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蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀聿莀袈膅蒈荿蚈肈莄莈螀芄芀莇袂肆膆莆羅衿蒄莅蚄肅莀蒅螇袇芆蒄衿肃膂蒃蕿袆膈蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羅膀艿葿蚅羂膅葿螇膈肁薈袀羁荿薇蕿膆芅薆蚂罿芁薅袄芄膇薄羆肇蒆薃蚆袀莂薃螈肆芈薂袁袈膄蚁薀肄肀蚀蚃袇莈虿螅肂莄蚈羇袅芀蚇蚇膀膆蚇蝿羃蒅蚆袁腿莁蚅羄羂芇螄蚃膇膃莀螆羀芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿螈节芈袈袁肅薆袇肃芀薂袆膅膃蒈袅袅莈莄蒂羇膁芀蒁聿莇蕿蒀蝿膀蒅蕿袁莅莁薈羄膈芇薈膆羁蚆薇袆芆薂薆羈聿蒈薅肀芄莄薄螀肇芀薃袂芃薈蚂羅肅蒄蚂肇芁莀蚁袇肄莆蚀罿荿节虿肁膂薁蚈螁莈蒇蚇袃膀莃螇羅莆艿螆肈腿薇螅螇羁蒃螄羀膇葿螃肂肀莅螂螂芅芁螁袄肈薀螁羆芄蒆袀聿肆莂衿 环境工程微生物学 绪论二、环境工程微生物学的研究对象与任务 微生物的形态、细胞结构及其功能,微生物的营养、呼吸、物质代谢、生长、繁殖、遗传与变异等基础知识; 讲述栖息在水体、土壤、空气、城市生活污水、工业废水和城市有机固体废弃物生物处理和废气生物处理中的微生物及其生态; 饮用水卫生细菌学; 自然环境中物质循环与转化; 水体和土壤的自净作用; 污染水体治理、污染土壤的修复等环境工程净化的原理。 环境工程微生物学的研究任务 充分利用有益微生物资源为人类造福。 防止、控制、消除微生物的有害活动,化害为利。1、微生物(microorganism、microbe)指肉眼看不见的、必须借助于显微镜才能看到的微小生物。 分类级别命名规则:二名法,由两个拉丁字即一个属名和一个种名组成,用斜体表达。Escherichia coli,大肠埃希氏杆菌 (E.coli) Bacillus subtilis,枯草芽孢杆菌 Staphylococcus aureus ,金黄色葡萄球菌 Sacharomyces cerevisia,酿酒酵母 Aspergillus niger,黑 曲 霉 Penicillim notatum,点 青 霉 没有鉴定到种,可以只有属名: Bacillus芽孢杆菌属,或者写成Bacillus sp.(spp.) 微生物的特点(小、简、低) 小(个体微小) 微米级:光学显微镜下可见(细胞) 纳米级:电子显微镜下可见(细胞器、病毒) 简(构造简单) 单细胞、简单多细胞、非细胞(即“分子生物”) 低(进化地位低) 原核类:细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体和蓝细菌 真核类:真菌(酵母、霉菌)、原生动物和显微藻类 非细胞类:病毒、亚病毒(类病毒、拟病毒、朊病毒) 3. 微生物的五大共性 体积小,面积大巨大的营养物吸收面、代谢废物的排泄面和环境信息的接受面 吸收多,转化快 生长旺、繁殖快代时(generation time):细胞分裂一次所需时间。 适应强,易变异变异性:最基本的变异形式是基因突变,可以涉及到任何性状,如 形态构造、 代谢途径、 生理类型、 各种抗性、 抗原性 以及代谢产物的质或量的变异等 分布广、种类多种类多 代谢类型多: 营养类型多样性(分解天然气、石油、纤维素、木质素); 产能方式多样性和灵活性(细菌光合作用,嗜盐菌紫膜的光合作用,自养细胞的化能合成,各种厌氧途径); 生物固氮; 产生次生代谢产物; 对复杂有机分子的生物转化能力; 独特的繁殖方式等等 代谢产物多样性 微生物种数多微生物学促进了农业的进步 以菌治虫(微生物农药) 以菌增肥(微生物肥料) 以菌促长等(如赤霉素) 以菌当饲料(单细胞蛋白)对生态与环境保护的贡献 食物链中的主要环节、 污水处理中的中心角色、 生态农业中的重要措施及自然界物质循环中的关键作用第一章 微生物的形态和构造(一)原核微生物 微生物根据其不同的进化水平和形状上的明显差别可分为原核微生物、真核微生物和非细胞微生物三大类群。 原核微生物: 细菌、 放线菌、 蓝细菌、 支原体、 立克次氏体 衣原体细菌:是一类细胞细而短(细胞直径约0.5m,长度约0.55 m)、结构简单、细胞壁坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性比较强的原核微生物。 细菌的形态基本上只有三大类: 球状、杆状、螺旋状螺旋菌(spirilla) :细胞呈弯曲杆状的细菌统称为螺旋菌。弧菌、螺菌、螺旋体 螺旋不满一周称为弧菌, 满26环的称为螺菌, 6环以上称为螺旋体。Gram stain革兰氏染色法准备:拭净玻片。 以无菌操作制作涂片,干燥,热固定后备用。 1. 初染:結晶紫染色1分钟。水洗去掉浮色。 2. 媒染:碘液(碘-碘化钾)染色1分钟。3. 脫色:以95%乙醇脱色10-30sec,革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色,革兰氏阴性菌被褪色呈无色。4. 复染:以番紅复染1分钟,革兰氏阳性菌仍呈紫色,革兰氏阴性菌呈现红色。革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌即被区别开来。革兰氏染色注意事项1革兰氏染色成败的关键是脱色时间,如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须 严格把握脱色时间。 2 选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜,若细菌太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。(二)原核生物细胞的结构和功能 细胞壁是包在细菌细胞表面、内侧紧贴细胞质膜的较为坚韧并略具弹性的结构,其厚度在1080 nm之间。 化学组成:主要成分是肽聚糖(肽聚糖是由两种氨基糖和氨基酸组成的一个坚韧的多聚体结构) 共有组分 肽聚糖 革兰阳性菌 聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥 三维立体结构,坚固1550层 革兰阴性菌 聚糖骨架、四肽侧链 二维平面结构,疏松 12层1、细胞壁功能:细菌细胞壁的生理功能有:1)保护原生质体免受渗透压引起破裂的作用;2)维持细菌的细胞形态(可用溶菌酶处理不同形态的细菌细胞壁后,菌体均呈现圆形得到证明);3)细胞壁是多孔结构的分子筛,阻挡某些分子进入和保留蛋白质在间质(革兰氏阴性菌细胞壁和细胞质之间的区域);4)细胞壁为鞭毛提供支点,使鞭毛运动。革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌细胞壁成分比较成分 占细胞干重的% 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 肽聚糖 含量很高(3095) 含量很低(520) 磷壁酸 含量较高(50) 0 类脂质 一般无(2) 含量较高(20) 蛋白质 0含量较高 革兰氏染色机理 革兰氏染色是基于细菌细胞壁特殊化学组分基础上的一种物理原因。 通过初染和媒染操作后,在细菌的膜或原生质体上染上了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密,故在用乙醇脱色时,肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩,再加上它基本不含类脂,故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙,因此结晶紫与碘的复合物会牢牢阻留在其细胞壁内,使其呈现紫色。 反之,革兰氏阴性菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散,故遇乙醇后,肽聚糖网孔不易收缩,加上它的类脂含量高,所以当乙醇把类脂溶解后,在细胞壁上就会出现较大的缝隙,这样结晶紫与碘的复合物就极易被溶解出细胞壁,因此,通过乙醇脱色后,细胞又呈无色。这时,再经番红等红色染料进行复染,就使脱色的革兰氏阴性细菌呈粉红色,而革兰氏阳性细菌则仍保持第一次的染色结果-紫色(实为紫中带红)。2、细胞膜 质膜的组成及结构:由磷脂分子和蛋白质组成 双层膜结构 质膜的功能 控制细胞内外的物质运送、交换 渗透屏障的功能(维持细胞内正常渗透压) 参与细胞壁(肽聚糖、磷壁酸)和荚膜的生物合成 参与能量的产生。(氧化磷酸化和光合磷酸化) 许多酶和电子传递链组分的所在部位 与细菌的运动有关:为鞭毛的着生点,并为其提供运动所需能量 间体(mesosome) 由细胞质膜内陷而成的一种管状的、层状或囊状的结构,一般位于细胞分裂部位或其邻近,功能主要是促进细胞间隔的形成并与遗传物质的复制及其相互分离有关。3、细胞质及内含物 细胞质:包含在细菌细胞质膜以内除核质体外的一切透明、胶状、颗粒状物质可总称为细胞质。 细胞内含物:其主要成分为核糖体、贮藏物、各种酶类、中间代谢物、载色体和质粒等,少数细菌还存在梭化体、伴孢晶体或气泡等构造。核糖体(ribosome):细胞质区存在大量直径在10nm,沉降系数为70s的颗粒,称为核糖体,它们由核糖核酸(rRNA)和蛋白质组成。功能:核糖体是蛋白质合成的场所。每个细菌细胞约含500050000个核糖体 细菌核区DNA以外的,可进行自主复制的遗传因子,称为质粒(plasmid)。质粒是裸露的环状双链DNA分子,所含遗传信息量为2200个基因,能进行自我复制,有时能整合到核DNA中去。质粒DNA在遗传工程研究中很重要,常用作基因重组与基因转移的载体。细菌细胞质中的内含物 内含物存在于组成功能非单位膜被包裹的聚-羟基丁酸(PHB)许多细菌主要是PHB贮备碳和能源硫滴H2S氧化细菌和紫硫光合细菌液状硫能源气泡许多水生细菌罗纹蛋白膜浮力糖原许多利用碳氢化合物的细菌碳氢化合物碳源和能源磁石体许多水生细菌磁铁颗粒趋磁性无膜包裹的异染粒许多细菌无机偏磷酸聚合物贮藏磷元素和能量藻青素(cyanophycin)许多蓝细菌精氨酸和天冬氨酸的多肽氮源4.核质体(nucleoid)细菌核质体含有一个大型环状的双链DNA分子,长度为0.253mm。核质体式负载细菌遗传信息的物质基础。5、特殊结构 荚膜 鞭毛 菌毛(菌须) 芽孢 (1)、荚膜 在一定营养条件下,部分细菌能够向细胞外分泌一些胶粘性的物质,并附着在细胞的表面,这类物质称之为荚膜。 不同细胞的荚膜连在一起,形成一个内含多个菌体胶团,称菌胶团。a.荚膜的组分:多糖和多肽或蛋白质,尤以多糖居多。b.荚膜的主要功能: 病原菌的荚膜与致病能力有关。(如S型肺炎链球菌) 荚膜使细胞免受干燥的危害,保护致病菌免受宿主吞噬细胞的吞噬。 贮藏养料,当营养缺乏时,可被用作碳源和能源,有的可作氮源。 水处理中,细菌荚膜对废水中的物质有生物吸附作用。可使细菌附着于适当表面。(2)、鞭毛 形态:鞭毛是从细胞膜内长出(主要由鞭毛蛋白构成)穿过壁伸出体外,形成细长的丝 。 功能:细菌细胞运动的器官 类型:根据鞭毛着生位置和数目分为三种,端生 、周生 、侧生 。 鞭毛在实践中的意义是作为菌种分类鉴定中的重要指标。鞭毛的观察: 电镜: 光学显微镜: 用染料加粗鞭毛可观察到;暗视野,水浸片 半固体穿刺培养 从固体培养基上的菌落形态判断: 菌落形状大,薄且不规则,边缘极不平整,可能有鞭毛。 菌落十分圆滑,边缘平整且相对较厚,可能没有鞭毛。(3)、菌毛 菌毛(pillus, fimbria) , 是长在细菌体表的一种纤细、中空、短直、数量较多(250-300)的蛋白质附属物。在革兰氏阴性菌种常见。结构较鞭毛简单,功能是使细菌较牢固地粘连载物体表面上。(4)、芽孢 在一定的生长阶段,细菌细胞内形成一个球形或卵形的、具有厚壁结构,并处于休眠状态的物质,这种物质称为芽孢(endospore, spore)。 功能:抵抗逆境 芽孢有极强的抗热能力 抗辐射、 抗化学药物 抗静水压 极强的休眠能力芽孢有多层结构,主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心. 芽孢的外壁层厚而致密,主要成分为脂蛋白,通透性差,不易着色。 芽孢衣:含疏水性角蛋白,抗酶解、抗药物 皮层主要含芽孢肽聚糖、 DPA( 2,6吡啶二羧酸)Ca,皮层体积大,比较致密,含水量70%。 核心含有大量的DNA、RNA、蛋白质等物质,还含有DPA,DPA是芽孢特有的成分。 平均含水量低,约40%.芽孢的特性: 具有很强的抗热、抗干燥、抗辐射、抗化学药物能力。 含水量低、壁厚而致密,通透性差,不易着色。 新陈代谢几乎停止,处于休眠状态。 一个芽孢萌发产生一个个体。芽孢的抗热机制:目前尚不清楚,但可能与以下因素有关,如含水量低、壁厚而致密,芽孢中的酶分子量小,比较耐热。少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时,会在芽孢旁形成一颗菱形或双椎形的碱溶性蛋白晶体,称为伴孢晶体。在芽孢杆菌属(Bacillus)中,为人类研究最深入最广泛的是Bacillus thuringensis(苏云金芽孢杆菌)。 B.thuringensis 的伴孢晶体对许多鳞翅目、双翅目和鞘翅目等200多种昆虫和动、植物线虫有毒杀作用,因此可将这类细菌制成对人畜安全、对害虫的天敌和植物无害,有利于环境保护的生物农药(“Bt”细菌杀虫剂)。二、细菌的群体(菌落)的形态 菌落(colony):以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。 如果细菌是由一个单细胞发展而来的,它就是一个纯种的细胞群或克隆(clone)。 如果将某一纯种的大量细胞密集地接种到固体培养基表面,结果长成的各个“菌落”相互联接成一片,这就是菌苔(lawn)。细菌菌落的特征一般都较小,菌落与培养基结合不紧密,用接种针容易挑起,多数表面较光滑、湿润、较粘稠,质地均匀,色泽多样。无鞭毛、不能运动的细菌尤其是各种球菌来说,随着菌落中个体数目的剧增,只能靠“硬挤”的方式来扩大菌落的体积和面积,就形成了较小、较厚、边缘极其圆整的菌落。长有鞭毛的细菌:菌落大而扁平、形状不规则和边缘多缺刻,运动能力强的细菌还会出现树根状甚至能滑动的菌落。有荚膜的细菌:菌落十分光滑,并呈透明的蛋清状,形状较大。在半固体培养基中的培养特征 用穿刺接种技术将细菌接种在0.3%0.5%琼脂培养基中,根据细菌的生长状态可判断细菌的呼吸类型和鞭毛有无。 细菌在培养基的表面及穿刺线上部生长为好氧菌;沿穿刺线自上而下生长者为兼性厌氧菌;如只在穿刺线的下部生长为厌氧菌。 只沿穿刺线生长者没有鞭毛;穿透培养基扩散生长者有鞭毛。细菌悬液的稳定性 细菌分为S型(光滑型)和R型(粗糙型)。 S型菌悬液很稳定,整个菌体为亲水的,均匀分布在培养液中,不发生凝聚。 R型菌悬液很不稳定容易发生凝聚而沉淀在器皿底部,培养液很清。 分布状态取决于细菌表面的解离层、亲水基和疏水基的比例及平衡 活性污泥中R型细菌的数量占优势为好第二节 放线菌放线菌是一类呈丝状生长、主要以孢子繁殖和陆生性强的原核生物。放线菌都呈革兰氏染色阳性分布在含水量较低、有机物丰富和呈微碱性的土壤环境中。常用的抗生素绝大多数都是放线菌的产物。大部分放线菌为腐生菌; 弗兰克氏菌属为内共生固氮菌;少数是寄生菌 (对人及动植物构成危害)。放线菌有很强的分解纤维素、石蜡、琼脂、角蛋白和橡胶等复杂有机物的能力,在自然界物质循环和提高土壤肥力等方面有重要作用。一、放线菌的形态构造 放线菌的形态比细菌复杂些,但仍属于单细胞。在显微镜下,放线菌呈分枝丝状,我们把这些细丝一样的结构叫做菌丝(mycelium) 菌丝直径与细菌相似,小于1微米。菌丝细胞的结构与细菌基本相同。菌丝一般无隔。 根据菌丝形态和功能的不同,放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群,其形态如下图所示。二、放线菌的繁殖放线菌没有有性繁殖,主要通过形成无性孢子方式进行无性繁殖,成熟的分生孢子或孢囊孢子散落在适宜环境里发芽形成新的菌丝体;另一种方式是菌丝体的无限伸长和分枝,在液体振荡培养(或工业发酵)中,放线菌每一个脱落的菌丝片段,在适宜条件下都能长成新的菌丝体,也是一种无性繁殖方式。1、孢囊孢子在气生菌丝顶端或基丝顶端膨大成孢子囊,囊中形成孢子。2、横隔孢子3、分生孢子三、放线菌的菌落 干燥、不透明,表面呈紧密地丝绒状,上有一层色彩鲜艳的干粉; 菌落和培养基的连接紧密,难以挑取; 由于基内菌丝和孢子常有颜色,使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。第四节古菌古菌的分类产甲烷菌(Methanogenus)嗜热嗜酸菌(Thermoacidophiles):包括生硫酸还原菌和极端嗜热古菌。大多数种是硫代谢菌。极端嗜盐菌(Halophiles)第五节 支原体、立克次氏体和衣原体一、支原体(Mycoplasma) 支原体:是一类无细胞壁的原核生物,也是整个自然界中尚能找到的能独立营养的最小型生物。 支原体与人类的关系时害明显大于利。许多支原体引起动植物病,一些腐生的支原体分布在污水、土壤和堆肥中;在受污染的组织培养液中,也能找到。目前已知的种类已超过80种。支原体的特点 直径约为150-300nm 缺乏细胞壁 菌落小,呈“油煎蛋”状 二等分裂方式繁殖 能在含血清、酵母膏或胆甾醇等营养丰富的人工培养基上独立生长 具有好氧或发酵型产能代谢 对四环素、红霉素、新霉素、卡那霉素及毛地黄皂苷敏感二、立克次氏体 是一类只能寄生在真核细胞内的革兰氏阴性原核微生物。 有细胞壁,不能进行独立生活,细胞较支原体大,无过滤性,合成能力较强,不形成包涵体。 可使人患斑疹伤寒、姜虫热或Q热等传染病。由节肢动物携带,一般寄生在它们的消化道上皮中。立克次氏体的特点 大小:0.3-0.60.8-2 um,光学显微镜可见细胞形态多变 有细胞壁,革兰氏阴性 在真核细胞内专性寄生 二等分裂方式繁殖 对四环素、青霉素等敏感 有不够完整的代谢途径,大多能利用谷氨酸产能而不能利用葡萄糖 一般可用鸡胚、敏感动物或合适的组织培养物来培养 对热敏感,一般56以上经30分钟即可杀死三、衣原体 衣原体是一类在真核细胞内营专性能量寄生的小型革兰氏阴性原核生物。 衣原体有特殊生活史,具有感染力的个体称为原体(elementary body),是一种不能运动的球形细胞。在宿主细胞内,原体逐渐伸长,形成无感染能力的个体,称为始体(initial body)。衣原体的特点 有细胞构造 细胞内同时含有DNA和RNA 有革兰氏阴性菌特征的含肽聚糖的细胞壁 细胞内有核糖体 有不完整的酶系统, 严格细胞内寄生 以二等分裂方式繁殖 对抗生素和磺胺药敏感 衣原体可培养在鸡胚卵黄囊膜、小白鼠腹腔、组织培养细胞或Hela细胞上第二章真核微生物凡是细胞核具有核膜、能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器的微小生物就称真核微生物。真核微生物包括:真菌(酵母菌、霉菌和大型真菌)显微藻类(含光合色素,能营自养生活 )原生动物和微型后生动物(无较坚韧的细胞壁,个体柔软,多以微小生物为食 )原核生物与真核生物的区别 核: 细胞器: 细胞分裂方式:真菌是一类低等的真核生物,有五个特点: 不能进行光合作用 以产生大量孢子进行繁殖 一般具有发达的菌丝体 营养方式为异养吸收型 陆生性较强酵母菌的特点: 个体多以单细胞状态存在; 多数出芽生殖,也有裂殖; 能发酵糖类产能; 细胞壁常含甘露聚糖; 喜在含糖量较高的偏酸性环境中生长。 其细胞直径比细菌粗10倍,例如典型的酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces. Cerevisiae)细胞宽为2.5-10 m,长为4.5-21 m。光学显微镜下可模糊看到它们细胞内种种结构分化。1、细胞壁-在细胞的最外层,幼龄时较薄,具有弹性,随菌龄增加变硬变厚,形成厚25nm的坚韧结构,约占细胞干重的25%。细胞壁具3层结构(呈“三明治”结构):外层为甘露聚糖,内层为葡聚糖,中间夹着一层蛋白质。葡聚糖是赋予细胞壁机械强度的主要成分,在出芽周围还含有几丁质。2、细胞膜-位于细胞壁内侧,厚约7nm,结构与原核微生物相似,电子显微镜下呈3层结构。 主要成分为蛋白质(约占细胞膜干重的50%)和类脂(约占40%),少量糖类。酵母细胞膜上的类脂中含有甾醇,其中麦角甾醇居多,经紫外线照射形成维生素D2。细胞膜主要功能:1、选择性的运入营养物质,排除废物2、细胞壁等大分子物质合成和装配基地3、酶合成和作用的场所3.细胞质位于细胞质膜内的透明、粘稠、不断流动并充满各种细胞器的溶胶,称为细胞质 。在细胞质中悬浮着所有的细胞器,如内质网、核糖体、溶酶体、微体、线粒体、叶绿体等。由微管和微丝构成了细胞质的骨架。细胞骨架为细胞质提供了一些机械力,维持了细胞器在细胞质中的位置。细胞质内含有丰富的酶蛋白、各种内含物以及中间代谢物等,是细胞代谢活动的重要基地。1)内质网: 是存在于细胞质中折叠的膜系统。内质网的主要成分是脂蛋白,但游离蛋白和其他物质有时也合并到内质网上,且时常被核蛋白体附着形成粗糙型内质网,功能是合成和运送胞外分泌蛋白。没有被核蛋白体附着在上面的内质网称为光滑型内质网,功能是与脂类代谢和钙代谢有关。2)核糖体 核糖体又称核蛋白体,是细胞质和线粒体中无膜包裹的颗粒状细胞器,具蛋白质合成功能。核糖体主要成分为RNA和蛋白质,直径为20-25nm 。真核细胞的核糖体比原核细胞的大,其沉降系数一般为80S,它由60S和40S的2个小亚基组成。细胞质核糖体有的呈游离状态,有的和内质网及核膜结合。3)高尔基体 高尔基体是一种由若干平行堆叠的扁平膜囊和大小不等的囊泡所组成的膜聚合体,上没有核糖体颗粒附着。高尔基体与细胞的分泌机能有关,是凝集某些酶原颗粒 ( 如消化酶原 ) 的场所,且与细胞膜的形成以及碳水化合物的合成有关。目前高尔基体仅在少数几种真菌中发现。 4)溶酶体 是一种由单层膜包裹、内含多种酸性水解酶的小球形、囊膜状细胞器,主要功能是参与细胞内的消化、维持细胞营养及防止外来微生物或异体物质侵袭的作用。5) 微体 是一种由单层膜包裹、与溶酶体相似的小球形细胞器,主要含氧化酶和过氧化氢酶,其功能可使细胞免受 H2O2 毒害 ,并能氧化分解脂肪酸等。 6)线粒体 线粒体的构造较为复杂,外形囊状,它具有双层膜,外层平整,内层较厚,常向内延伸形成不同数量和形状的嵴。线粒体是含有DNA的细胞器。线粒体的形态、数量和分布常因真菌的种类和发育阶段而异。线粒体是氧化磷酸化作用和ATP形成的场所,是酶的载体,细胞的“动力房”。7)液泡 由单位膜分隔,其形态、大小受细胞年龄和生理状态而变化,一般在老龄细胞中液泡大而明显。液泡中主要含有糖原、脂肪和多磷酸盐等贮藏物,液泡不仅有维持细胞渗透压、贮存营养物等功能,而且还有溶酶体的功能,因为它可以把蛋白酶等水解酶与细胞隔离,防止细胞损伤。 4、细胞核-酵母菌具有真核多孔核膜包裹起来的定形细胞核。在电子显微镜下,可看到核膜是一种双层单位膜,其上存在着大量直径4070nm的圆形小孔,细胞核与细胞质间的物质交换通过该通道进行,核内合成的RNA通过核孔转移到细胞质中,为蛋白质合成提供模板。 酵母细胞核是其遗传信息的主要贮存库。在Saccharomy
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