《PCR技术及应用》PPT课件.ppt

聚合酶链式反应技术及其应用 PCR反应基本原理 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的年轻科 学家Kary.B.Mullis在迥然灵感的启迪下发明了具 有划时代意义的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR），实现了人们在体外无限 扩增DNA片段的梦想。而Saiki首次应用PCR法成功 的扩增了人-珠蛋白DNA，并应用于镰刀状红细 胞贫血的产前诊断。 PCR反应基本原理 Mullis在建立PCR发明的初期，仅采用非常简单的三种温 度水浴进行实验，应用的是大肠杆菌DNA聚合酶的 Klenow片段来催化复性引物的延伸效应。由于该酶会在进 行DNA变性的温度下失活，所以每一轮反应中都要添加一 次酶，扩增片段的长度受到限制，操作繁琐。1988年， Saiki把一种耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）引入PCR 后，PCR技术的应用进入了实用阶段，随后PE-Cetus公司 推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实 。PCR技术在微生物学，遗传病学，肿瘤学和法医学领域 中的应用越来越广，据文献报道PCR技术用于检测病原体 的种类已超过100多种。 PCR反应基本原理 PCR是体外酶促反应合成特异性DNA的一种方法 .它利用人工合成引物介导的DNA聚合酶促反应 ,扩增位于两段已知序列之间的DNA片段.主要 步骤为:人工合成一对寡核苷酸引物，与待扩 增DNA片段两条链的两端分别互补，由高温变 性、低温复性和适温延伸组成一个周期，循环 进行，使目的DNA得以迅速扩增。由此可见， PCR就是在引物介导下反复进行“热变性-复性 -延伸”而扩增DNA的循环过程。 DNA变性及复性图解 PCR原理 PCR原理 变性 PCR原理 复性 PCR原理 延伸 PCR原理 2 变性 PCR原理 2 复性 PCR原理 2延伸 PCR原理 3变性 PCR原理 3复性 PCR原理 3延伸 DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。 预变性(92-95C,2-5m) 变性(92-95C,30s) 复性 (40-60C,30s) 延伸 (72C,30-60s) 总延伸 (72C,7m) (25-35) 经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。 240 16 256 11452228200 短片段（单链 ） 1412108642 长片段（单链 ） 128643216 总片段（单链 ） 循环数 PCR的一般过程： PCR条件的选择 进行PCR反应必须具备以下几个条件： .模板DNA .人工合成的寡核苷酸引物 .合适的缓冲体系 .镁离子 .4种脱氧核糖核苷三磷酸 .耐热DNA聚合酶 .温度及循环参数 PCR条件的选择 模板DNA：PCR反应可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外 扩增，模板DNA的来源及其制备的效率对PCR扩增有重要的 影响。临床检测用模板DNA来源必须根据检测的病原体不 同选择最适部位，以取材方便，待测病原体含量高为原则 。 PCR条件的选择 引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。 引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对 好，引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率 。引物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链 模板的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。 引物的末端核苷酸：引物及引物间3末端不能出现互补，引物间的 互补容易导致引物双链体的出现。 合理的GC含量和Tm值：引物的G+C含量一般要保持在50%左右，Tm值 50%-70%，Tm值低，扩增的特异性下降，若采用太高的退火温度，Tm 值低的引物对可能不发挥作用。 PCR条件的选择 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别 是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩 增条带。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格 要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最 好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好 处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明 显同源性。 引物量： 每条引物的浓度0.11umol，以最低引物量产 生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异 性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 PCR条件的选择 DNA聚合酶 在其它参数最佳时，每100ul反应液中含1-2.5U( 比活性为20U/pmol)Taq DNA聚合酶为佳。然而 ，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变 化。当优化PCR时，最好在每100ul反应体积中加 入0.5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果浓度 太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩增带 ；过低时，则靶序列产量很低。 dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0 7.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使 dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50 200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几 种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又 会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合， 使游离的Mg2+浓度降低。 Mg2+浓度：在PCR体系中随各反应的需要而定，其浓度 是否合适会极大地影响PCR的结果。所以一般要求每一个 反应都预先经过一定的实验（Mg浓度梯度实验）， 以确定本实验的最佳Mg浓度，它是保证DNA聚合酶 具有良好活性的必要条件。 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般 的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓 度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性 降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶 的活性，使反应产物减少。 缓冲液：目前最为常用的缓冲体系为10 50mmol/L Tris-HCL(pH8.3-8.8,20).Tris 是一种双极性离子缓冲液，反应液中有 50mmol/L氯化钾，有利于引物与模板的退 火。高于50mmol/L氯化钾，或50mmol/L氯 化钠，对Taq DNA聚合酶有抑制作用。明 胶或BSA以及非离子去污剂Tween20等， 对Taq DNA聚合酶能起稳定作用。 引物及dNTP的优化 酶及溴酚蓝的优化 PCR反应的最佳模式（CT为例 ） CT DNA PCR最佳反应体系： 反应混合物终浓度 20反应缓冲液1 dNTP混合物200M 引物15pmol 引物15pmol MgCl2溶液2.0mM 无菌去离子水至26l/反应管 取26l反应混合物，加入已经分装的Taq DNA聚合酶1u （固定化的酶）的离心管中， 加入2l待测DNA模板，混匀，铺上石蜡，37保温10分钟，然后进行PCR循环： 94 300秒 94 45秒 55 45秒 35次循环 72 45秒 72 300秒 PCR反应的特点 特异性高：以探测基因为目标，属于“ 病因诊断”，针对性强，对多种传染病， 根据PCR检测结果可以确诊。对于那些目前 尚不能体外培养或难于培养的病原体如梅 毒螺旋体、结核杆菌、乙肝病毒等，采用 PCR检查来确定感染就特别有效 PCR反应的特点 灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（ ELISA）和放射免疫分析（RIA）其灵敏度 分别为ng和pg级，而PCR检测灵敏度可达fg 级，理论上可检出一个细菌或一个真核细 胞的单拷贝基因的存在； PCR反应的特点 简便快速：操作试剂盒时只需将样品简 单处理和加样后即可进行扩增，许多PCR检 查项目在两小时左右即可出报告；对样 品要求低：几乎所有的临床标本都可用于 PCR扩增。 PCR技术的用途 科研使用 临床医学 法医学 个体识别与亲子鉴定 农业 GMO 考古学 人类学 环境保护 PCR应用类型 一、不对称PCR(asymmetric PCR) 不对称PCR的目的是扩增产生特异长度的单链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。 进行不对称PCR有二种方法：(1) 一步法;(2) 两步 法，第一次PCR用等浓度的引物，以期获得较多的目 的DNA片段，取第一次扩增产物(含双链PCR片段)用 单引物进行第二次PCR扩增产生单链DNA。 二、逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT- PCR) RT-PCR先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板 合成cDNA，再以cDNA为模板加入dNTP和两种特异 引物及Taq酶进行PCR反应，这样低丰度的mRNA被 扩增放大易于检测。 RT-PCR中的关键步骤是RNA的逆转录，要求 RNA模板必须是完整的，且不含DNA、蛋白质等杂 质。 RT-PCR图解 三、锚定PCR(anchored PCR, A-PCR) 该法的基本原理是在基因未知序列端添 加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列 信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引 物作为锚定引物，在与基因配对互补结合 后进行PCR扩增。 四、反向PCR (inverse PCR, IPCR) IPCR是扩增未知序列的一种简捷方法。其基础是：用 限制性内切酶消化DNA，然后环化切割的产物，再用 切割后已知序列上两端相反方向的引物序列进行PCR ( 图8-3)，也可将环化DNA线性化后再进行PCR。 五、随机引物PCR (arbitrary primer PCR, AP-PCR) RAPD建立在PCR基础之上，它是利用一系列不 同的随机排列的寡核苷酸链(通常为十聚体)为引物， 对所研究基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物通过 聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经EB染色来检 测扩增DNA片段多态性。可用于进行基因组指纹图谱 的构建，并利用指纹图谱进行品种鉴定和对物种进行 亲缘关系和系统进化的研究。 六、差异显示RT-PCR(differential display RT-PCR,DDRT -PCR) DDRT-PCR技术最大的优点是省去了cDNA克隆和随后繁杂的克 隆筛选工作。但此方法也存在需要合成的引物多、费用大、操作技 术要求高、虚假特异区带出现较多等缺点，仍有待进一步完善。如 图8-4。 七、单链构象多态性PCR (single strand construction polymor-phism PCR, SSCP-PCR) 其原理是单链DNA分子因单一核苷酸不同，其二级 结构有所差异，PCR产物常表现在非变性凝胶电泳中 电泳迁移率不同。通过比较DNA的电泳类型，即可测 出突变。其优点是所需样品DNA量极少，灵敏度高， 可检测出点突变，以及插入、缺失突变，能一次筛选 多个样品。 八、多重PCR (multiplex PCR) 多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同 的DNA片段；如果被测基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱 上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常(图 8-5)。多重PCR具有灵敏、快速特点，特别适用检测单拷贝基因 缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southern杂交结果同 样可靠，且多重PCR尚可检测小片段缺失。 PCR技术在医学中的应用 遗传性疾病的诊断 病原微生物的诊断 癌症的诊断 移植组织配型 其他疾病的诊断 疾病的疗效观察及病情监测 一、遗传病相关基因的检测 如图8-8所示。 如果碱基突变的位置与某种限制性内切酶的识别位点相关，突变 会产生新的或消除原有的内切酶位点，那么用特定的限制性内切酶 消化PCR产物，通过电泳酶切图谱就能直接判断碱基发生突变与否 。若某一遗传病与这一酶切位点的存在或消失有连锁关系，PCR- RFLP即可用于该遗传病的诊断。 苯丙酮尿症:(缺苯丙氨酸羟化酶)不能使苯丙氨酸酪 氨酸，智力发育不全，对13个外显子PCR产物酶切鉴定 基因突变。 地中海贫血：-珠蛋白（四聚体）PCR产物正常为 136bp+110bp，异常（缺失）仅有110bp。 镰刀状红细胞贫血:因-珠蛋白基因第六位GAA(G)（ 为Oxa酶切点） GTA(G)(A T)，正常为294bp 191+103bp，异常为294bp（纯合子或）杂合子 103bp+191bp+294bp 杜氏营养不良症：对六个外显子PCR产物有缺失条带 产生（男胎诊断） 血友病：F因子基因PCR产物为142bp，bcl-I酶切 正常为99bp+43bp，异常（点突变）只有142bp（男胎 诊断）。 二.病源微生物的检测 病毒:如: HIV, 肝炎类病毒,HPV, SARS 细菌:碳疽, 其他微生物: 沙眼衣原体,梅毒螺旋体,肺炎 支原体 寄生虫: 弓形虫,疟原虫 三、肿瘤的诊断和研究（原癌抑癌基因） 癌基因、抑癌基因的检测 基因的缺失、点突变是原癌基因激活、抑癌基因失活 的方式之一。以往较大的基因缺失在显微镜下分析， 微小的缺失多用印迹杂交技术，目前用PCR技术甚为 简便。 原癌基因异常激活RT-PCR测mRNA表达量 血液病的融合基因（bcr-abl） 全长mRNA 的RT- PCR产物阳性 点突变PCR产物酶切后电泳检测。 抑癌基因缺失：有缺失时PCR产物减少，完全缺失时 无PCR条带。 肿瘤相关病毒基因：原发肝癌（HBsAg)若对HBV 基因PCR阳性，证明二者相关。 四.组织配型 方法:免疫学 分子生物学 ： PCR SSCP RFLP 基因芯片 I 类(A,B,C) 与疾病发生频率有关 II 类(DR,DQ,DP) 等 移植配型 五、疾病的疗效观察及病情监测 如：HBV， HCV， HIV 白血病细胞残留 PCR技术在法医学上的应用 PCR技术在法医学中的应用是检测人类白细胞抗原- DQ位点的分型，另外，Y染色体特异DNA (DYZ1、 DYZ3) SRY基因的PCR分析使性别鉴定成为常规。 在Y染色体上只要缺失SRY，个体就发育成为女性。 用针对SRY基因和X、Y同源序列的两对引物进行 PCR扩增，只有男性出现299bp的扩增片段。用这种方 法鉴别胎儿、运动员、犯罪人员等的性别，准确率极高 。 STR 检测 做个人身份鉴定 16-18个位点 PCR扩增产物的检测分析 琼脂糖凝胶电泳法 聚丙稀酰胺凝胶电泳法 PCR-ELISA检测 荧光探针检测 样品处理（DNA RNA） 热启动PCR扩增普通引物 扩增产物电泳分析结果 电泳法PCR系列试剂盒操作过程 PCR酶免检测试剂盒原理 PCR核酸扩增技术 核酸杂交技术 抗污染技术 酶联技术 化学显色技术 PCR-ELISA系列试剂盒操作过程图解 PCRELISA法定量 PCR-酶免(ELISA)检测法特点 应用了UNG防污染功能 由于引入探针杂交，特异性提高。 酶链反应的放大效应使本法的灵敏度更高 ； 本法对仪器设备要求不高，无需特殊仪器 即可开展，易于普及。 PCR-ELISA系列试剂盒操作过程 样品处理（DNA RNA） 抗污染反应 热启动PCR扩增带标记引物 扩增产物检测 产物变性 与特异性探针杂交 酶联反应 显色反应 EIA、PCR、PCR-ELISA的比较 PCR荧光检测法 荧光染料法：SYBR Green TaqMan法 Molecular Beacon法 Roch Amplifluor 双链探针 SYBR Green 工作原理 Cycle 1 Cycle 3 Cycle 2 通过Tm值来确定产物 SYBR Green 特点 使用方便：不必设计复杂的引物 没有序列特异性：可以用于不同的体系 便宜 灵敏 缺点：与非特异性产物结合 荧光PCR原理图( TaqMan法) TaqMan法特点 优点： 对目标序列具有很高的特异性 与Molecular Beacon 相比设计相对简单 缺点 价格较高 只适合有一个特定的目标 不能进行熔解曲线分析 Molecular Beacon法原理 Molecular Beacon法原理 Molecular Beacon法原理 Molecular Beacon法原理 Molecular Beacon法的特点 优点 对目标序列有很高的特异性（检测SNP） 荧光背景低 缺点 设计困难，价格较高 只能用于一个特定目标 无终点分析功能 Roch杂交探针原理图 Amplifluor原理图 双链探针原理图 实时荧光定量PCR检测方法 单色：PE5700、iCycler 多色：PE7700、iCycler、 LightCycler等 实时荧光定量PCR检测方法 仪器（ABI PRISM 7900HT） 实时荧光定量PCR原理 Ct值（C代表Cycle，t代表threshold） 含义是每个反应管内的荧光信号到达 设定的域值时经历的循环数。 荧光域值（threshold）的设定：10 SDcycle 6-15 荧光定量标准曲线 相对定量 核酸扩增技术与基因定量 PCRELISA法 以Roche试剂为代表通过加入QS对待测 物进 行含量测定 PCR-荧光法 利用四个定量标准品 终点检测不能定量 PCR实验室的建立 为了对一个特定序列进行重复PCR检测，需要三个 不同的区域，以保证对所感兴趣的目的序列进行 可靠的，不污染的PCR。 试剂准备区 样本准备区 扩增区 检测区 什么样的临床基因扩增检验实验室 是最标准的？ 临床基因扩增实验室设置的一般原则 各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作 “十六字口诀” PCR实验室的建立(试剂准备区) 试剂准备区里一般储备有PCR实验所需的所有试剂 在试剂准备区进行PCR反应主混合物的配制。 将大体积的主反应混合物分装后包存，即方便 使用，又可以避免反复从同一试剂管中吸取试 剂带来的可能污染。 一个比较合理的实验安排应该是：先将主反应 混合物从冰箱取出按照当天实验所需将住反应 混合物分装到反应管中，放4冰箱暂时贮存， 然后进行样品处理。 PCR实验室的建立(样本准备区) 样本准备区专门用作样品的制备，在制备和操作用于核酸 提取的试剂时应该采取如下预防措施 以前PCR扩增产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在 该房间操作。 组织培养物，组织标本，待测血清等各类标本均应在 样品处理间根据需要进行DNA或RNA处理。 样品处理区进行样品处理的所有仪器设备要专用，不 能用于其他区域。 DNA样品应用有专门防护的移液器操作，以防止在吸取 样品时有气溶胶遗留。 PCR实验室的建立(样本准备区) 离心管打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而 且管子不能用力崩开，否则会产生气溶胶。 任何时候都应穿戴实验服，戴手套，手套要经常更换 ，尤其在抽提过程中每一步都要更换。实验服要专门 用于样品准备间，经常清洗。 每次处理完样品后要及时清理干净，将不需要的标本 装垃圾袋灭菌处理，需要暂时保存的标本分装放-20 。 样品处理区要经常用稀释溶液（漂白粉、过氧乙酸等 ）及时擦拭桌面、拖地及紫外灯消毒 PCR实验室的建立(扩增区) 在样品处理区处理好的待测标本拿到扩增区进行加样 准备PCR扩增。 作为规则每次