质谱技术简介及其在医学检验中的应用课件

质谱技术简介及其在 医学检验中的应用 MS Technology in medical laboratory Tianjin First Center Hospital 质谱 光谱 p通常医学检验方法是基于光谱的分析。 p质谱是运用电磁学原理，对荷电分子、亚稳 分子碎片进行分离、分析，与光谱学分析完全 不同。 p随着质谱技术的发展，质谱在质检、环境、 临床检验中的应用越来越广泛。 Tianjin First Center Hospital pp 准确准确 pp 快速快速 p 高通量 p 微量 p 检测成本低 p 能够分析分子结构 质谱的特征 Tianjin First Center Hospital CONTENT目录 质谱在临床检验中的应用 质谱仪的工作原理 质谱仪的分类 Tianjin First Center Hospital CONTENT目录 质谱仪的工作原理 Tianjin First Center Hospital p 质谱仪是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量 的分子.测定分子量进行成分和结构分析. p 离子的生成方式有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或 去质子化) Tianjin First Center Hospital 计算机数据 处理系统 真空系统 加速区 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 质谱计框图 Ionisation source Detector Output Ion separation Tianjin First Center Hospital 离子源 质量过滤/分析器 检测器 进样部分 样品板 LC或GC EI源 FAB源 MALDI源 ESI源 Quadruopole Ion trap Time-of-flight 电子倍增器 闪烁计数器 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Tianjin First Center Hospital 离子源和质量分析器的真空度需保持在 104 105 Pa和105 106 Pa。 因为： 大量氧会烧坏离子源的灯丝； 用作加速离子的几千伏高压会引起放电； 引起额外的离子分子反应，改变裂解模型 ，谱图复杂化。 质谱计构造:真空系统 Tianjin First Center Hospital 在不破坏真空度的情况下，使样品进入离子 源。 气体可通过储气器进入离子源。 易挥发的液体，在进样系统内汽化后进入离子 源。 难挥发的液体或固体样品，通过探针直接插入 离子源。 进样系统 Tianjin First Center Hospital Sample Introduction: （直接进样杆） Direct Insertion Probe (DIP) Direct insertion probe Conceptually very easy, practically very tricky Tianjin First Center Hospital Sample Introduction: Gas Chromatogram-MS (GC-MS) GC output to mass spectrometer Sample already in gas phase Tianjin First Center Hospital Sample Introduction: Liquid Chromatogram-MS (LC-MS) Direct infusion of sample in solution Syringe pump: slow steady infusion Output from HPLC Separation and identification of components Vast majority of solution is solvent Must remove solvent to “see” analyte Historically: extra pumping and heating Applicable to electrospray ionisation ESI: see later Tianjin First Center Hospital 分子失去电子，生成带正电荷的分子离子 分子离子可进一步裂解，生成质量更小的碎片离子 +. M +. A + + B +C D + +. 中性分子或碎片 R . M + eM +. + 2e M-. 小于1% 50-70eV 离子源 Tianjin First Center Hospital 质量分析器是质谱计的核心 不同类型的质量分析器构成不同类型的质谱计 不同类型的质谱计其功能，应用范围，原理， 实验方法均有所不同。 质量分析器 Tianjin First Center Hospital 检测记录系统 质量分析器分离并加以聚焦的离子束， 按m/z的大小依次通过狭缝，到达收集器。 经接收放大后被记录。 Tianjin First Center Hospital 电子轰击电离 Electron Impact Ionization, EI 化学离子化 Chemical Ionization, CI 场电离，场解吸 Field Ionization FD, Field Desorption FD 快原子轰击 Fast Atom Bombardment, FAB 基质辅助激光解析电离 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI 电喷雾电离 Electrospray Ionization, ESI 大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI 离子化的方法 Tianjin First Center Hospital + + + + : R1 : R2 : R3 : R4 : e + M+ (M-R2)+ (M-R3)+ Mass Spectrometer (M-R1)+ 电子轰击电离 Electron Impact （EI） Tianjin First Center Hospital 电子轰击电离又称为电子轰击，或电子电离。是应用最 普遍，发展最成熟的电离方法。 轰击电压 50-70eV, 有机分子的电离电位一般为7-15eV。 可提供丰富的结构信息。 灵敏度高，能检测纳克(ng)级样品； 有些化合物的分子离子不出现或很弱 电子轰击电离 EI Tianjin First Center Hospital 基质辅助激光解吸电离(MALDI) 基本原理：基本原理： 将样品分散在基质分子中并形成共结晶后直接进样将样品分散在基质分子中并形成共结晶后直接进样, , 当用激光当用激光(337 nm(337 nm的氮激的氮激 光或光或355 nm355 nm的固体激光器的固体激光器) )照射晶体时照射晶体时, , 基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子 和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。因此基质在样品离子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。因此基质在样品离子 形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品分子带上正电荷或负电荷，成形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品分子带上正电荷或负电荷，成 为带电荷的离子。为带电荷的离子。 离子源特点离子源特点: : 1 1、使用脉冲式激光；、使用脉冲式激光； 2 2、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量 数有一一对应关系；数有一一对应关系； 3 3、离子化效率高，灵敏度高、离子化效率高，灵敏度高 ( (fmolfmolamolamol) ) 常用基质： 芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)（SA)、龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)(DHB) 、-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、吡啶甲酸(PA)、3-羟基吡啶甲酸(3HPA)。 Tianjin First Center Hospital MALDI技术中基质的作用 l 把样品分子彼此分开(基质：样品=10，000：1)，削弱 样品分子之间的相互作用。 l基质吸收激光的能量，并将部分能量传递给样品。 l帮助样品离子化。 Tianjin First Center Hospital C: MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization MALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题， 离子化过程与FBI有相似之处。 1、使用基质，但基质为固体。 2、 MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结 晶。 对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量 由基质传给样品使样品一起气化并离子化。 Tianjin First Center Hospital Tianjin First Center Hospital Tianjin First Center Hospital 常用基质 1、氰基4羟基肉桂酸 CCA 多肽 2、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸 SA 蛋白 3、龙胆酸（2,5二羟基苯甲酸 DHB 聚合物 4、吡啶甲酸 PA 5、3羟基吡啶甲酸 3HPA MALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多 为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可 分析 Tianjin First Center Hospital 常用基质结构 DHB SA CCA Tianjin First Center Hospital MALDI的优缺点 优点 1、质量数可达300,000Da。 2、attomole 至femtomole级灵 敏度。 3、软电离方式，无或极少碎片 离子。 4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔 浓度）。 5、适于分析复杂混合物。 缺点 1、分辨率低。 2、1000Da以下基质峰干扰。 3、激光解吸附离子化有可能使样 品光降解。 4、串联质谱功能较弱，除非接反 射装置进行源后衰变测量。 5、不能分析非共价键相互作用。 6、定量时需要内校准。 7、如没有反射飞行装置，不能分 析多肽修饰。 8、对各种赋形剂的容忍度低（如 含磷酸缓冲液，大于150mM的盐 等。 Tianjin First Center Hospital D: ESI离子源 Electrospray Ionization 4000v强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带 电液滴被静电场吸向质谱人口，同时伴随干燥或加 热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变 小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥 力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更 小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴 非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大 ，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。 一般分析物分子量 2000Da带多电荷 Tianjin First Center Hospital Tianjin First Center Hospital NANO-ESI喷雾照片 Tianjin First Center Hospital ESI特点 1、 ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带 10个以上电荷，使得m/z大大减小，弥补了四极杆质 量分析器等质量范围窄的缺点。 2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷 比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。 Tianjin First Center Hospital ESI优缺点 优点 1、质量数可达70，000Da 2、灵敏度高达femtomole级。 3、软电离，可观察生物分子非共价反 应。 4、易于和LC串联，直接分析流速为 1ml/min的LC洗脱液。 5、没有基质干扰。 6、适于联四极杆质量分析器、离子阱 质量分析器做结构分析。 7、带多电荷，允许质量范围窄的设备 检测高质量数的离子。 8、带多电荷，通过计算平均值给出更 精确的质量数。 9、特别适于测多肽的修饰。 10、样品前处理简单可直接分析RP- HPLC脱盐处理的溶液。 缺点 1、耐盐能力低。 2、对某些化合物特别敏感，污染难 清洗。 3、样品需先气化，混合物不适用。 4、带多电荷，在分析混合物时，产 生混乱。 5、定量时需内校准。 Tianjin First Center Hospital 质谱计质量分析器的主要技术指标 1、质量范围： 指质谱计所检测的单电荷离子的质核比范围 2、分辨率（R）：分辨率是质谱计分开相邻两离子质量的能力。 分辨率（ R ）是两峰间的峰谷为峰高的10%时的测定值，即两峰各以5% 的高度重叠。 R = m /m m为质谱计可分辨的相邻两峰的质量差 m为可分辨的相邻两峰的平均质量 3、灵敏度： 质量分析器（过滤器） Tianjin First Center Hospital 例:有质量数为200和201的两峰，使之正好分开（满足 10%谷的要求），需要仪器的分辨率达到： R= m /m =200/（201-200）=200 若要分开1000和1001两个离子，所需仪器的分辨率应该为 R= m /m =1000/（1001-1000）=1000 可见分离质量数 愈大的离子所需的分辨 率愈高。 Tianjin First Center Hospital 不同分辨率谱图效果 Tianjin First Center Hospital 3、灵敏度：仪器对样品在量的方面的检测能 力。 绝对灵敏度：在记录仪上得到可检测的质谱信号所需的样品量 (g)； 相对灵敏度：可检测到的微量杂质的最小浓度(如gml-1)。； Tianjin First Center Hospital CONTENT目录 质谱仪的分类 Tianjin First Center Hospital 根据质量分析器的工作原理，常见的质谱仪可以分为： p磁偏转 p飞行时间 p四极杆 p离子阱 p傅立叶变换 p串联质谱仪：时间串联、空间串联 Tianjin First Center Hospital E=Uz=1/2mv2 和 t=L/V E：离子在加速电场获得的动能; U：加速电场电压 z：离子所带电荷; m：离子质量 v：离子飞行速度; L：飞行管道长度 t：离子飞行时间; c：常数 质量分析范围：500Da-100KDa MALDI-TOF质谱的原理 t = c m/z Tianjin First Center Hospital Pulsed laser 3. 多肽离子在TOF管里飞行，飞行速度 取决于多肽离子的M/Z的大小 Flight tube 1：基质与多肽样本共同 置于刚靶上。 High vacuum Tim e High voltage 2. 样本被激光电离形成多肽 离子混合物 。 20 - 25 kV 5. 检测到每个离子的M/Z后，同一张图谱上计算机输 出每个肽段M/Z，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论 数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白。 4. 到达检测器的离 子，通过检测器检 测出每个肽段离子 的M/Z. 1.3 MALDI-TOF-MS质谱的分析步骤 Tianjin First Center Hospital Laser MALDI-TOF-MS 线性模式检测 Sample plate Analyte molecules in matrix Acceleration grids Drift tube Ion detector Mass spectrum Vacuum system Vacuum lock 几秒钟即可得到 结果 Tianjin First Center Hospital 应用MALDI-TOF-MS技术 鉴定和分类微生物 Tianjin First Center Hospital 一个单四极杆质谱仪 Tianjin First Center Hospital 四极杆质量过滤器 合成电压在两个对杆上数量是相同的，极性 是相反的。 Tianjin First Center Hospital 四极杆质量过滤器如何工作的？ Tianjin First Center Hospital 空间串联多级质谱：QQQ 必须通过连续放置多个分析器来实 现空间串联的多级质 谱分析。 对于QQQ，每个分析器有以下单独的作用： 第一个四极杆(Q1)根据设定的质荷比范围扫描和选择所需的离 子。 第二个四极杆(Q2) ，也称碰撞池，用于聚集和传送离子。在所选 择离子的飞行途中，引入碰撞气体，例如氮气等。 第三个四极杆(Q3)用于分析在碰撞池中产生的碎片离子。 Tianjin First Center Hospital QQQ多级质谱：多反应监测 lQ1选择某一质量的母离子，碰撞单元产生碎片离子。 Q3用于搜寻多个选择反应监测，这就是多重反应监测（ MRM）。 Tianjin First Center Hospital 三重四极杆: SRM 或MRM Tianjin First Center Hospital CONTENT目录 质谱在医学检验中的应用 Tianjin First Center Hospital 1 2 3 4 新生儿遗传代谢性疾病筛查 氨基酸检测 治疗药物浓度监测 其他，如维生素D、叶酸、 应用范围 Tianjin First Center Hospital 1 新生儿遗传代谢性疾病筛查 自1902年英国Garrod教授发现尿黑酸尿症以来，先天性代谢性疾病逐渐 被认知。 1909年，Garrod提出遗传代谢性疾病(inherited metabolic diseases，IMD)的概念，至今已发现逾1 000种各类IMD，总体发病率高达 1：800。 许多IMD可以通过饮食干预、相应代谢物替代治疗、去除毒性代谢产物 等手段进行疾病的预防干预和治疗。从新生儿开始对IMD进行及时、正确 的干预治疗可以有效阻断疾病进展造成永久性损伤，防止发育畸形、智力障 碍、甚至死亡的发生。 Tianjin First Center Hospital 常见IMD的分类 1）氨基酸代谢异常苯丙酮尿症、枫糖尿病、高甲硫氨酸血症等。 2）有机酸代谢异常 3）脂肪酸代谢异常 4）其他 甲基丙二酸血症、丙酸血症等。 肉碱转运障碍、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症等 尿酸循环障碍、线粒体病等 Tianjin First Center Hospital 苯丙酮尿症 病因 苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一，2/3苯丙氨酸则过肝细胞中苯丙 氨酸羟化酶（PAH）的转化为酪氨酸，以合成甲状腺素、肾上腺素和 黑色素等。基因突变有可能造成相关酶的活性缺陷，致使苯丙氨酸发 生异常累积。 Tianjin First Center Hospital Tianjin First Center Hospital 临床表现 1.生长发育迟缓 除躯体生长发育迟缓外，主要表现在智力发育迟缓。表现在智商低于同龄正 常儿，语言发育障碍尤为明显，这些表现提示大脑发育障碍。 2.神经精神表现 由于有脑萎缩而有小脑畸形，反复发作的抽搐，但随年龄增大而减轻。肌张 力增高，反射亢进。常有兴奋不安、多动和异常行为。 3.皮肤毛发表现 皮肤常干燥，易有湿疹和皮肤划痕症。由于酪氨酸酶受抑，使黑色素合成减 少，故患儿毛发色淡而呈棕色。 4.其他 由于苯丙氨酸羟化酶缺乏，苯丙氨酸从另一通路产生苯乳酸和苯乙酸增多， 从汗液和尿中排出而有霉臭味（或鼠气味）。 Tianjin First Center Hospital 病因学： n 此症为一先天性氨基酸代谢异常疾病，因基因突 变造成将甲硫氨酸(methionine)转化成S-腺甘甲 硫酸氨(S-adenosylmethionine；简称AdoMet)所 需的酵素功能缺乏，此酵素称为methionine adenosyltransferase，MAT，会导致血液中的甲 硫氨酸堆积并升高。 n 此种甲硫氨酸升高并非因为高胱胺酸尿症 (homocystinuria)、第一型酪氨酸血症 (tyrosinemia)及肝脏疾病引起的，却仍然持续出 现高甲硫氨酸现象的病症，所以被定义为高甲硫 氨酸血症，又称为MAT缺乏症。 n 甲硫氨酸参考值(mol/L):7-55 Tianjin First Center Hospital 临床上表征： n大部分的患者的MAT酶还有些许残余的功 能，酶活性只是部分不活化，所以多属于 良性，一般而言没有明显之症状。 n但也有文献报告少部分的患者被发现有肌 张力低下 、心智迟缓及迟发性的神经脱髓 鞘(delayed demyelization)等神经学的症状 ，则是因为属于MAT完全缺乏者。 Tianjin First Center Hospital Tianjin First Center Hospital 酪氨酸血症Tyrosinemia Tianjin First Center Hospital Tianjin First Center Hospital n 血液中升高的酪氨酸水平可源于三种酪氨酸代谢遗传疾病。 n 酪氨酸血症I 型于1957 年被报道，由于缺乏延胡索酰乙酰乙酸水解 酶（FAH）所致。患者以加拿大魁北克省法裔或斯堪的纳维亚人占 绝大多数，其他族裔也有病例发现。 n 本病发病率约为 1 /100000 n 加拿大魁北克法裔人群发病率很高,可达 1 /2000 n 酪氨酸血症II 型， 也称为眼皮肤酪暗锁血症，特症为影响角膜和 皮肤，由于缺乏作用于酪氨酸分解的第一步的酪氨酸转氨酶所 致。酪氨酸血症II 型于1973 年被报道，患者绝大多数是意大利人 ，其他族裔也有病例发现。 n 酪氨酸血症III 型是一种罕见的代谢病，由于缺乏4羟基苯丙酮酸 二氧化酶（4HPPD）所致，仅有少数病例被报道。除了这三种遗传 疾病，暂时性酪氨酸血症是新生儿筛查时酪氨酸浓度升高的主要 原因。 Tianjin First Center Hospital 2 氨基酸检测 Tianjin First Center Hospital 目标化合物 中文名称Level1 对照 （平均浓度 mol/L） %CVLevel1 对照 （平均浓度 mol/L） %CV Alanine 丙胺酸362.25.75633.74.10 Alanine (by MRM) 丙胺酸340.45.26606.63.32 Arginine 精氨酸18.71.8093.65.24 Aspartic acid 天冬氨酸142.07.80265.34.82 Citrulline 瓜氨酸58.06.12218.23.87 Glutamic acid 谷氨酸432.56.07798.64.39 Glycine 氨基乙酸391.15.401125.83.16 Leucine 亮氨酸224.47.204584.29 Methionine 甲硫氨酸53.76.68195.64.25 Methionine (by MRM) 甲硫氨酸53.95.71200.53.42 Ornithine 鸟氨酸212.55.98602.74.41 Phenylalanine 苯基丙氨酸123.94.97482.14.10 Tyrosine 酪氨酸159.06.89438.94.64 Valine 缬氨酸236.65.89427.85.03 Carnitine 肉毒碱65.610.1128.79.87 C2-Carnitine C2-肉毒碱47.65.4687.95.45 C3-Carnitine C3-肉毒碱7.5710.6115.078.13 C4-Carnitine C4-肉毒碱1.2811.844.158.44 C5-Carnitine C5-肉毒碱0.6813.122.3810.92 C5-DC-Carnitine C5-DC-肉毒碱0.3212.552.4913.27 C6-Carnitine C6-肉毒碱0.5412.732.088.72 C8-Carnitine C8-肉毒碱0.6315.532.146.86 C10-Carnitine C10-肉毒碱0.668.752.056.29 C12-Carnitine C12-肉毒碱0.7111.712.238.41 C14-Carnitine C14-肉毒碱0.5919.462.088.40 C16-Carnitine C16-肉毒碱4.7410.0511.46.70 C18-Carnitine C18-肉毒碱2.549.587.38.37 Tianjin First Center Hospital Tianjin First Center Hospital 临床意义：游离氨基酸是一类非常重要的体内标志物。除了作为新生 儿代谢疾病的标志物之外，氨基酸还跟众多的临床疾病有直接的关 联。比如，肾病患者，其血液游离氨基酸增加，慢性肾炎和尿毒症患 者Val/Gay、Try/Phe比例降低，慢性肾炎患者尿液中游离氨基酸升高。 而兴奋性氨基酸谷氨酸，谷氨酰胺（Glu，Gln)天冬氨酸（Asp）；抑 制性氨基酸:甘氨酸（Gly）7-氨基丁酸（GABA）牛磺酸（Tau）这些氨 基酸的含量变化跟很多神经系统疾病息息相关。 Tianjin First Center Hospital 3治疗药物浓度监测 需要进行监测的药效学和药动学原因 1.安全范围窄，治疗指数低 一些药物治疗浓度和最小中毒浓度接近甚至重叠，极易中 毒，只有通过TDM调整剂量，才能既保证疗效又不致产生毒性； 2.以控制疾病发作或复发为目的的用药 此类用药多需数月或数年的长期用药，如果不 进行TDM，临床只能根据病症是否出现或复发、毒性反应是否发生为调整剂量的依据 。而一旦发生上述情况再调整剂量，将导致不必要的经济损失或延误病情，甚至不可 逆的后果； 3.不同治疗目的需不同的血药浓度； 4.药物过量中毒； 5.药物治疗无效原因查找； 6.已知治疗浓度范围内存在消除动力学方式转换的药物； 7.首过消除强及生物利用度差异大的药物； Tianjin First Center Hospital TDM的临床应用和意义 1.监督临床用药，制定合理的给药方案，确定最佳治疗剂量，保证 个体化给药，提高疗效和减少不良反应。 2.研究与确定常用剂量情况下，不产生疗效或出现意外毒性反应的 原因。 3.确定患者是否按照医嘱服药。 Tianjin First Center Hospital 分 类 临床使用的代表药物 强心甙