《等位酶标记》word版.doc

等位酶标记等位酶标记及其在交配系统研究中的应用植物的存活、生育力、基因流等方面的变异经常导致种群内和种群间等位基因频率发生改变。同时，要理解对特定生态环境的适应过程就必须对植物的交配系统、传粉机制、基因流等进行深入的研究。对这些问题的研究往往需要利用一些不影响生物表型性状的遗传标记。等位酶标记在研究种群机制方面做出了很大的贡献。最近20多年来，各种各样的DNA分子标记技术的迅速发展更是为植物进化生态学中诸多问题的研究提供了技术平台，在确定个体繁殖成效、测定自交率和基因流、度量遗传分化程度等方面得到了广泛的应用。交配系统和基因流研究是植物进化生态学研究的两个重要课题。植物的交配系统不仅决定了种群未来世代的基因型频率，对植物种群的有效大小、基因流和进化等因素也有重要的影响（葛颂 1998）。通过对基因流的研究，我们就可能对种群分化等种群遗传学内容和植物的繁殖过程进行深入的研究。近来，通过分子标记，估计种群自交率、确定种群内的交配格局、借助亲本分析的方法直接测量基因流、或者借助种群遗传学模型间接推导基因流以及进行克隆鉴定等方面的工作正在逐渐增多。面对各种各样的分子标记，如何针对特定的问题选择恰当的分子标记，是亟待解决的问题。这就需要我们弄清各种分子标记的基本原理、实验流程是否繁杂、有无成熟的数据处理方法、各种分子标记的优缺点以及它们的适用范围。选择好了分子标记之后，还必须确定如何根据分子标记获得的数据解决具体的问题，如交配系统和基因流的研究。首先要确定解决某一特定问题需要测量的参数及其依附的理论模型，有时甚至包括模型假设，然后根据各种分子标记在这方面的优缺点进行取舍，最终找到既能解决问题又最有效的分子标记。等位酶标记遗传标记作为检测个体间遗传差异的方法在进化生态学中有着非常重要的作用。早期的植物种群生物学研究一般都采用形态上的多态性状来检测个体间遗传差异。这些形态标记在早期的一些研究中（Epling & Dobzhansky 1942, Faberge 1943）起到了积极的作用，但是基于表型变异的形态标记通常只受一个位点控制，许多表型性状（如花色等）必须在生活史后期才能度量，而且对大多数植物而言都很难找到合适的形态变异，所以，形态标记有很明显的局限性（Cruzan 1998）。随着电泳技术的发展，在蛋白质和DNA多态性的基础上相继发展了蛋白质标记（如，等位酶）和DNA分子标记（如，RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SNPs等）。等位酶（allozyme）是指同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式（Prakash et al. 1969）。同源染色体上不同的等位基因实际上是一段不同核苷酸序列的DNA链，经过转录和翻译过程，最后将编码具有不同构象和大小的蛋白质亚基，在电场中，不同的蛋白质亚基由于带电量和半径不同其迁移率也不同，表现在酶谱上，将有不同的迁移距离，从而分辨出不同类型的亚基。反过来，根据酶谱上分离出来的各个亚基的不同表现（迁移距离相等或者不等），就可以确定该个体在该位点上是纯合体还是杂合体（图1）。等位酶标记第一次用比较简单而直观的方法识别出了大量的基因位点和每个位点的等位基因，能够定量地考察遗传变异。等位酶标记是一个共显性标记（codominance, 即能够区分杂合子Aa和显性纯合子AA），从酶谱上可以直接确定编码该等位酶的等位基因，而且等位酶的遗传和表达都遵循孟德尔定律。等位酶分析的成本相对较低，方法也比较简单。等位酶分析方法有着较广的应用范围。等位酶作为一种稳定的基因组标记，它所揭示的酶蛋白质的多态性可以看作是对整个基因组的随机取样，从而对种群的遗传学结构做出估计，测量种群的遗传多样性以及各种群间的遗传距离。进行等位酶分析首先要把各种有功能的可溶性酶蛋白质从植物细胞中提取出来，并保证这些酶提取出来以后活性基本不变。通常使用的提取缓冲液（extracting buffer）有简单磷酸提取缓冲液、复杂磷酸提取缓冲液、Tris - 马来酸提取缓冲液和Tris - HCl提取缓冲液四种。多数食用植物和花粉可以用简单缓冲液提取，而大多数野生植物由于含有较多的酚类等有害于酶蛋白质的物质，一般需要用复杂的提取缓冲液。所以，等位酶分析的第一步就是针对具体的实验材料确定合适的提取缓冲液（详见王中仁 1996）。然后进行电泳分离。现在经常使用的有水平切片淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维素膜电泳等等，这一过程相对简单，要注意的是在整个过程中要防止酶失去活性。电泳结束后应立即进行染色。等位酶染色分为胶染和液染两种，到底采用哪一种染色方法，主要取决于各自实验室的条件、染色效果以及染色的成本等等。许多研究都提供了各种不同酶系统染色的详细配方(Soltis et al. 1983, Werth 1985, Pasteur et al. 1988, Wendel & Weeden 1989, Werth 1990)。含有各种酶蛋白的组织匀浆样品经过凝胶电泳以后，由于不同酶蛋白的净电荷以及分子大小和形状不同而迁移速率不同，各种酶蛋白分散在电泳跑道上。但此时这些酶是看不见的。专性组织化学染色是其成为可见酶谱的一个重要环节。通常，一种染色混合液只提供适合于特定酶的特殊反应底物，使得这种酶催化有关联的特殊反应，产生可见的染料。化学探测染色、电子传递染料染色、酶连锁染色是三种常见的染色方法。在化学探测染色反应中，凝胶上的酶蛋白与染液中的底物反应，反应产物再和重氮盐（如固蓝RR盐、固蓝BB盐等）及其它化合物反应产生不溶性的染料而沉淀。最常见的染色方法是电子传递染料染色法中的MTT（噻唑蓝）染色法。这种反应把辅酶（NAD）或辅酶（NADP）和吩嗪甲硫酸（PMS）耦联使用。当脱氢酶催化反应时，辅酶或辅酶变成了还原型辅酶（NADH）或还原型辅酶（NADPH），通过PMS的传递还原作用，还原型辅酶或还原型辅酶再变回辅酶或辅酶，同时四唑盐（MTT或NBT）则变成了蓝紫色的、不溶性的染料formazan。该染料的位置就是脱氢酶在凝胶上的位置。相对较为困难的是酶谱的判读。对酶谱上呈现的带谱进行解释需要深入理解每一种等位基因变异的遗传学基础(Richardson et al. 1986, Wendel & Weeden 1989)。下面以自然界中最常见的二倍体生物为例，说明具有不同蛋白质亚基数目的等位酶的酶型（zymotype）。1 单体酶（monomeric enzyme）单体酶仅由一个蛋白质亚基组成。如果个体在编码某一单体酶的一个特定位点是基因型为a1a1的纯合子，由于该位点两个等位基因完全相同，经过转录、翻译，各自编码出的多肽链也完全相同，都是A1，在酶谱上表现为一条带。如果某个体在该位点是基因型为a1a2的杂合子，这两个不同的等位基因将编码出A1和A2两种不同的多肽链，而且这两种不同的多肽链都能单独形成有活性的酶，即都能被染色。这两条多肽链由于大小、构象、带电量等方面的差异，在电场中具有不同的迁移率，从而在酶谱上表现出两条带（图2）。与该位点的a1a1纯合子相比，由于杂合子只有一个等位基因a1编码多肽链A1，所以杂合基因型个体编码的多肽链A1的浓度是纯合子编码的A1的浓度的一半。在酶初始浓度相同的条件下，酶谱中杂合子a1a2在多肽链A1位置，带的浓度只是纯合子a1a1的一半。2 二聚体酶（dimeric enzyme）二聚体酶由两个蛋白质亚基组成。对于一个二倍体植物个体，一个二聚体酶的指定位点如果是基因型为a1a1的纯合子，其两个完全相同的等位基因编码出来的多态链也完全相同，都是A1，任意两条多肽链形成的二聚体酶都是A1A1，在酶谱上表现为一条带。如果某个体在该位点是基因型为a1a2的杂合子，等位基因a1产生多肽链A1，等位基因a2产生多肽链A2，在形成二聚体酶时，这两种不同的多肽链可以自由组合，形成A1A1、A1A2、A2A2三种不同的二聚体酶型，在酶谱上表现为三条带。而且，这三种酶型的浓度比遵从自由组合规律，即1 A1A1、2 A1A2、1 A2A2（图3）。由三个及三个以上亚基组成的等位酶、或者有两个以上等位基因的等位酶、多倍体生物的等位酶、以及有哑等位基因（null allele）或重复位点存在的等位酶的酶型相对比较复杂，在此不作讲述，有兴趣的同学可参阅王中仁（1996）。酶谱正确判译后，我们就可以得到各种群、各位点的等位基因频率和基因型频率，这就是遗传多样性（genetic diversity）、交配系统等分析的最基本数据。现在有很多软件用来分析等位酶数据，如BIOSYS系列软件、Popgene、TFPGA、MLT等。分子标记与交配系统交配系统是生物有机体通过有性繁殖将基因从一代传递到下一代的模式，包括控制配子结合以形成合子的所有属性（Barrett & Eckert 1990），简单地说，就是指谁与谁交配以及它们的交配方式与频率（见张大勇、姜新华 2001）。母本的自交率和父本的繁殖成功率是植物交配系统研究中最重要的两个参数。植物的交配受传粉者的行为（或风、水等非生物传粉媒介）以及影响传粉后生殖成功的一些过程的控制。遗传标记使我们得以洞悉植物种群中出现的各种交配模式。一、分子标记与自交率的测量植物交配系统研究的一个重要方面就是度量自交和异交的相对频率，即自交率（Schemske & Lande 1985, Barrett & Eckert 1990, Brown 1990）以及其它一些与之相关的参数，如异型花柱物种的型间交配（Barrett et al. 1987, Kohn & Barrett 1992）、近交衰退（Ritland 1984, Brown 1990）等。根据不同生长时期（种子、幼苗、成体）后代的基因型可以估测自交率。尽管现在有些研究仍然根据一些特定的、具有遗传基础的表型特征（如植物的缺绿表型）作为标记进行自交率的估测（Klekowski 1992, Chen & McDonald 1996），但自20世纪70年代初开始将分子标记用于植物交配分析以来，已经对近300种植物种群的交配系统进行了研究。要想准确地掌握植物交配系统的信息，最终需要对交配系统参数进行直接测定。迄今为止，已经有许多遗传标记被用于交配系统参数的估计，如最先应用的形态标记（Vasek 1964, HumpHreys & Gale 1974, Motten & Antonovics 1992）和等位酶标记（Ritland & Ganders 1985, Schemske & Lande 1985, Barrett & Eckert 1990, Brown 1990）。毫无疑问，等位酶标记作为一种能提供一定遗传多态性的共显性标记，已经成为了植物交配系统参数估计的常规方法（Brown et al. 1989）。但由于等位酶标记能检测出的多态性相对较低，在多样性较低的物种中的应用会受到一定的限制。不过，尽管如此，等位酶标记仍然是植物交配系统分析中利用得最广泛的技术（Cruzan 1998）。在PCR技术的推动下，各种DNA指纹分析技术的发展为植物交配系统参数的估计提供了新的手段。RAPD、SSR、ISSR等分子标记都可用来研究植物的自交率。尽管RAPD和ISSR标记都是显性标记，只表达表型显性的带，不能鉴别杂合子，用来分析自交率结果可能会有些偏差，但是，这两种标记都能提供大量的遗传变异信息，每个位点提供的信息不足可以通过大量的位点来弥补。Fritsch & Rieseberg（1992）采用RAPD标记对四数木科（Datiscaceae）自交可育植物Datisca glomerata的自交率进行了估计。而SSR标记不仅能提供大量的遗传变异信息，能检测出高水平的等位基因变异，而且还是一个共显性标记，它综合了等位酶标记和RAPD等显性分子标记的优点，所以在植物交配系统参数估计方面，SSR标记的应用可能更有前景。新近发展起来的SNPs标记实验相对简单，尽管比SSR的变异水平低，但是基因组中广泛存在SNPs可以弥补这一缺陷，今后可能将成为植物交配系统分析的主要标记。Goodwillie（2000）利用等位酶标记考察了Linanthus属两种一年生植物的异交率及其与近交衰退的关系。每个种群分析30-32个家系（family），每个家系分析10个子代。采用淀粉凝胶电泳对硫辛酰胺脱氢酶（diapHorase, DIA）、苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase, MDH）、6磷酸葡萄糖脱氢酶（6-pHospHogluconate dehydrogenase, 6PGD）等8个酶系统进行了等位酶分析，利用其中3个多态位点（DIA、MDH、6PGD）的等位基因频率数据，根据MLT计算出各个种群的异交率（图4）。并就L. bicolor和L. jepsonii的自交率和近交衰退进行了比较，结果发现L. bicolor的异交率较低（即自交率较高），其近交衰退反而更低。很好地支持了近交衰退随自交率的增加而降低这一理论预测（Goodwillie 2000）。二、分子标记与亲本分析估计出了自交率，只解决了植物交配系统的一个方面，即“交配的频率”问题。交配系统研究的另一个目标就是解决“谁与谁交配”的问题，换句话说，就是确定每个后代的父本和母本，即亲本分析。亲本分析主要是通过观察或采用遗传标记构建种群的谱系，判定种子（或幼苗）是由哪个成体自交或由哪两个成体异交产生的。在有花植物中，母体和子代的关系相对比较清楚，所以植物的亲本分析实际上主要就是父系分析（paternity analysis）。植物的父系主要来自花粉的传播，通常由昆虫、鸟类、甚至蜥蜴等生物媒介或风、水等非生物媒介来完成。所以，植物的父系分析基本上等同于花粉来源的鉴定。等位酶标记由于其共显性曾经在植物的父系分析中发挥了积极的作用（Avise 1994）。但是等位酶标记的多态性较低，大多数情况下，都不能很好的进行父系分析。RAPD、ISSR和AFLP作为显性标记，由于不能区别杂合子和纯合子，解决自交率、父系分析、计算杂合度等问题效果不佳。但SSR标记是共显性标记，它具有等位酶分析的全部功能，而且SSR指纹在真核生物基因组中广泛分布又处在基因组的高变区，能检测出更多的遗传多态性，是植物父系分析的强有力工具（表1）。表1 应用于植物交配系统和基因流研究的几种遗传标记的比较（据邹喻苹等 2001修改）自交率父系分析传粉后过程基因流克隆鉴定等位酶RFLPRAPDAFLPISSRSSRSNPs“”适合； “”勉强可用，但不太好； “”不适合。SSR标记进行父系分析的主要问题可能在于某些微卫星位点上存在哑等位基因（null alleles）（Jones & Ardren 2003）。微卫星哑等位基因主要是由位点侧翼序列的多态性造成的，因此某些等位基因缺乏有功能的PCR起始位点（Callen et al. 1993, Jones et al. 1998）。包含哑等位基因的杂合子往往被错误地检测为纯合子，从而引起错误的亲本排除。例如，某一个子代的基因型实际为A/n（n表示哑等位基因），那么基因型为B/n和C/n的个体有可能是A/n的亲本；但由于哑等位基因不具有PCR起始位点，不能被扩增检测，所以检测的结果分别为A/A、B/B、C/C，从而排除了B/B和C/C作为A/A亲本的可能性，得到错误的结果（Jones & Ardren 2003）。总的说来，目前应用DNA指纹技术对植物进行父系分析的例子还不太多，但SSR和SNPs进行父系分析的潜力还是显而易见的。Bowers et al.（1999）根据32个微卫星位点对322个葡萄品种谱系的研究可以说是用SSR标记对植物进行父系分析的代表之作。欧洲著名的葡萄品种的起源问题一直受到广泛的关注。有证据表明现存的葡萄品种都已有数百年的历史，而且一般都是通过野生品种的栽培驯化、野生品种和栽培品种或者栽培品种之间的杂交等方式产生的。Bowers et al.（1999）收集了322个葡萄品种，先用17个SSR位点对任意可能的3个品种组合的等位基因进行了比较，确定哪两个品种杂交可能产生第三个品种，然后用另外的15个SSR位点这些组合具体的谱系关系。结果发现，包括Aligote在内的16个著名葡萄品种都是PinotGouais blanc这一对亲本在不同时间和不同地点多次杂交产生的后代（图5）。三、传粉后繁殖行为传粉后的繁殖行为对植物的交配方式也有一定的影响。一般说来，异交花粉比自交花粉更有优势（Weller & Ornduff 1977, Bowman 1987, Cruzan & Barrett 1993, Jones 1994），但很难分清异交花粉和自交花粉的这种差异是由花粉管生长速率不同引起的，还是由二者导致不同程度的胚珠败育引起的。利用遗传标记技术和人工杂交，我们可以对传粉后的繁殖行为进行更直接的观察。Rigney（1995）利用大花猪牙花（Erythronium grandiflorum）设计了一个非常精巧的研究胚珠败育模式的实验。Rigney发现去除大花猪牙花的子房壁后，仍能观察到用标记过的花粉受精后胚珠的生长。当胚珠表现出败育的迹象时，将其切除，利用等位酶标记进行检测，发现绝大多数败育的胚珠都是经自交花粉受精的。换句话说，异交花粉比自交花粉更有优势，是因为由自交花粉受精的胚珠更容易败育（Rigney 1995）。由于遗传标记研究简单而实用，所以，它极有可能在传粉后繁殖行为的研究中发挥重要作用。等位酶标记和SSR标记由于其共显表达在这一领域的作用尤为明显。但是，等位酶标记分析的一个弊端在于胚胎发生早期表达的父本酶（paternal enzymes）比较少（Rigney 1995）。而SSR和SNPs标记能用相对较少的DNA（如单个花粉粒或发育早期的胚珠）进行PCR扩增，将会越来越适合对花粉管生长和受精后胚珠败育等传粉后繁殖行为进行深入研究。【实验目的】1 掌握等位酶分析技术；2 能够运用等位基因频率分析植物种群的自交率；【实验器材】电炉培养箱稳压稳流电源组（电泳仪）电泳槽天平（0.001g）pH计搅拌器冰箱培养皿（120mm）瓷比色盘三角瓶（50mL）试管（12mm或14mm）移液器台式高速离心机容量瓶烧杯洗瓶【试剂】1. Tris-HCl提取缓冲液Tris-HCl缓冲液（0.1mol/L, pH 7.5）2. Tris-甘氨酸电极缓冲液（0.2mol/L, pH 8.3）3. 聚丙烯酰胺凝胶配制1) 制胶储液：A30%Acr-0.8%Bis储液Acr 30g （丙烯酰胺（Acrylamide）Bis 0.8g （N-N-亚甲基双丙烯酰胺（N-N-Methylene-bis-acrylamide）加水至100mL，过滤B1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.8）Tris 30.3g用HCl(1mol/L) 调pH至8.8，用容量瓶定容到250mLC0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）Tris 3.03g用HCl(1mol/L) 调pH至6.8，用容量瓶定容到50mLD1%过硫酸铵（AP）溶液过硫酸铵 0.2g溶于20mL水中4. 染液配制a. Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L, pH 8.0）b. Tris-HCl缓冲液（0.2mol/L, pH 8.0）c. 磷酸缓冲液（0.1mol/L, pH 6.0）d. -萘乙酸（1g/100mL 丙酮，-napHthyl acetate）e. -萘乙酸（1g/100mL 丙酮，-napHthyl acetate）f. 辅酶II（NADP, 0.5%）g. 噻唑蓝（MTT, 1%）h. 吩嗪钾硫酸（PMS, 1%）【方法与步骤】一、 等位酶的提取1 配制提取缓冲液植物等位酶提取的缓冲液组成有多种，最常用的是Tris-HCl复杂提取缓冲液，其组成如下：0.010g乙二胺四乙酸，四钠盐（EDTANa4, 0.001mol/L）0.019g氯化钾（KCl, 0.01mol/L）0.050g氯化镁（MgCl26H2O, 0.01mol/L）1 5g聚乙烯基吡咯烷酮（PVP 40, 4 20% w/v）1.25 g蔗糖25.00mL Tris-HCl缓冲液（0.1mol/L, pH 7.5）把PVP放入溶液搅拌溶解，或者水合过夜。放入冰箱保存。使用前按1-2%（v/v）加入2-巯基乙醇。PVP和2-巯基乙醇的用量可以根据提取效果进行调整。其他几种提取缓冲液的配制可参照王中仁（1996）。2 样品采集原则上，植物体上任何有活性的部位都可以用来进行等位酶分析，但幼嫩组织的酶活性最高。所以一般采集幼嫩的叶片进行实验。本次实验采用恶性入侵杂草普通豚草（Ambrosia artemisiifolia）的种子为材料，研究其种群水平上的自交率。3 研磨提取在实验室分别将每粒种子或胚置于比色盘中，加入150uLTris-HCl提取缓冲液，用试管进行研磨，研磨至材料粉碎为止。用滴管或移液器吸取每个孔中提取出的酶液放入1.5mL的小指管中，然后将滴管洗净用来吸取下个孔中的酶液。冰浴研磨后，10000 rpm，4离心1min，取上清，-20保存备用。二、 制胶1 封胶将玻璃板卡入胶条，安装好电泳槽。待煮沸的2.5%的琼脂冷却至50左右时，用其将卡有玻璃板的胶条与电泳槽接触部位的缝隙封严实。2 制备分离胶按表2的组成配制分离胶：表2 聚丙烯酰胺凝胶组成组分分离胶浓缩胶5%7%10%3%4%Arc Bis3.2mL4.5mL6.5mL1.0mL1.3mLTris-HCl, pH 8.816.3mL15.0mL13.0mL00Tris-HCl, pH 8.80001.0mL1.3mLH2O0007.7mL7.1mL过硫酸铵（钾）0.5mL0.5mL0.5mL0.3mL0.3mLTEMED20L20L20L15L15L混合液配好后，将其倒入电泳槽两玻璃板之间，使液面距离矮板顶端1 1.5cm。马上在液面上加水，以保持胶免平整。放入30左右的培养箱中保温50min左右。3 制备浓缩胶倒掉分离胶上面的水，并用滤纸或注射器尽量吸尽胶面上的水，按表1所示配制浓缩胶混合液，注入到分离胶上直至没过矮板。马上插入样品梳。放入30左右的培养箱中保温。30min左右后，拔出样品梳。三、 上样用微量进样器或者移液器吸取18uL的酶提取液，按一定顺序加入样品孔内。四、 电泳将电泳槽与稳压稳流电源组（电泳仪）连接好，在电泳槽的正负级加入Tris甘氨酸电极缓冲液（0.005mol/L, pH 8.3）和适量的溴酚蓝指示剂。打开电源，200V稳压电泳。电泳时会产生大量的热，最好将电泳槽放入带透明门的冰箱内进行电泳，或者接通电泳槽的冷却装置。五、 染色待指示剂电泳至接近玻璃板下端时，停止电泳。拆开电泳槽，将凝胶剥离至120mm培养皿中。按附录中给出的配方配好染色混合液，混匀后，倒入培养皿中，使凝胶沐浴在染液中。立即放入37左右的培养箱中保温。注意，染色液中NBT、MTT、PMS一定要在染色前最后加入。大多数酶都需要避光温育。六、 酶谱判译根据各种酶的不同亚基组成、酶谱上的带型，判断位点和等位基因。以基因型的形式记录酶谱。七、 数据分析根据得到的基因型，利用MLTRwin计算种群水平上的自交率。【染色配方】AAT：天冬氨酸转氨酶，Aspartate aminotransferase (E.C.)二聚体Tris-HCl0.2mol/L, pH 8.025mL天冬氨酸0.125g-酮戊二酸0.05g5-磷酸吡哆醛0.003g固蓝BB盐0.05gEST：酯酶，Esterase (E.C.3.1.1.-) 单体磷酸缓冲液0.1mol/L, pH 6.025mL-萘乙酸1g/100mL丙酮1mL-萘乙酸1g/100mL丙酮1mL固蓝RR盐0.05gADH：乙醇脱氢酶，Alcohol dehydrogenase (E.C.)二聚体Tris-HCl0.05mol/L, pH8.025mLMgCl210%200uL乙醇95%1mLNAD1%500uLMTT（或NBT）1%500uLPMS1%200uLSKD：莽草酸脱氢酶，Shikimate dehydrogenase (E.C.5)单体Tris-HCl0.05mol/L, pH8.025mL莽草酸0.03gNADP0.5%500uLMTT（或NBT）1%500uLPMS1%200uL【注意事项】1 不同的植物材料，由于所含有的次生代谢物的不同，可能应采用不同的提取缓冲液。2 在整个实验过程中，应尽量快速操作，使样品在常温下搁置的时间尽量短，以保证酶的活性。3 制备浓缩胶时，应尽量吸尽分离胶面上的水，以免分离胶与浓缩胶之间产生气泡。4 电泳过程中会产生一定的热量，尽可能地营造低温环境。5 加入染液后，每隔一定时间应该检测凝胶上是否显示出带来。不同的酶染色时间长短不一，显色完毕的凝胶应立即停止染色，判译酶谱，记录数据并妥善保存凝胶。【数据分析】植物的交配系统分析MLTRwin (Ritland 2002)Friedman J, Barrett SCH. 2008. High outcrossing in the annual colonizing species Ambrosia artemisiifolia (Asteraceae). Annals of Botany 101: 1303-1309.Eckert CG, Barrett SCH. 1994. Post-pollination mechanisms and themaintenance of outcrossing in self-compatible Decodon verticillatus (Lythraceae). Heredity 72: 396411.MULTILOCUS MATING SYSTEM PROGRAMMLTRWritten and copyrighted by Kermit RitlandThis program is available free of chargeVersion 2.4November 2002Reference: Ritland, K. 2002. Extensions of models for the estimation of mating systems using n independent loci. Heredity 88: 221-228. Source of program: http:/genetics.forestry.ubc.ca/ritland/programsContact: kermit.ritlandubc.caPlease report any problems with running the program so I can fix/improve the program.BACKGROUNDMLTR is a total rewrite of MLT, a program originally released in 1981 (Ritland and Jain, 1981). MLT (meaning multilocus t, or maximum likelihood t) was first written in FORTRAN for a minicomputer (Digital PDP34) and in 1984 the code was ported to DOS using the Microsoft compiler. The program was continually updated through the late 1980s. Also, other mating system estimation programs were derived from it, including one that used megagametophyte information (MLTF, Ritland and El-Kassaby 1985), one that incorporated correlated matings (CORRT, Ritland 1989), one for tetraploids with several alleles (MLTET, Murawski et al 1994), one for loci with dominance (MLDT, Ritland 1990), and one that allows two rates of outcrossing in the population (ML2T, Ritland 1990). In 1994, I rewrote MLT to include multilocus estimation of correlated matings and other features (such as a grouping variable allowing more classes of outcrossing rates, and formula for arbitrary numbers of alleles at a locus), and renamed it MLTR (the R for correlation, and for revision). I intended to eventually compile it for 32 bit systems and include run-time dimensioning, but things were delayed by my move to the University of British Columbia in 1996. However, these programs were written in antiquated FORTRAN 77 for 16 bit systems, with the consequent mainframe limitations. Also, were too many programs and I couldnt update all of them. In 1998 I decided to convert the revised MLTR code from FORTRAN to Visual Basic (version 5.0), and to eventually have a single program do the tasks of all the derivative programs listed above. This turned out to be a disaster, as Windows programming is 95% fiddling with forms and controls and 5% formulas, while DOS programming is the opposite. On top of this, Visual Basic has all these dlls and registry things that make it difficult to install. In 2000, I obtained Visual Fortran 95 and rewrote the program again, starting with the MLTR code I write in 1994. Again it was a struggle with the forms, but not as bad. Its was finished in time for the 20th anniversary of my 1981 paper with Subodh Jain.The new program is termed “Mltr” (for multilocus t and r), is written in Compaq Visual Fortran 95, and runs under Windows 95 and later operating systems. Run-time array dimensioning allows any size of sample (loci, alleles, families, etc.) to be used. Letters or numbers can be used for allele designations, and the megagametophyte may be either known or unknown. Additional features include: grouping of individuals for mating system estimation (gene frequencies assumed constant among groups), selection between the EM vs. Newton-Raphson methods for numerical solution of the likelihood, and bootstrapping either within families or among families for determining errors of estimates. There are other improvements as well.MATING SYSTEM MODELSInbreeding plant mating systems have traditionally been described by the mixed-mating model, which assumes that plants self-fertilize at rate s. The remaining fraction of progeny are derived from outcrosses, which in the simplest assumption are deemed to occur at random to the remaining population. MLTR estimates from progeny arrays the following inbreeding parameters:tm = the multilocus population outcrossing ratets = the (minimum variance) singlelocus population outcrossing rateF = the (minimum variance) singlelocus inbreeding coefficient of maternal parentsIn estimating these quantities, the female (egg, or ovule) gene frequencies and the male (pollen, or sperm) gene frequencies must be simultaneously estimated. MLTR can do this, or to increase statistical efficiency, you can constrain them to equal each other (a minimum variance average is taken).Some departures from these assumptions can be accommodated and be treated as additional facets of the mating system. If mating occurs between relatives (biparental inbreeding), the single-locus selfing rate should be higher than the multilocus selfing rate, and the difference is a minimum estimate of the apparent selfing due to biparental inbreeding. If outcrossing is non-random, single-family estimates of selfing can be used to detect pollen-pool heterogeneity. Outbreeding plant mating systems have normally be characterized by the extent of multiple paternity, and the distances between mates (pollen dispersal curves). With progeny arrays, one can estimate probability that a pair of progeny are full sibs vs. half sibs (the correlation of outcrossed paternity, Ritland 1989). If partial selfing is present, one also has to consider the possibility that selfing rates vary among families, e.g., that this is a correlation of selfed paternity (Ritland 1989).MLTR also can estimate two parameters of correlated matings:rp = the correlation of outcrossed paternity within progeny arrays (or the probability that a randomly chosen pair of progeny from the same array are full sibs). rt = the correlation of outcrossing rate within progeny arrays(normalized variation of outcrossing rate among progeny arrays)Both are estimated with new, multilocus formula which are more efficient than those given in Ritland (1989) (see Ritland, 2002).MLTR also estimates two new parameters of population substructure (Ritland 2002): (1) single vs. multilocus correlated paternity. If single is greater than multilocus, there is an effect of population substructure on the male similarity between outcrosses. (2) correlation of selfing among loci. With biparental inbreeding, this quantity is less than one, and under some assumptions, the rate of biparental inbreeding can be found (see Ritland 2002).Animal mating systems are usually described in terms of the pattern of paternity, not by levels of inbreeding. MLTR can be used in this case to determine the extent of single- vs. multiple paternity in progeny arrays (estimate rp, set other parameters to zero).SAMPLING AND SAMPLE SIZESSample sizesGenerally, f