水产动物微生态制剂的应用进展毕业论.doc

分类号070401 编号201455502133烟 台 大 学毕 业 论 文水产动物微生态制剂的应用进展The application progress on microecological preparation in aquatic animals申请学位： 理学学士 院 系： 生命科学学院 专 业： 生物科学 学生姓名： 孟银龙 学 号： 201055502133 指导老师： 陈营 2014年6月6日烟台大学水产动物微生态制剂的应用进展申请人： 孟银龙 导 师: 陈营 2014年6月6日烟台大学摘 要随着人类对水产动物生态养殖的消费需求逐年增高，微生态制剂的地位也显得越来越重要。益生菌在提高人类和动物营养和预防疾病的作用已被证实。微生态制剂的使用作为抗菌药物及饵料添加剂的代替品，逐步成为水产动物养殖预防疾病、促进生长的一条可持续发展道路。本文介绍了微生态制剂定义的形成和发展历程，阐释了微生态制剂的作用机制，综述了历来世界范围内不同微生态制剂在水产动物中研究的状况及应用进展。从促进水产养殖动物有益生长、提高免疫能力及改善水体环境等板块概括了微生态制剂中重要益生菌、益生元及合生素等在水产养殖中的应用。同时对微生态制剂的使用方法及在生产与使用中出现的问题进行了分析，最后提出了作者本人的看法和展望。关键词：水产养殖；微生态制剂；益生菌；益生元；合生素Probiotics the progress of the application of aquatic animalsAbstractWith the increasing demand for the sustainable development of aquaculture, the application of probiotics is becoming more and more widely. The role of probiotics in improving human or animal nutrition and disease prevention aspect has been confirmed. The application of probiotics as an alternative to antibiotics and feed additives is gradually becoming a sustainable development road of aquaculture animal disease prevention and the growth promoting.This paper briefly describes the formation and development of the concept of probiotics, and elaborates mechanism of action of probiotics, and reviews the recent research and application situation of various probiotics used in aquaculture at home and abroad. And it summarizes the application in aquaculture of the main probiotics, prebiotics and synbiotics etc. in microecological preparation. Meanwhile the author discussed the problems existing in the production and application of probiotics, and finally put forward the authors own views and outlook.Keywords: Aquaculture; Microecologics; Probiotics; Prebiotics; Synbiotics目 录前 言11 微生态制剂21.1 微生态制剂的发展史21.2 微生态制剂的种类31.3 微生态的作用机理41.3.1 优势种群作用41.3.2 生物夺氧作用41.3.3 生物拮抗作用41.3.4 提高机体免疫功能41.3.5 营养促生长作用51.3.6 生物降解作用51.3.7 食物链理论51.4 适于微生态制剂菌种的特点51.5 微生态制剂的常用施用方式及其注意事项61.5.1 作为饵料添加剂61.5.2 注射或浸浴生物体61.5.3 直接加入水域62 不同类型微生态制剂在水产动物中的应用82.1 主要益生菌在水产养殖中的应用82.1.1 光合细菌82.1.2 芽孢杆菌92.1.3 乳酸菌92.1.4 硝化细菌和反硝化细菌102.1.5 酵母菌102.1.6 EM菌102.2 主要益生元在水产养殖中的应用112.2.1 低聚糖112.2.2 多糖122.3 主要合生素及其在水产养殖中的应用123 微生态制剂存在的问题134 水产动物微生态制剂的发展趋势及展望144.1 向专一性制剂方向发展144.2 提高制剂包被等加工技术144.3 深入研究微生态菌种的耐药机制144.4 工程菌领域方向144.5 产业规模化生产工艺的完善15致 谢16参考文献17烟台大学毕业论文（设计）前 言随着水产动物养殖的快速成长,产业化、集约化动物养殖的增加,导致过度拥挤,养殖品种单一,养殖水体环境不平衡;不及时降解养殖污染，工业废水及生活污水的排放使海岸带及江河水体质量受到严重污染,造成水产动物生态系统的损坏,进而引发一系列的病情。为了防止水生动物疾病的发生,人们开始使用抗生素和化学用品，并起到了一定的积极作用。但长期使用也带来了一系列的负面效应及潜在危害。许多有害微生物的基因突变和病原体抗性基因的重组,导致增加抗生素的使用,从而导致内源性感染和重复感染;同时打破和影响了肠道内有益菌群和水体微生态环境的平衡,降低或限制了水产动物的免疫功能;此外，许多化学用品在养殖动物体内蓄积,间接的损坏人类身体的健康1。这些状况的出现已使抗生素成为全球性的污染源,抗生素的片面性、短时性和不可持续性等也使其成为阻碍水产养殖业持续发展的重要原因之一,世界卫生组织与欧洲和美国等许多国家都在饲料和水产畜禽养殖业制定有关规定，限制或禁止使用抗生素。因此,微生态制剂的出现为水产养殖业走生态的、无公害的、可持续发展的养殖道路提供了有力保障。根据微生态学基础理论研制出来的微生态制剂有投资小、收获大，绿色环保，无副作用、无残留、无抗药性、无记忆，促生促长和净化水质等优点, 并能解决食品安全问题，人类健康和环境的保护问题，充分显示了使用微生态制剂控制技术的优越性。也正因微生态制剂拥有如此之多的特别之处,人们对它的研究和应用给予了越来越多的注目。随着研究人员对微生物菌类和微生态系统的认识不断提高,利用微生物来改善水产动物肠道内的微生态平衡,利用菌株与宿主生物之间的增进作用来提高水体环境质量等方面的研究,正逐渐成为全世界关注的焦点。1 微生态制剂1.1 微生态制剂的发展史微生态制剂(Microecologics)是根据微生态学原理，经发酵、提取、干燥等一系列生产加工过程生产出来的生物制剂。微生态制品的应用包括活菌死菌、菌体物质、代谢成分及活性生长促进物质等2。狭义的微生态制剂只包括有益菌，广义的微生态制剂不单包括有益菌，还包括少许能产生一定的促进生态平衡或促进生物活力,从而促进肠道或相关环境菌群生长发育的物资所生产的制剂，包含益生菌、益生元和合生素等3。1905年，Elie Metchnikoff使用酸奶治疗幼畜腹泻,并证明酸奶中的乳酸杆菌能够抑制大肠杆菌的生长4。此后,人们对菌类逐渐有了新的认识。上个世纪中期，随着微生物研究领域的不断扩大与加深，人们逐渐认识到微生物对人及动物的重要性，同时也逐渐加深了对益生菌的了解，对“有益细菌”即“益生菌”的研究开启了微生态制剂的发展历程。1965年Lilly、Stillwell把有益菌定义为“对养殖动物肠道菌群平衡有改善作用的成分或微生物”5。帕克6于1974年初次使用“Probiotics”一词把有益菌概括为：有利于肠道微生物群落均衡的菌株和相关成分（或者含有抗生素）。Kozasa7于1986年初次用有益菌处理水产动物，饲喂日本鳗鲡从泥土中分离出来的芽孢杆菌(Bacillus toyoi)，抑制了爱德华氏菌的生长繁殖，提高了鳗鲡的存活率。随后，有益菌的在水产动物中的研究和应用得到了快速发展。1989年Fuller8提出了“活菌”，它被概括为“一种可通过促进肠道微生物群落均衡而对养殖动物产生有益作用的活体微生物添加剂”。但随着研究的深入，大量资料表明微生物代谢产物、菌体成分甚至死菌体都有促进微生态平衡作用。所以1994年在德国对微生态制剂重新定义的微生态国际研讨会，指出微生态制剂的主要成分不仅是活的益生菌，同时也包括死菌体及其代谢成分。在水产养殖中，由于水生动物与水体密切接触，水生动物肠道菌群与水体环境菌群相互关联相互影响。益生菌不仅可以作为饵料添加剂对水产动物产生影响，还可单独投入来调节水体环境状态，从而间接对水产动物产生积极作用。于是Moriarty9将有益菌的定义延伸为“一种加入养殖水环境中的有益微生物”。Gatesoupe10在1999年将益生菌定义为“能够进入胃肠道可改善动物健康的并能够保存活力的微生物细胞”。事实上，水体中的微生物不仅与水产动物的肠道菌群能够互相影响，还可依附于动物表皮、卵细胞、新生幼体等对其产生作用。水体菌群的种类或数量的改变也将改变水产动物的生长状况，因而水体微生物总体的平衡对动物的生长繁殖至关重要。因而Verschure等于2000年将益生菌更加科学地定义为“通过提高饵料营养价值、增大饵料吸收率、提高动物对病害的抵抗能力或改善饲养动物相关益生菌群落或改善动物生存环境的一种对养殖动物有利的活的微生物”11。2002年欧洲食品与饲料菌种协会(EFFCA)将有益菌概括为“通过摄入足够的剂量,对机体产生一类或几类经验证的特别的功效性生长性能促进作用的活的菌类”12。人类对微生态制剂的应用已有近半个世纪。由于饲料中抗生素的添加导致了一系列的生态破坏、有害人体健康和不可持续发展等问题，欧美等国开始相继限制或禁止抗生素在饲料中的添加,从而推动了微生态制剂研究应用的进展。从70年代美国开始使用有益菌类饲喂养殖动物。上世纪80年代,日本市场所售医用微生态制剂已有二十多种。1989年美国相关部门公布了能够直接加入动物饲料的健康菌株有43类。随后的90年代，欧洲的英国、德国、法国等对微生态制剂的研究应用也开始了快速发展。1991年在法国市场上出售的益生菌制剂已超过50类。我国70年代才开始对益生菌制剂进行研究，相对落后。1990 年全国微生态学会在学术研讨会中第一次给出了“微生态制剂”一词，并给出了相关的定义及概念。1992年，中国动物微生态学会建立，并将微生态制剂及其利用技术列入国家“八五”科技攻关课题，加速了我国益生菌制剂研究应用的发展。1999年我国农业部第105号公告发布的能够直接添加于饲料的菌种有12种。2008年12月我国农业部第1126号文件颁布的饲料级饲料添加剂菌种有16种。历来有不少中外学者及研究人员对“益生菌”的进行过不同层次的定义。国内目前总体认识为：益生菌制剂是按照微生态学原理，能够调节微生态失常，促进微生态平衡，提升机体活力水准或增进机体健康状况的微生物及其代谢物质或生长促进成分的制剂。在水生动物中，益生菌不只是作用于水产养殖宿主肠道内情况，也与水体环境存在必然联系。由此，微生态制剂又被概括为：一类能够改进与水产动物有关的或其附近的各种菌类群来提高饲料的利用率，增强水产动物对疾病的应答能力或改善其周边水体环境从而对水产动物产生有益影响的活菌制剂13。1.2 微生态制剂的种类根据制剂构成因素的不同，微生态制剂包括3个类型，即益生菌（Probiotics）、益生元（Prebiotics）和合生元（Synbiotics）。益生菌又称益生素，是指能促进宿主微生态均衡而产生有利影响,实现提高机体健康状况和生长性能的活菌制剂及其代谢成分；益生元是指一类不易吸收的生物成分,却能够作为肠道内正常菌株生长繁殖的原材料,可以选择性地促进肠道有益菌的健康和活力,抑制致病菌的活性，促进机体健康的物质，如寡糖类；合生素也被称做合生元，是指有益菌和有益成分混合的制剂，也可添加微量矿质元素和维生素，具备益生菌和益生元双重功效14。根据微生态制剂菌属的组成种类多少可分为以下三类：由一种菌种组成的单菌种制剂，由同一属多种微生物复合而成的复合菌种制剂，由几种不同属微生物混合而成混合菌种制剂15。按微生态制剂形态的不同一般可分为粉剂和液剂。粉剂方便运输，保存时间较长，但加工工艺较复杂，且加工过程中菌种的质量易受到影；在使用过程中的要求也高，需要通过一些程序激活菌种，操作比较麻烦且成活率不高。液剂一般有原液和稀释液两种，原液浓度高，稀释液浓度较低。目前多数厂家选择生产液剂，便于无菌操作，容易控制菌种的质量及保持菌种活性，但生产成本较高。1.3 微生态的作用机理1.3.1 优势种群作用水产动物胃肠道、皮肤、鳃等部位是微生物寄居的主要部位，也是最容易受到病原菌感染的地方。正常情况下，动物肠道内菌群的数量与种类是一个动态的均衡状况，这些菌群与周围环境一同构成了动物肠道微生态系统。而对此环境系统起决定作用的却是种类不多的优势菌种。如果机体生长环境发生改变，如养殖密度的增大、饵料的变质、抗生素的添加等因素改变了水质理化性质，就会对机体内外产生影响，导致肠道菌群失衡，皮肤黏膜遭到损坏。优势菌群失去控制力，从而使微生态平衡失调。使用适量的微生态制剂，使有益菌种在肠道内或皮肤快速繁殖，黏附于肠道或皮肤并产生抑制物质，重新夺回优势附着位点，恢复微生态平衡，从而改善水产动物的健康状态。1.3.2 生物夺氧作用水产动物肠道内有益菌群多是厌氧菌，用可以吸收肠道氧气的有益菌如酵母菌等制成的微生态制剂处理肠道，会减少内环境氧含量，这种缺氧环境可以抑制需氧菌种及兼性厌氧菌的生长繁殖，而使有益的厌氧菌得到正常生长，从而恢复菌群微生态环境的平衡，防治疾病并能促进机体健康生长。1.3.3 生物拮抗作用微生态制剂中的益生菌对水产动物肠道内病原菌有拮抗作用。益生菌不仅能产生抑菌或杀菌物质，如乳酸菌在宿主肠道内产生乳酸，芽孢杆菌在宿主肠道内能够分泌乙酸等，降低菌群环境pH值，抑制致病菌的活性，还能与病原菌争夺生态位点能够优先黏附于动物肠道粘膜及皮肤细胞，形成生物拮抗或产生化学物质形成屏障作用，阻止病原微生物的侵入和定植，保持正常菌群的平衡，从而利于机体的生长发育16。1.3.4 提高机体免疫功能微生态制剂同时又是免疫激活剂，其细胞壁上的肽聚糖能够激活黏膜免疫细胞17，可产生非特异性免疫调节因子，刺激免疫系统的建立与完善，刺激动物干扰素的分泌，增强T、B淋巴细胞对抗原的反应能力，提高巨噬细胞的生物活性和免疫球蛋白的浓度，增强机体免疫识别能力、抗病能力及抗逆性18。同时，微生态制剂通过对胃肠道微生态环境的调节，控制病原菌的生长繁殖消除其产生的各种毒素，促进肠黏膜的稳定，达到机体免疫能力的增强。1.3.5 营养促生长作用微生态制剂中的益生菌及其代谢产物可被水产动物当做极好的营养物质来利用。同时益生菌在代谢、繁殖的过程中可以合成多种维生素，如核黄素、B族维生素、尼克酸、叶酸、泛酸等和多种氨基酸、消化酶、有机酸、有益因子等营养物质被养殖动物所利用或活性物质促进营养代谢19。如光合细菌蛋白质含量丰富,还有多种维生素、钙、磷及多种矿物质等,可直接被机体利用；芽孢杆菌产生的一些活性酶如蛋白酶、脂肪酶等可促进饲料营养的释放，提高饵料转化率，促进水产动物对饵料的营养吸收，从而达到促进生长的效果。1.3.6 生物降解作用水产动物生物降解作用体现在两个方面：一是降解动物自身有害物质，二是降解水体环境中的有害物质。如果水产动物肠道菌群生态失衡，致病菌如大肠杆菌会增强活动，生长繁殖速度加快，将蛋白质过多的转化为氨、胺、细菌毒素等有害物质，导致机体性能下降，生长减缓。微生态制剂中的益生菌可抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长，从而恢复优势菌群的数量，防止有毒物质积累，从而降低毒素等对动物机体的损害。另外，一些菌剂中的有益菌，如芽孢杆菌，在机体内会分泌出分解硫化物的降解酶或氨基氧化酶，能够减少宿主体内和肠道内吲哚、氨等有害物质的排放20。养殖动物生长环境中的益生菌可以吸收水体多余的有机物、含氮物、含硫物等通过光合作用合成自身物质,并可进行硝化与反硝化作用转化水体重金属等有害物质以改善水质环境21。1.3.7 食物链理论水产动物机体内外存在着多种多样的微生物，这些微生物整体看来就是一条复杂有序的食物链，它们彼此依赖、和睦共生，组成一个具有非常强的自我调节能力的微生态系统22。1.4 适于微生态制剂菌种的特点微生态制剂的菌种的选择十分重要,理想的益生菌菌株应具有以下几个特点:(1)能与宿主共生且对宿主无害,无致病性、没有毒副作用,不和病原菌杂合；(2)可以在pH值较低的无机酸、有机酸及胆汁酸中生存,且可以黏附在肠粘膜上；(3)发酵过程中会产生乳酸、过氧化氢等其他抗菌物质；(4)在体内易繁殖, 能产生抗生素类的物质,有较高的竞争优势,进而阻止致病菌的定植与增殖23；(5)源于正常活力较高的动物自身的菌株最佳,使其能够较高程度地发挥有益功能等。能够直接投放于养殖水域,来改进水产动物生长环境、从而促进养殖动物生长繁殖的菌种制剂选用的菌株可以不是来源于机体自身菌类,但必须是正常水产动物生长水域中的固有菌株,优势菌群最佳,如光合细菌、硝化细菌等24；(6)易于与其他菌株联合，增强促长作用；（7）能够工业化生产,加工处理后能够保持足够的菌数与活力,且稳定性好。1.5 微生态制剂的常用施用方式及其注意事项1.5.1 作为饵料添加剂作为饲料添加剂，动物在吸食过程中连同添加剂一起食入体内而产生作用。目前应用这类方法的较多，此法具有应用简便、省时省力、效果明显等特点。而此法对微生态制剂有效成分的耐受性和稳定性要求较高，在饵料制粒和投喂过程中需保有一定的生理活性，才能产生一定的积极作用。也可将制剂与饲料分开包装，在投喂时将饵料和制剂混合，这样可防止制粒过程对菌种的破坏。但操作不便，对配比的控制不够精确，而且所需剂量较大。Rengpipat等25在试验中使用微生态制剂(1012cfu/g)与饲料的比重达31。若能利用基因工程等技术得到耐受性较强的菌种，可降低在饵料制粒过程中益生菌的破坏问题。应注意的是，对于不同生长阶段的水产动物，应使用不同添加剂量的饵料。饲喂过程中，饵料要小心保存，以免变质达不到应有的效果。1.5.2 注射或浸浴生物体用微生态制剂直接接触动物，短期内就可以刺激动物免疫系统产生作用。体型小的动物常选用浸浴的方法，这种方法应注意使用浓度与剂量，适宜的剂量才能最大限度地提高动物的免疫机制，而注射的方法则适合于体型较大的动物。应当注意的是注射容易给动物造成伤害，增大感染机会。Austin等用不同浓度的溶藻胶弧菌分别用注射和浸浴的方法来处理大西洋鲑，使得杀鲑气单胞菌对鲑的感染率大幅度下降26。1.5.3 直接加入水域将微生态制剂直接投入养殖水域，对水产动物生长环境产生作用，从而间接提高水产动物的营养健康状态。但在使用过程中，需注意水体环境能否满足益生菌生存和繁殖的条件，投喂菌种应根据水体的酸碱性以及其他理化性质而确定。抗生素及其他合成药物可以妨碍细胞壁及细胞蛋白的生成,具有破坏外膜的功能。因此需特别注意不能与消毒剂、抗生素等化学物质同时使用，否则菌种将难以存活或发挥作用。同时应注意施用的周期和菌体活力及菌体数量。投入水体的菌种一定周期后会逐渐死亡减少,故需在饲养过程当中按照一定周期定量投入,使益生菌在水环境中形成优势菌群,发挥最大效果；换水也会减少菌体数量，因此应减少换水次数，换水后需补充菌量的不足27。2 不同类型微生态制剂在水产动物中的应用2.1 主要益生菌在水产养殖中的应用2.1.1 光合细菌光合细菌（Photosynthetic bacteria，PSB）是水域环境中广泛生存、具备原始光合系统、用于微生态制剂生产最多的一类细菌。光合细菌为革兰氏阴性菌，有硫颗粒，具有光合色素，是一种用光作为能量来源、在厌氧光照或好氧黑暗条件下吸收生长环境中的有机物、含硫物、含氮物等作为物质来源进行光合生长代谢的菌类。光合细菌在自然界中普遍存在，主要生存在水体环境中光线范围内的缺氧区。其特殊的生长性能及其生理功能使光合细菌具有作为水产动物饲料、水质改良、疾病预防等功能。它的许多生理特性，使其在生态系统中占据非常重要的地位。光合细菌分为3个科：红螺菌科（Rhodospirillaceae）和绿菌科（Chlorobacteriaceae）、着色菌科（Chromatiaceae），共18个属28。光合细菌生长性能极强，生长繁殖速度较快，还可以忍受条件恶劣的生长环境，对氰、酚等有害物有一定的分解转化能力，可以分解吸收水环境的亚硝酸盐、含硫物、重金属离子等有毒成分，从而减少固体有机物及有毒成分的积累，实现水质的净化，水体环境的改善；同时光合细菌细胞自身含有大量的营养成分，其菌体脱水后竟含有60%以上的氨基酸及蛋白，还有丰富的B族维生素、类胡萝卜素、辅酶Q、泛酸、叶酸等营养物质及活性成分，这些营养成分及活性成分可以促进水产动物的免疫应答能力，促进水产动物的生长，因而被广泛应用于水产养殖。1998年光合细菌被农业部批准为新型微生物饲料添加剂。用于水产动物养殖的光合细菌主要有光能异养型红螺菌科(Rhodospirillaceae)中的部分菌种，如沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonas palustris)。孙舰军等29将光合细菌加入饵料中投喂中国对虾22天后发现,细胞数目、PO、抑菌能力和抗菌活力分别比对照组提高67.2%、102.1%、22.1%、53.4%和14.0%。薛德林等30选取光合细菌N9281在水池养鱼中进行研究,用对照的方法在东北的两个养殖基地采用两组情况相近的鱼塘进行试验,放养鲢鳙鱼和鲤鱼,两组放养的鱼苗种类、密度、规格、配比和时间相同,相同条件下养殖一个月后,在试验池施洒光合细菌菌液,一个月后再施洒一次,对照池不施洒,其他条件相同。结果显示，培育繁殖的轮虫数目提高218到1911倍,浮游植物数目提高512倍,幼苗成活率及产量各提升314%到2516%和817%。表明细菌N9281有利于隐藻类浮游生物的生长,直接或间接促进了鱼苗的生长发育。赵亮等31试验,将光合细菌制剂投入人造半海水河蟹独立养殖繁育体系中,气单胞菌数目降低8.3%,弧菌数目下降11.1%,硝化细菌数目提升了5倍。2.1.2 芽孢杆菌芽孢杆菌（Bacillus）是一类可以形成对不利条件有非凡抵御能力的内生孢子的革兰氏阳性菌，其中有几个种可以分泌肽类抗生素32在动物肠道中这类菌属只占微生物群落极少部分。微生态制剂中芽孢杆菌常以芽孢的形式稳定存在，其对外界化学消毒剂、高温、高压、干燥、辐射等有害因素有很强的耐受性，在休眠状态下，不消耗营养物质，被食入宿主机体后，可在肠道壁快速萌发，成长为具备生长繁殖活力的营养型细胞，且再生率接近100%，同时其产生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等具有很强的生物活性,可以降解植物饵料中部分难以被利用的物质33芽孢杆菌的这些特殊性的利用对人类将是一笔宝贵的财富。目前应用于水产动物最多的有枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等34。罗辉等35在鲤鱼的饵料中分别加入枯草芽孢杆菌与混合芽孢杆菌，试验表明两种微生态制剂都能对鲤鱼的增重率有所提高。刘小刚等36将芽孢杆菌加入到异育银鲫的饵料中，结果表明，加入0.1%芽孢杆菌，异育银鲫肝、肠、胰脏淀粉酶活性分别比空白组提升83.7%和129.5%，加入0.2%芽孢杆菌，异育银鲫肝、肠、胰脏蛋白酶活性分别比空白组提升466.2%和85.4%。林亮等37将芽孢杆菌制剂投入水池后对池底底部沉积物微生物群落展开了分析,结果显示,水池底部沉积物微生物群落的组成发生了变化,芽孢杆菌制剂能够使底泥好氧细菌的数量增多。Rengpipat等38用芽孢杆菌S11投喂斑节对虾进行了对照实验，测量了对虾淋巴细胞的吞噬活力，实验表明，芽孢杆菌S11能在相当程度上促进吞噬作用，增强吞噬活力；90天试验后，用哈氏弧菌侵染两组虾，10天后未处理组的存活率明显低于处理组，处理组的免疫应答及吞噬活力明显提高。证明芽孢杆菌S11能通过提高虾的细胞免疫和体液免疫的应答能力以及肠道菌群的竞争抑制，从而达到抵抗疾病、促进生长的效果。2.1.3 乳酸菌乳酸菌，是指在发酵糖类过程当中能够分泌乳酸的细菌的总称，是一种类不产生芽孢、异养厌氧或兼性厌氧型、革兰氏阳性菌。乳酸菌包含种类非常多，包含18个属以上，有200多种，广泛存在于动物肠道内。在水产养殖微生态制剂中常用的益生菌主要有乳杆菌属和双歧杆菌属两种，能够通过分解糖类产生乳酸和其它有机酸物质，能够降低养殖机体肠道内的pH值，从而阻止其它有害菌群的入侵和定植，提高水产动物体液免疫及细胞免疫能力和抗病能力39。其缺点是环境抗逆性差，不耐氧和高温，75-80约5min，损失超过70%。Gildberg等40(1995)用具有较强致病性的弧菌菌种感染分泌乳酸的广不肉杆菌投喂大西洋鳕幼苗,幼体的抵御病菌的能力显著提高,而且生存至三个星期的幼苗肠道内菌群里分泌乳酸的菌株微生物群中占明显优势。王丽娟41在对鱼的试验表明:用乳酸菌投喂养殖动物，使其黏附于宿主肠道,能够抵御革兰氏阴性感染菌的侵染。邹向阳等42用双歧杆菌在中国对虾幼苗养殖过程当中进行试验,结果显示，使用制剂的中国对虾虾苗的成活率提高了55%-60%,并且加快了对虾幼苗的生长发育速度、促进了对虾对饵料的摄入量和抗病免疫能力。2.1.4 硝化细菌和反硝化细菌硝化细菌(Nitrobacteria)是一类能利用氨及亚硝酸盐作为氮源，CO2作为碳源，从氨氧化过程中获得能量的化能自养型细菌，为革兰氏阴性，包括硝酸菌属和硝酸菌属。硝化细菌在氮的转化过程中可将对水体及水产动物有害的亚硝酸盐转化为无害的可被吸收的硝酸盐,另外硝化细菌在生长过程中可同化和异化硫化氢,进而净化水体环境、改善鱼虾池底底泥、保持水产动物良好的生长环境43。反硝化细菌(Denitrify Bacteria)是一种可以使用硝酸盐和亚硝酸盐作为氮源，水体含碳物质作为碳源的兼性厌氧型细菌。主要生存于池塘底泥,可以把底泥中的硝态氮转化为无毒的氮气而不是铵态氮排出池塘，其制剂多用于水产养殖中池塘低质亚硝酸盐偏高和藻类过度繁殖的处理。2.1.5 酵母菌酵母菌（Yeast）是一种可以在有氧或缺氧条件下分解糖类的单细胞真菌，可快速减少水生动物耗氧量。酵母菌属存在于动物肠道内的量也是非常之少，但却能够影响肠道内环境和微生物群落的结构,促进乳酸菌等益生菌的生长及活力,提高整个肠道对饵料中营养成分的消化、吸收和利用能力,进而增加养殖动物的食入量,提高养殖效益。酵母菌还能与有害菌形成竞争机制,抑制有害菌的占位定植和生长繁殖。而且酵母菌菌体富含氨基酸、维生素、核酸和各种活性酶类，为水产动物所利用。另外，酵母菌细胞壁能够激发、增强水产动物免疫功能，维持有益菌群的生态平衡，从而预防疾病的发生44。目前常用的菌株多分离自鱼体表面。其不足之处是耐热性较差，60-70/h即死亡。Macey等从鲍鱼机体中培育得到了两株酵母菌和一株细菌（分别为SS1、AY1和SY9），把含有这三种菌的益生菌制剂添加到饲料中，养殖8个月之后，原本20mm的小鲍鱼的生长速率提高了8%，67mm的大鲍鱼的生长速率提高了34%；致病弧菌的侵染实验结果显示，加入EM菌的鲍鱼存活率达到62%，未加入的空白组鲍鱼存活率则为25%45。2.1.6 EM菌EM菌是由多种益生菌复合而成的微生物群体,不同的益生菌相互影响相互作用，促进水产动物肠道内微生态系统的平衡。EM中的益生菌通过固氮、光合等作用,可将水中的有机质转化为能被水产动物吸收利用的营养元素,促进水产动物的生长繁殖,还能提高水中的溶氧量,降解氨、硫化氢等有害物质,促进水产动物水体环境的微生态平衡。同时EM菌在肠道内通过黏附及位点的占据，达到抑制大肠杆菌等致病菌的生长繁殖的作用,提高肠道对营养物质的吸收率,降低排泄物中的氨氮含量,从而净化水域、提高养殖动物的生长性能，增加养殖效益46。阎斌伦47在中华绒螯蟹育苗中选择EM微生态制剂,在实验组中分别添加不同剂量的EM制剂，实验结果表明，实验组水中亚硝酸盐含量下降37.50%,氨氮含量比空白组降低39.44%,换水量降低85%,用药量降低50%以上。王平等48用EM菌制剂对3种常见藻类进行试验，试验结果显示EM菌可显著妨碍盘星藻、衣藻及四尾栅裂藻的发育和繁殖，其数目平均下降率分别为4680%，9717%和9907%。吴桂玲等49利用微生态制剂对花鲈的实验显示，实验组花鲈的头肾巨噬细胞数目明显高于空白组，攻毒试验中，空白组花鲈最先开始消亡，结果表明试验组免疫和抵抗能力远远高于对照组。张玲华等50用由芽孢杆菌、硝化细菌和假单胞菌混合而成的EM菌处理池塘,发现其可明显分解池塘水中残余饲料,还对藻类的生长繁殖产生积极的影响,从而提高水中的溶氧量，促进水产动物的生长。2.2 主要益生元在水产养殖中的应用2.2.1 低聚糖低聚糖是指含多个糖苷键聚合而成的化合物，又称寡糖，包含功能性和普通型低聚糖两种。其中，功能性低聚糖难以直接被宿主吸收，但能够特异性地增殖优势种群微生物，同时也可以抑制致病菌，提高机体的免疫能力。这类寡糖包括果寡糖（Fructooligosaccharide，FOS）、甘露寡糖（Mannanoligosaccharides，MOS）、木寡糖（Xylo-oligosaccharide，XOS）和壳寡糖（Chitosan oligosaccharide，COS）等。据报道，实验已经证实双歧杆菌微生态制剂中增添低聚糖后，其作用比对照组提升10-100倍.王艳等经过试验证明，在基本饵料中果寡糖的加入浓度为1g/kg时能够显著提升银鲫的免疫特性及抵御病菌能力，具体体现在白细胞吞噬活性和补体C3等的含量明显高于对照组，而且果寡糖只有在适宜的用量范围内才能产生良好的效果51。蔡雪峰等在虹鳟饵料中加入壳寡糖，试验表明虹鳟肠道内的优势微生物产生了显著改变，能够使用壳寡糖作为仅有的碳源的菌种增多了，不过菌群的种类部分减少52。菌群组成不仅与水体环境相关，而且与寡糖的多少相关，并且抗感染实验结果显示，壳寡糖可以提升虹鳟幼鱼抗嗜水气单胞菌侵染的活力。孙立威等对罗非鱼的试验结果与以上结论相似，试验还表明，当加入0.50%壳寡糖时，幼苗的增重率比空白组提升了大约30%53。另外，木寡糖和甘露寡糖也可以显著促进鱼虾生长特性，完善肠道功能，增强营养成分吸收率和宿主非特异性免疫能力。然而，黄燕华等对凡纳滨对虾的研究却表明，加入低聚木糖对对虾生长及增重都没有明显作用，虽然可以在一定程度上提高对虾肠道内蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，不过提高程度较低54。2.2.2 多糖多糖是由许多单糖脱水缩合而来，是一种构造繁杂并且巨大的糖类。其中具备益生菌生物活力的多糖主要包含脂多糖、肽聚糖、葡聚糖、真菌多糖等，此类复合糖类能够促进养殖机体增强宿主免疫能力，抵御致病菌的感染.康洁将提取纯化的大肠杆菌细胞壁脂多糖注射到草鱼身体内，结果证明脂多糖可以使试验动物血液中白细胞的数目显著增加，增强机体非特异性免疫性能55。王秀华等在对虾养殖池的实验结果表明肽聚糖可以增强虾体的抗病能力，投喂组对虾的发病率为0-40%，而未投喂肽聚糖的对虾发病率高达80%-100%56。宋晓玲等将双歧杆菌肽聚糖加入到日本对虾和牙鲆体中，证实肽聚糖可明显增强血清酚氧化酶和溶菌酶活性，可增强养殖对象的自身免疫能力和抗病能力57。此外，很多试验都证明壳聚糖能显著增强养殖动物肠道中的溶菌酶活力并且增加它们的存活率，增强养殖对象的免疫及抗病能力。另外，虫草多糖可当做一类膜外糖蛋白，也能够提高养殖对象的非特异免疫能力和抵御致病菌的能力。2.3 主要合生素及其在水产养殖中的应用合生素（Synbiotics）又称合生元，是指益生菌（Probiotics）与益生元（Prebiotics）结合的混合制剂，具备同时发挥益生菌和益生元作用的特点.肖世玖等用三种合生元饲养团头鲂的实验结果证明，由低聚木糖和芽孢杆菌混合的合生素可以将团头鲂的生长性能提升大约44.94%，同时增强血清抗氧化能力，还可以改进肠道形态和肠道内菌群的平衡58。3 微生态制剂存在的问题由于微生态制剂的研究与应用历史较短，人们对微生态制剂的认识还有所欠缺，许多制剂的应用都是在不断的摸索道路上，缺乏系统的研究很理论依据。虽然市场上已有大量产品，但大都是单一菌种制剂，其应用效果也比较单一，稳定性和重复性差，还难以取代抗生素的使用，产品的质量、效果等也都良莠不齐。微生态制剂在水产动物的应用上已取得了某些成果，有非常大的使用潜力，存在巨大的开发空间和开发价值，但实现大规模产业化，仍需要大量的研究投入。目前已确认的可用于微生态制剂的种类较少，难以满足不同水产动物和不同养殖环境的需求，需要开发新品种。复合微生态制剂的应用效果较好，但是针对不同对象和环境需用不同的制剂，其研发和应用仍需大量的研究和实验数据的积累。对微生态制剂的作用机制研究不够深入透彻，虽然已经逐渐发展成为相对独立的体系，但缺乏系统总结，理论基础知识的建设仍有待完善。对菌种安全性认识不足，益生菌在经过一系列的加工过程之后，可能会产生变异产生致病性或其他对宿主和环境不利的菌种，同时可能对肠道菌群及水环境微生态平衡产生负面影响。目前很多微生态制剂都缘于对陆生养殖动物的设计，应用于水产动物的时间较短，有的菌株对水产动物的生长特性和水体环境适应性较差59。微生态制剂产品质量难以保证，如何提高单位制剂中活菌的数量，增强菌种对环境的耐受性，延长产品保质期，成为困扰许多研究工作人员的难题。生产技术有待提高，不同制剂需要不同的生产条件，需研究新的制作方式，加大生产流程和生产工艺的研究力度，以提高菌体的质量、存活率、有效时长及应用效果。微生态制剂的添加难以做到定性定量。由于各养殖条件和相关因素存在差异，对制剂的需求种类、数量也不尽相同，在实际应用中不一定能够取得应有的效果。另外，水生环境的转换，使得对制剂微生物的生长、增殖和平稳性难以把握，加大了应用的难度。产品大多缺乏针对性，产品种类单一，难以满足不同水产动物的需求，如鱼类、贝类、虾蟹类等其消化系统都有自身的特殊之处，对菌剂有不同的要求。就蟹类而言，淡水蟹和海水蟹的肠道优势菌群也有很大不同之处。在水产动物的不同生长阶段，肠道正常菌群也存在差异。另外水产动物生长水体状况复杂多样，受许多因素的影响，需加快微生态制剂的适用种类、适用阶段和适用情况的研究，才能更好的发挥微生态制剂的应有的效果。行业不够规范，产品质量参差不齐，检测标准还有待完善，相关法律法规的设定及实施细则仍需逐步建立。需尽快制定统一的行业标准，规范企业行为。4 水产动物微生态制剂的发展趋势及展望4.1 向专一性制剂方向发展一种菌株不可能适用于所有的水产动物，只有一类的菌种也难以达到不同水产动物和水体环境的要求，应利用多菌株多功能的微生态制剂来实现水产动物的各种需求。专研开发适用一类宿主、一定时期、一些特定病害的个性化微生态制剂，实现使用对象专一化，将能大大提高应用成效。因此应先搞清养殖动物机体内缺乏的微生物，然后加入一些针对性强的微生态制剂，提高制剂的专一性、高效性。4.2 提高制剂包被等加工技术针对乳酸菌等耐受性较弱的菌株,利用质优价廉的新型双层包被技术制成目的制剂。另外，包被技术可增加制剂的作用周期，从而提高养殖经济效益。随着基因工程和分子生物学的发展,包被技术、微胶囊技术和缓释工艺等新技术将不断成熟,微生态制剂在水产养殖业中将有着更加广阔的应用前景。4.3 深入研究微生态菌种的耐药机制研究发现菌株耐药因子不仅可以将耐药性遗传给后代同种菌体，还可转移到不同种、不同属的菌体中。所以，必须对耐药微生态菌种的耐药机制进行深入系统的研究，充分认识其潜在的危害，为微生态制剂的安全使用提供理论依据。4.4 工程菌领域方向发挥分子生物学和基因工程技术构造更易于黏附、定植、繁殖、生产和具有耐热、耐酸等特殊功能的工程菌制剂，如抗病毒工程菌既是在肠道内微生态制剂可做为免疫蛋白定植于肠道内保护机体，使宿主免除某种病原的侵害，这将成为解决水产动物病毒性或流行性疾病问题的重要解决方式之一60。可改造菌种性能，可通过导入目的基因如疫苗基因、必需氨基酸合成酶基因和可分泌活性物质基因等，或去掉产生对宿主不利物质的基因，将使微生态制剂的应用效果和应用范围大大提高，其应用前景也将更加广阔。4.5 产业规模化生产工艺的完善目前微生态制剂产业生产上规模化不够，应加快规模化生产条件下生产工艺流程方面的研究，制定统一的产品生产质量标准，促进微生态制剂产业的快速发展。相信随着高密度发酵工艺的发展和其他生产工艺的提高及一系列生产条件的进步，微生态制剂将取代抗生素迎来一个光明的未来，水产养殖业也将走向绿色的可持续发展的道路。致 谢本研究及学位论文是在我的导师陈营老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。陈老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向陈老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。我还要感谢在一起愉快的度过毕业论文小组的同学们，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!参考文献1 刘晓红，缪礼鸿. 微生态制剂在水产养殖中的应用J. 武汉工业学院学报, 2012, 31(2), 24-26.2 康白. 微生态学原理M. 大连:大连出版社, 1996. 91-121.3 丁丽,周维仁,章世元,等. 益生菌在水产上的应用及其对鱼类肠道菌群的影响J. 饲料工业， 2009, 30(20), 27-30.4 齐红莉,吴垠,桂远明. 微生态制剂对水产养殖动物的抗病和促长机理的研究进展J. 天津农学院学报, 2004, 11(2), 36-41.5 LILLY D M, STILLWELL R H. Probiotic: growth promoting factors produced by microorganisms J. Science, 1965,174, 747-748.6 Parker R B. 1974. Probiotics, the other half of the antibiotics story J. Anim. Nutr.Health, 29, 4-8.7 Kozasa M. Toyocerin (Bacillus toyoi) as growth promoter for animal feeding J. Microbiol Aliment Nutr, 1986(4)B, 121135.8 Fuller R. 1989. Probiotics in man and animals, a reviewJ. J.Appl.Bacteriol., 66, 365-378.9 Moriarty D J W. 1998. Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture pondsJ. Aquaculture, 164, 351-358.10 Gatesoupe F J.1999. The use of probiotics in aquacultureJ. Aquaculture, 180, 147-165.11 杨欣,陈丽仙,吴雅琨,等. 动物微生态制剂的发展现状及应用前景J. 安徽农业科学, 2011, 39(7), 4030-4031,4042.12 陈祈磊,胡又佳. 动物微生态制剂研究应用进展J. 中国微生态学杂志, 2009, 21(9), 857-859.13 VERSEHUERE L,ROMBAUTG,SORGELOOS P, et a.l Probiotic bacterie as biological control agents in aquacultureJ. MicrobiolMol Biol R, 2000,64, 655-671.14 Zhao ZF (赵宗蕃). Applicationse and prospect of micro ecological preparationJ. 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