 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 Eleck平板 白喉棒状杆菌毒力试验 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 Elek平板试验结果 Elek Test 沉淀线(阳性) 含白喉抗毒素滤纸片 白喉杆菌菌苔 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 3.对流电泳法 l 将已知白喉抗毒素和待检菌培养液分置琼脂板两孔 之中，电泳30min后，若两孔之间出现白色沉淀线，表 明待检菌为产毒菌株。此法比琼脂平板毒力试验敏感 10100倍，适用于大批量标本的检测。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 4.协同凝集试验 l将白喉抗毒素IgG吸附在SPA上，加入待检菌培养物， 若有白喉毒素，则它可与SPA-IgG结合出现可见的凝集 反应。此法简易快速。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 （八）有关试剂的配制： 1.亚碲酸钾血平板： 称取3g肉浸液肉汤和0.005g胱氨酸 ，在称取2g（1.5-2%）琼脂粉，加入 100ml蒸馏水，加热溶解，调pH至7.6 ，高压11515min,待冷至50左右 ，用无菌操作加入已灭菌的亚碲酸钾 溶液及羊血，混匀倾注平板。白喉杆 菌能在亚碲酸钾血平板上形成黑色和 灰黑色的菌落。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 混合倒平板操作法示意图 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 注意事项： u 配制培养基时要按比例加入一定量的水，经 溶解，调pH值，分装，高压蒸汽灭菌。 u 称量药品时严防药品混杂，一把药匙用于一 种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再 取另一种药品。瓶盖也不要盖错。 u 在烧杯融化琼脂的过程中，人要在电炉旁看 着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需 不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。注意带上棉纱 手套防止烫伤。 u 分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上 ，以免沾污棉塞而引起污染。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 2.哥伦比亚血平板： 称取39克哥伦比亚琼脂，加入蒸馏水，加热 溶解，调pH至7.6，高压12115min,待冷至 50左右，用无菌操作加入已无菌的脱纤维羊 血，混匀倾注平板。（白喉杆菌能在哥伦比亚血平板上形成奶白色 的菌落。） 3.白喉抗毒素 4.白喉标准菌株 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 5.Elek琼脂平板 由甲、乙两液混合而成。首先制备猪胃消化汤及牛肉浸液。 u.猪胃消化汤：取新鲜猪胃刨开洗净（如胃部有大块红色炎症者 不宜使用），去脂绞碎，称取420g装入烧瓶内，加入蒸馏水 1000mL，再加入浓盐酸10mL混匀。置56温箱消化24小时，每小 时搅动一次，最后6小时内不需搅动。待其静置消化后取出，煮沸 ，用滤纸过滤，装瓶，经12115min高压灭菌后，备用。 u.牛肉浸液：取新鲜牛肉，去肌腱、脂肪、绞碎。取500g加入蒸 馏水1000mL，搅匀。置冰箱中36小时，取出后煮沸20分钟，用滤 纸过滤，装瓶，经12115min高压灭菌后，备用。 u.猪胃消化肉浸液：将2份猪胃消化汤加1份肉浸液，混合后，在 每1000mL中加入20%氯化钠5mL、蛋白胨5g，混匀后煮沸，加入15% 氢氧化钠20mL，校正pH至7.8（按冷时为准）。煮沸、过滤、装瓶 ，经12115min高压灭菌后，备用。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 u甲液：取猪胃消化肉浸液200mL，加入麦芽糖3g、乳酸 0.7mL，混合后煮沸，加入15%氢氧化钠2.5mL，校正pH 至7.8（按冷时为准）。煮沸、用滤纸过滤，制成。 u乙液：取猪胃消化肉浸液800mL，加入琼脂15g、氯化 钠5g，混合后加热溶化，校正pH至7.8（按冷时为准） 。煮沸用绒布过滤，制成。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 Elek琼脂平板的制备： 将甲、乙两液混合摇匀，分装于大试管内，1mL/管 ，经11615min高压灭菌后，冷至55,加马血 清，倾注平板，备用（置冰箱保存）。 *注意： 高压的时间及温度一定要严格按照配 方 过滤也一定按照配方要求做 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 6.脑心浸液培养基（复苏白喉标准杆菌培养液） 成分：（g/L，PH7.4）蛋白胨 10.0 牛脑浸粉 12.5 葡萄糖 2.0 牛心浸粉5.0 氯化钠 5.0 磷酸氢二钠 2.5 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 四、其它检测方法 血清学实验室诊断技术 当前有很多方法可以用来进行抗原或抗体的检测，应 用最多的是酶联免疫技术。酶联免疫技术是于1966年 由日本NaKane在常用的免疫学测定方法免疫荧光及放 射免疫技术的基础上建立的。由于酶亦可像荧光素或 同位素一样作为标记物用于免疫测定，而且酶代替荧 光素或同位素作标记物可避免使用特殊装备，也不需 要防护措施，因此酶联免疫技术不断得到发展。 0 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 ELISA的原理 将特异的抗原抗体免疫学反应和酶学催化反应相结 合，以酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应。因此 ，免疫酶技术一般由两部分组成，即一次或数次免疫学反 应一次酶促反应。酶能与抗体或抗原结合形成酶标抗体( 或抗原)。酶标抗体具有酶和抗体双重活性。待检标本(含 抗体或抗原)与事先包被在固相载体表面的相应抗原或抗 体结合，形成免疫复合物。酶标抗体(或抗原)与此免疫复 合物结合，形成酶标记的免疫复合物。当加入酶的相应底 物时，由于酶的催化作用，使无色的底物水解、氧化或还 原，呈现颜色反应，可用肉眼或分光光度计观察结果。颜 色深浅与酶作用于底物所形成有色物质的量，即与待检标 本中相应抗体或抗原量成正比，从而反映出被测抗原或抗 体的量。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 ELISA所需主要材料 1酶结合物 酶结合物即酶标记的免疫反应物（抗体或抗原），是 通过适当的化学反应或免疫学反应，让抗体或抗原分子以 供价键或其它形式与酶蛋白分子相偶合，形成酶标抗原。 该结合物保留原先的免疫学活性及酶学活性，所以，既有 抗原-抗体反应的特异性，又有酶促反应的生物放大作用 。制备高质量的酶结合物，在免疫酶技术中是至关重要的 。 免疫酶技术术具有高度敏感性的关键键是选选用有生物放大 作用的酶为标记为标记 物。凡无毒性又能使相应应底物显显色的酶 均可应应用。使用的酶应应具有纯纯度高、催化反应转应转 化速率 高、有足够够的偶联联用的标记标记 基团团、化学性质稳质稳 定、纯纯化 方便、价格低廉。 最常用的酶有辣根过过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶 (AP)。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 2固相载体 能均一地吸附蛋白质或可溶性抗原，吸附后不易洗 掉，也不易与随后加入的蛋白质发生置换作用抗原和 抗体是以物理吸附的形式附着在固相载体的表面，吸附 量与载体的类型和表面性质有关。 作为固相载体的物质很多，如纤维素、聚丙烯酰胺 、聚苯乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶及琼 脂糖凝胶等。最常用的是聚苯乙烯板，因其对蛋白质的 吸附性最好。 形式可以是试管、微量反应板、小珠等。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 3.封闭 以无关蛋白占据未被包被的空隙，以免非特异性吸附 造成假阳性，这种方法称封闭。常用的封闭液为1牛血 清白蛋白或10小牛血清。 4.待测样品 稀释度要合适，过浓会发生非特异性吸附，干扰固相 包被，造成假阳性；过分稀释会影响抗原-抗体之间的免 疫学反应。选择最适稀释度的方法是将一系列稀释样品在 试验体系中反应，取吸光值合适的稀释度。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 5.洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却是决定 实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相 抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于 固相载体的干扰物质。 在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入吐温一类物 质即可达到此目的。吐温20在ELISA中最为常用，它的洗涤 效果好，可减少非特异性吸附。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 6.底物 要求在反应前是无色的，经酶作用后，产生有颜色 的产物。底物一般都是致突变的有毒物质，所以称量、 配制时应注意防护。 免疫酶技术中常用的酶-底物系统有： （1）辣根过过氧化物酶(HRP)邻苯二胺（OPD），显 示反应应为桔红色。 辣根过过氧化物酶(HRP)四甲基联联苯胺(TMB) ，显示 反应应为蓝色。 （2）碱性磷酸酶(AP)对硝基苯磷酸酯（pNPP） ，显示反应应为黄色。 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术 培 训 班 二 九 年 免 疫 规 划 管 理 技 术