过氧化氢酶活性测定.doc

实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。 一、原理 过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据h2o2的消耗量或o2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的h2o2的量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：小麦叶片 （二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。 （三）试剂：1. 10%h2so4；2. 0.2 mol/l ph7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/l 高锰酸钾标准液称：取kmno4（ar）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/l 草酸溶液标定；4. 0.1mol/l h2o2市售30%h2o2大约等于17.6mol/l，取30%h2o2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/l kmno4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/l 草酸：称取优级纯h2c2o4.2h2o 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。 三、实验步骤 （一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入ph7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 （二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/l h2o2，同时计时，于30恒温水浴中保温10min，立即加入10%h2so42.5ml。 用0.1mol/l kmno4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。 四、结果计算 酶活性用每g鲜重样品1min内分解h2o2的mg数表示： 过氧化氢酶活性（h2o2mg/g/min）（ab）vt/(wvs1.7t) 式中：a对照kmno4滴定ml数；b酶反应后kmno4滴定ml数；vt提取酶液总量（ml）； vs反应时所用酶液量（ml）；w样品鲜重（g）；t反应时间（min）； 1.71ml0.1mol/l kmno4相当于1.7mgh2o2。过氧化氢酶的活性测定 在植物体中， 黄素氧化酶类的代谢产物常包含h2o2，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、醛氧化酶等。h2o2的积累可导致破坏性的氧化作用，而过氧化物酶和过氧化氢酶则可以清除h2o2， 是植物体内重要的活性氧清除系统之一。其活性还与植物的抗逆性有密切关系，本实验利用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。 一、原理：过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，h2o2则既是氧化剂，又是还原剂。 r(fe+2)h2o2=r(fe+3oh-)2 r(fe+3oh-)2h2o2=r(fe+2)22h2oo2 合并上式：2h2o2=2h2oo2 据此，可根据h2o2的消耗量或o2的生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量） 的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。 5h2o22kmno44h2so45o22khso48h2o2mnso4 即可求出消耗的h2o2量。 二、仪器和用具：研钵、三角瓶50cm34、铁架、酸式滴定管、恒温水浴、容量瓶 三、试剂： 10h2so4；0.2mol/l磷酸缓冲液ph7.8； 0.1mol/l高锰酸钾标准液： 3.1605gkmno4 (ar) 用新煮沸的蒸馏水配制成1000ml， 用0.1mol/l的草酸溶液标定； 0.1mol/l h2o2： 市售30h2o2大约等于17.6mol/l， 取30h2o2溶液5.68ml稀释至1000ml，用标准0.1mol/l kmno4溶液（在酸性条件下）进行标定。 四、方法： 1. 酶液提取： 取小麦叶片2.5g加入ph7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转移至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000rpm离心，上清液即为过氧化氢酶粗提液。 2. 取50ml三角瓶4个 （两个测定两个对照） ， 测定加入酶液2.5ml， 对照为煮死酶液2.5ml； 再加入2.5ml 0.1mol/l h2o2，同时计时间，于30恒温水浴中保温10分钟，立即加入10h2so4 2.5ml。 3. 用0.1mol/l kmno4标准溶液滴定h2o2，至出现粉红色（在30分钟内不消失）为终点。 4. 结果计算： 酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解h2o2的毫克数表示： (a-b)*vt/v1*1.7 酶活（酶分解的h2o2 mg/g鲜重）- w 式中： -对照用kmno4 ml数 -酶反应后kmno4滴定ml数 t-酶液总量ml 1-反应所用酶液量ml -样品鲜重(g) 1.7-1ml 0.1mol/l kmno4相当于1.7mg h2o2 注意所用kmno4溶液及h2o2溶液使用前要经过标定，0.1mol/l h2o2要新配制。实验 48 过氧化物酶活性的测定（比色法） 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 一、原理 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 马铃薯块茎。 （二）试剂 1 100 mmol l 磷酸缓冲液 ph6.0 （见附录）。 2 反应混合液： 100 mmol l 磷酸缓冲液（ ph6.0 ） 50 ml 于烧杯中，加入愈创木酚 28 l ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 l ，混合均匀，保存于冰箱中。 （三）仪器设备 分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 ml 容量瓶，吸管， 离心机。 三、实验步骤 1 称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r min 离心 15 min ，上清液转入 100 ml 容量瓶中，残渣再用 5 ml 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。 2 取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液 3 ml 和磷酸缓冲液 1ml ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 ml 和上述酶液 1ml （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。 四、结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 a 470 /min g （鲜重） 表示之。也可以用每 min 内 a 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。 过氧化物酶活性 u/ （ g min ） = 式中： a 470 反应时间内吸光度的变化。 w 植物鲜重， g 。 v t 提取酶液总体积， ml 。 v s 测定时取用酶液体积 , ml 。 t 反应时间， min 。 蒲圻贝母fritillaria puqiensis g.d.yu et g.y.chen是贝母属中一新种，其有效成分生物碱含量较高，止咳效果显著1，2。其中的蒲贝酮碱的效果与可待因相似，且无成瘾性，已被国家新药办立项进行一类新药开发。但由于蒲圻贝母以野生为主，连年的采挖已使其资源逐渐枯竭，难以为新药开发提供资源保证，为此我们对其进行了组织培养。蒲圻贝母鳞茎切块培养22d左右，可直接从切片边缘长出多个小鳞茎，以后小鳞茎逐渐长大。为了探讨鳞茎发生的机理，并为研究提高组培贝母鳞茎的生长率，诱发多鳞茎形成的方法，我们在培养的不同时期取材，对鳞茎形成过程中的可溶性蛋白，过氧化物酶及酯酶同工酶的酶谱变化进行了分析。1材料和方法1.1材料蒲圻贝母f.puqiensis取自湖北省蒲圻市，经中国药科大学生药教研室李萍博士鉴定。新鲜的蒲圻贝母鳞茎在流水下冲洗3h，0.1%氯化汞表面消毒20min，无菌水冲洗5次，切成0.5cm0.5cm0.2cm的小块接种于ms附加ba 2mg/l-1，iaa 1mg/l-1的培养基上，在25黑暗条件下培养，获得无菌材料。分别在培养的不同时间取材，并以未进行培养的新鲜贝母鳞茎为对照，进行可溶性蛋白，过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱分析。1.2方法1.2.1试剂的配制与凝胶的制备：参考文献3的方法。分离胶浓度为7.5%，间隔胶浓度为2.5%。1.2.2样品制备：称取新鲜的贝母鳞茎1g，在低温冰箱内放置1h后，加少许石英砂，加3ml提取缓冲液(0.1mol/l ph 8.0的tris-hcl缓冲液，其中含0.5mol/l蔗糖，0.06mol/l抗坏血酸，0.006mol/l半胱氨酸)，在低温下研磨后离心 20min，5000r/min，取上清液置-20下保存。1.2.3电泳：采用垂直板式聚丙烯酰胺凝胶电泳，加入溴酚蓝作为指示染料。稳定电流强度为1224ma。可溶性蛋白的点样量为50l，用含0.05%考马斯亮蓝的12.5%三氯乙酸溶液染色4h。过氧化物同工酶的点样量为30l，用抗坏血酸-联苯胺染液染色，其组成为抗坏血酸70.4mg，联苯胺储存液20ml(2g联苯胺溶于18ml文火加热的冰醋酸中，再加水72ml)，0.6%过氧化氢20ml，水60ml。酯酶同工酶的点样量为50l，按薛应龙4方法，即凝胶在0.2mol/l，t