血清总蛋白测定.doc

郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-01 版本/修订号：1/0主题内容血清总蛋白测定生效日期：2011-5-20第 1 页 共103页血清总蛋白测定(双缩脲法)1.实验原理：凡分子中含有两个甲酰氨基( -CONH2- )的化合物都能与碱性铜溶液作用，形成紫色复合物，这一反应称双缩脲反应 。蛋白质分子中有许多肽键( -CONH-），都能起此反应，而且各种血浆蛋白显色程度基本相同.紫色复合物在 540 nm 有吸收峰，并与蛋白含量成正比，通过与同样处理的标准蛋白比较可求出血清总蛋白含量。因此，在严格控制条件下，双缩脲反应可作为血浆蛋白总量测定的理想方法，从测定的吸光度值计算出蛋白质含量。吸光度的大小与试剂的组分、pH值、反应温度有关。 蛋白质 + 铜离子 NaOH 紫红色络合物2.标本采集及存放：无特殊要求，最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。离心后采集血清或肝素抗凝的血浆。血清标本2025保存可稳定6天；48保存可稳定4周；-20保存至少可稳定1年。3.实验试剂及仪器：3.1 试剂：使用北京利德曼总蛋白试剂盒。试剂组成如下 成 份 含 量 酒石酸钾钠 32mmol/L 硫酸铜 12mmol/L 碘化钾 30mmol/L NaoH 600mmol/L 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2.2 分析参数：主波长540nm分析方法终点法副波长700nm反应方向向上反应温度37S : R5：3004.质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。5. 计算方法：样本总蛋白含量C0 At-标本管的吸光度变化； As-标准管的吸光度变化； C0-标准液的浓度；6. 参考值范围：健康成人走动后血清总蛋白浓度为 6483 g/L ，健康成人静卧时，血清总蛋白浓度为 6078 g/L。7. 临床意义:血清总蛋白有生理性波动，直立体位由于体液分布的原因，血液相对浓缩，而长久卧床者血液较直立体位相对稀释。因此长久卧床者血清 总蛋白比直立活动时约低35g/L；新生儿血清总蛋白可比成人低58g/L；60岁以上老人约比成人低2g/L。（1）总蛋白浓度增高：血清中水分减少，使总蛋白浓度相对增高。凡体内水分的排出大于水分的摄入时，均可引起血浆浓缩，尤其是急性失水时(如岖吐、腹泻、 高热等)变化更为显著，血清总蛋白浓度有时可达100 150g/L， 又如休克时，由于毛细血管通透性的变化，血浆也可发生浓缩。慢性肾上腺皮质功能减退患者，由于钠的丢失而致继发性水分丢失，血浆也可出现浓缩现象。 血清蛋白质合成增加。大多发生在多发性骨髓瘤患者，此时主要是球蛋白的增加，其量可超过 50g/L，总蛋白则可超过100g/L。 （2）血清总蛋白浓度降低：血浆中水分增加，血浆被稀释。如因各种原因引起的水钠潴留。营养不良和消耗增加。长期食物中蛋白含量不足或慢性肠道疾病所引起的吸收不良.使体内缺乏合成蛋白质的原料，或因长期患消耗性疾病，如严重结核病、甲状腺功能亢进和恶性肿瘤等，均可造成血清总蛋白浓度降低。合成障碍，主要是肝功能障碍。肝脏功能严重损害时，蛋白质的合成减少，以白蛋白的下降最为显著。蛋白质丢失。严重烫伤时，大量血浆渗出，或大出血时，大量血液的丢失;肾病综合征时，尿液中长期丢失蛋白质;溃疡性结肠炎可从粪便中长期丢失一定量的蛋白质.这些均可使血清总蛋白浓度降低。8.附注：干扰因素：胆红素40mg/dl，血红蛋白200mg/dl, 抗坏血酸50mg/dl,乳糜1.6%时对检测结果没有影响。酚酞、溴磺酞钠在碱性溶液中呈色，影响双缩脲的测定结果，右旋糖酐可使测定管混浊亦影响结果，理论上这些干扰均可吸光度太高，可影响测定的准确性。方法局限性：本试剂线性上限为100g/L，如样品测定值超过上限时，应将样品用0.9氯化钠溶液作1:1稀释，重新测定，结果乘以2。危急值报告：无危急值。注意事项: 血清蛋白质的含量一般用 g/L 表示，因为各种蛋白质的分子量不同，不能用mmol/L表示。脂类高的血清,呈色后混浊不清,可用乙醚抽提后再比色。当采用50g/L的浓度标准液时，吸光度的变化范围在0.100.35。9参考文献 ：9.1 叶应妩、王毓三、申子瑜等.全国临床检验操作规程【第三版】东南大学出版社，20069.2 梁淑新、施俊英. 临床检验操作技术系列丛书生物化学检验分册，军事医学出版社，2006郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-02 版本/修订号：1/0主题内容血清白蛋白测定生效日期：2011-5-20第 5页 共103页血清白蛋白测定(溴甲酚绿法)1.实验原理：白蛋白是血清中清蛋白，几乎都由肝细胞合成,它是血清中的主要蛋白质组分。白蛋白作为一个结合和转运分子在机体营养状况中起着重大作用。它的另一个作用是维持渗透压，血浆胶体渗透压的75%是依靠白蛋白维持的。 血清白蛋白的测定常用于病人状态的非特异监视。在营养不良，特别是恶性营养不良的病人中可看到很低水平的血浆白蛋白。另外，血液稀释，或由于营养不良、肝脏疾病使合成白蛋白能力下降，或由于肾病综合征、蛋白丢失性肠道疾病等可引起大量白蛋白丢失的疾病均可导致低白蛋白。高白蛋白症则常见于脱水或血液浓缩。血清中的白蛋白与溴甲酚绿在pH=4.2的条件下结合生成绿色复合物，溶液由黄色变为绿色，其颜色深浅与白蛋白浓度成正比，通过在 630 nm 处测定其吸光度，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量。 白蛋白 + 溴甲酚绿 PH=4.2 绿色复合物2.标本采集及存放 ：无特殊要求，最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。离心后采集血清或血浆。血清4可贮6 天，在 2025 也可保存6天。3.试验试剂及仪器：3.1 试剂：使用北京利德曼白蛋白检测试剂盒。试剂组成如下 成 份 含 量 琥珀酸缓冲液 PH=4.2 溴甲酚绿 0.25mmol/L 表面活性剂及稳定剂 0.1% 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2.2分析参数：主波长6300nm分析方法终点法副波长700nm反应方向向上反应温度37S : R3：3004. 质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。 5计算方法： 样本白蛋白含量C0 At-标本管的吸光度变化； As-标准管的吸光度变化； C0-标准液的浓度；6. 参考值范围：414 岁儿童，血清白蛋白浓度为 3854g/L，健康成人血清白蛋白浓度为3448g/L。7. 临床意义:血清白蛋白在肝脏合成。血清白蛋白浓度增高常见于严重失水、血浆浓缩所致，并非蛋白质绝对量的增加。临床上尚未发现单纯白蛋白浓度增高的疾病，而以白蛋白浓度降低为多见.白蛋白浓度降低的原因与总蛋白浓度降低的原因相同乙但有时总蛋白的浓度接近正常，而白蛋白的浓度降低，同时又伴有球蛋白浓度的增高。急性白蛋白浓度降低主要由于急性大量出血或严重烫伤时血浆大量丢失。慢性白蛋白浓度降低主要由于肝脏合成白蛋白功能障碍、腹水形成时白蛋白的丢失和肾病时尿液中的丢失，严重时白蛋白浓度可低于10g/L。白蛋白浓度低于25g/L 时，由于胶体渗透压的下降，常可见到水肿等现象。妊娠，尤其是妊娠晚期，由于体内对蛋白质的需要量增加，同时又伴有血浆容量增高，血清白蛋白可明显下降，但分娩后可迅速恢复正常。文献报道，还有极少数先天性白蛋白缺乏症病例，由于白蛋白合成障碍，血清中几乎没有白蛋白，但患者不出现浮肿。8.附注：干扰因素：胆红素40mg/dl，血红蛋白500mg/dl, 抗坏血酸50mg/dl,乳糜1.60%时对检测结果没有影响。方法局限性：本试剂线性上限为60g/L，如样品测定值超过上限时，应将样品用0.9氯化钠溶液作1:1稀释，重新测定，结果乘以2。危急值报告：无危急值。注意事项:该试剂除与白蛋白反应外，还可以与血清中许多蛋白如铜兰蛋白、C反应蛋白、-球蛋白、结合珠蛋白也可呈色，呈慢反应，实际上当血清与试剂混合之后就开始反应，持续一个小时之后反应完成，故在反应最初的30秒之内读取吸光度，可减少非特异性反应。当60g/L白蛋白标准与 BCG 结合后.溶液光径1.0cm ，在630nm 测定的吸光度应为0.8110.035. 如达不到此值，表示灵敏度较低。此法测定正常血清标本的批间变异系数为6.3%左右。国内试剂大多为溴甲酚绿法，有些进口原装试剂则用的溴甲酚紫(BCP)方法，BCP法的优点是受球蛋白和其他血浆蛋白干 扰较小，但和 BCG 法相比，灵敏度较低。此外，溴甲酚紫与非人源性白蛋白结合力相当弱，不适用于测定动物标本中的白蛋白，而质控血清往往是动物血清，故其应用不如 BCG 法普遍。血清球蛋白含量及白球比值：在临床生化检验中，一般不需要单独测定球蛋白的含量，而是在测定总蛋白和白蛋白含量之后，用总蛋白减去白蛋白的含量即为球蛋白的含量。目前全自动生化分析仪能同时测定白蛋白和总蛋白的含量，并计算出白球比值，A/G比值的参考范围为1.52.5.球蛋白浓度增高。临床上常以球蛋白增高为主.球蛋白增高的原因，除水分丢失的间接原因外，主要有下列因素:感染性疾病:如结核病、痢疾、黑热病、血吸虫病、麻风病等;自身免疫性疾病:如系统性红斑猥疮、硬皮病、风湿热、类风湿性关节炎、肝硬化等;多发性骨髓瘤:球蛋白可增至2050 g/L 。 球蛋白浓度降低主要是合成减少. 正常婴儿出生后至3岁内，由于肝脏租免疫系统尚未发育完全，球蛋白浓度较低，此属于生理性低球蛋白血症。肾上腺皮质激素和其他免疫抑制剂有抑制免疫机能的作用，会导致球蛋白的合成减少.低球蛋白血症或无球蛋白血症，患者血清中蛋白极度下降或缺如。先天性患者，仅见于男性婴儿，而后天获得性的.可发生于男、女两性。此类患者缺乏体液免疫功能，很易发生难以控制的感染.9.参考文献 ：9.1 叶应妩、王毓三、申子瑜等.全国临床检验操作规程【第三版】东南大学出版社，20069.2 梁淑新、施俊英. 临床检验操作技术系列丛书生物化学检验分册，军事医学出版社，2006郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-03 版本/修订号：1/0主题内容血清总胆红素(TBIL)测定生效日期：2011-5-20第 9页 共103页血清总胆红素(TBIL)测定(钒酸盐氧化法)1.实验原理：总胆红素(是血红蛋白、肌红蛋白、过氧化物酶、细胞色素等含铁卟琳的化合物在体内代谢的产物。血清中有两类胆红素，即未结合胆红素和合胆红素。未结合胆红素又称游离胆红素或间接胆红素。间接胆红素在生理 pH 条件下是难溶于水的脂溶性物质，可透过细胞膜，对细胞有毒害作用，不能通肾脏随尿排出体外。结合胆红素即胆红素葡萄糖醛酸酯，又称直接胆红素，直接胆红素是水溶性的，不易透过细胞膜，可通过肾脏随尿排出。总胆红素是直接胆红素与间接胆红素的和。釩酸盐氧化法原理如下： 总胆红素 釩酸盐 胆绿素 胆红素的减少引起在波长450nm处吸光度下降，吸光度的变化与总胆红素含量成正比。2.标本采集：采用空腹无溶血血清，要尽快分离测定。2 -8避光保存，血清中胆红素可稳定3天。冰冻保存3个月，胆红素水平未见明显变化。3.实验试剂及仪器：3.1 试剂：使用北极利德曼检测试剂盒。试剂组成如下 成 份含 量 R1:柠檬酸缓冲液 100mmol/L 反应促进剂 1mmol/L 表面活性剂 2mmol/L R2:磷酸盐缓冲液 10mmol/L 偏钒酸钠 4mmol/L 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2.2 分析参数：主波长450nm分析方法终点法副波长546nm反应方向向下反应温度37S:R1:R214:280:704. 质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。 5. 计算方法：血清胆红素的含量(mol/L)C0 At-标本管的吸光度变化； As-标准管的吸光度变化； C0-标准液的浓度；6. 参考值范围：婴 儿： 出生24小时内150mol/L 出生第2天 22-193mol/L 出生第3天 12-217mol/L 出生第46天 1.7-216mol/L 儿 童： 一个月 3.4-17mol/L 成年人： 3.4-17.2mol/L7.临床意义判断有无黄疸、黄疸程度及演变变过程：当STB 17.1 mol/L但342mol/L时为重度黄疸。在病程中检测可以判断疗效和指导治疗。 根据黄疸程度推断黄疸病因溶血性黄疸通常342mol/L 。 根据总胆红素、结合及非结合胆红素增高程度判断黄疸类型若STB增高伴非结合胆红素明显增高提示为溶血性黄疸，总胆红素增高伴结合胆红素明显升高为胆汁淤积性黄疸，三者均增高为肝细胞性黄疸。8.附注：干扰因素：血红蛋白100mg/dl, 抗坏血酸50mg/dl,乳糜1.60%时对检测结果没有影响。方法局限性：本试剂线性上限为680mol/L，如样品测定值超过上限时，应将样品用0.9氯化钠溶液作倍比稀释，重新测定，结果乘以稀释倍数。危急值报告：当新生儿血清标本测定结果总胆红素340mol/L时，在经过复查等确认手段处理后应及时向临床主管医生汇报。注意事项: 当采用100mol/L的浓度标准液时，吸光度的变化范围在0.050.20 试剂空白吸光度应0.10，否则应视为过期不能在使用。本法测定血清胆红素，在1037条件下不受温度的变化影响，呈色在2小时内非常的稳定。胆红素对光敏感，标准及标本均应尽量避光。钒酸盐法试剂稳定、保存期长，可室温保存，操作简单，特别适合全自动生化分析仪。1993年日本学者对该法，目前国内用户众多，文献均认为该法和传统方法（改良J-G法）有良好的相关性。线性和特异性达到较理想的水平。9.参考文献 ：9.1 叶应妩、王毓三、申子瑜等.全国临床检验操作规程【第三版】东南大学出版社，20069.2 梁淑新、施俊英. 临床检验操作技术系列丛书生物化学检验分册，军事医学出版社，2006郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-03 版本/修订号：1/0主题内容血清直接胆红素(TBIL)测定生效日期：2011-5-20第 13页 共103页血清直接胆红素（D-BIL）测定(钒酸盐法)1.实验原理：在正常生理状态下，间接胆红素以胆红素-血浆蛋白复合物的形式经血液运输，这一方面增大了胆红素的水溶性，有利于运输;同时又使血红素固定在大分子蛋白质上，可阻止血红素进入细胞内，避免了胆红素对细胞的毒害作用。但是如果血液中间接胆红素浓度过高，或血浆清蛋白浓度明显降低时，可导致间接胆红素游离增多，从而增加了间接胆红素透人细胞内的危险.另外，某些 阴离子对清蛋白与胆红素的结合具有竞争作用。如游离脂肪酸、甲状腺素、磺胶类药物、水杨酸等在血浆中的推度升高时，都可使间接胆红素和血浆蛋白质的结合减少。间接血红素进入肝细胞后，与肝细胞内的载体蛋白 Y 或 z 结合形成血红素 -y 或胆红素 -z ，并以此形式运往滑面内质网，在葡萄糖醛酸基转移酶作用下，胆红素与二磷酸尿苷葡萄糖醛酸反应生成结合胆红素，即直接胆红素。直接胆红素再经肝内胆道系统和胆总管随胆汁一起排入肠道进一步代谢，最后以胆素形式，随尿及粪便排出体外。 在PH值为3.0左右、表面活性剂和间接胆红素抑制剂的条件下，样品中的直接胆红素被氧化剂釩酸盐氧化为胆绿素。胆红素的黄色特异性吸光度下降，通过测定釩酸盐氧化前后吸光度的变化，计算出样品中直接胆红素的含量。 胆红素 钒酸盐 胆绿素2.标本采集及保存：采用空腹无溶血血清，要尽快分离测定。2 -8避光保存，血清中胆红素可稳定3天。冰冻保存3个月，胆红素水平未见明显变化。3.实验试剂：3.1 试剂：使用北极利德曼检测试剂盒。试剂组成如下 成 份含 量 R1:柠檬酸缓冲液 100mmol/L 反应促进剂 1mmol/L 表面活性剂 2mmol/L R2:磷酸盐缓冲液 10mmol/L 偏钒酸钠 4mmol/L 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2.2 分析参数：主波长450nm分析方法终点法副波长546nm反应方向向下反应温度37S:R1:R214:280:704. 质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。 5. 计算方法：血清胆红素的含量(mol/L)C0 At-标本管的吸光度变化； As-标准管的吸光度变化； C0-标准液的浓度；6. 参考值范围：6.8mol/L7. 临床意义:根据直接胆红素与总胆红素比值，有助于鉴别黄疸类型，如DBIl/TBIL 50% 为梗阻性黄疸。直接胆红素测定可能有助于某些肝胆疾病的早期诊断。肝炎的黄疸前期、无黄疸型肝炎、失代偿期肝硬化、肝癌等，30% -50% 患者表现为直接胆红素增加，而总胆红素正常（见下表）正常人及常见黄疸的胆红素素代谢检查结果 血清胆红素尿内胆色素DBILTBILD/T尿胆红素尿胆原正常人06.83.417.10.20.4阴性0.844.2梗阻性黄疸明显增加轻度增加0.5强阳性减少或缺少溶血性黄疸轻度增加明显增加1.2U/ml R2:起动液 NADH 0.18mmol/L a-酮戊二酸 12mmol/L 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2.2 分析参数：主波长340nm分析方法速率法延滞时间60S副波长410nm反应方向向下读数时间120S反应温度37S:R1:R220:200：40理论因子20904. 质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。 5.计算方法：ALT(U/L) = A/minVt1000 = A/minF 式中: A/min 一一每分钟吸光度变化率； e 一一6.22 摩尔吸光系数； Vt 一一反应液总体积 (ml)； Vs一一样品体积 (ml)； d 一一 比色杯光径 (cm) F 一一 理论因子6. 参考值范围：不含磷酸吡哆醛 含磷酸吡哆醛女性 31U/L 1035U/L男性 41U/L 1050U/L7.临床意义: （1）急性病毒性肝炎 ALT 异常，阳性率为 80% -100%，是病毒性肝炎的重要检查指标。急性乙型肝炎 ALT 升高显著，若较高的水平持续数月，甚至于数年，表明转为慢性。重症肝炎和亚急性肝炎时，一度上升的 ALT 在症状恶化时有酶活性降低，出现血清胆红素和 ALT 变化分离的现象，可能是肝坏死的征兆。 （2）慢性肝炎、肝硬化 ALT 轻度上升或正常，血清ASTALT。当慢性肝炎、肝硬化患者 ALT 正常而甲胎蛋白升高时，要警 惕并发原发性肝癌的可能。 （3）其他原因致肝功能损害心功能不全致肝淤血，可有ALT升高.当心功能好转时，ALT周恢复正常:脂肪肝、胆管炎、药物性 肝脏损害等ALT将升高 。8. 附注：干扰因素：当标本中胆红素40mg/dl，血红蛋白100mg/dl, 抗坏血酸50mg/dl,乳糜1.6%时对检测结果没有影响。方法局限性：本试剂线性上限为600U/L，如样品测定值超过上限时，应将样品用0.9氯化钠溶液作1:1稀释，重新测定，结果乘以2。危急值报告：无危急值。注意事项: 正常新生儿ALT水平比成年人约高2倍,出生后约3个月降至成年人的水平.新生儿,尤其未成熟儿，肝细胞膜通透性较大,ALT从肝细胞渗入血浆较多,使血清ALT水平升高.如果试剂空白吸光度下降至1.0,表明NADH己下降50%左右，不能保证ALT测定的线性范围。试剂盒贮存到有效期末时,必须做试剂空白吸光度测定.若试剂空白吸光度小于1.0时,应视为过期试剂,不能再使用.ALT测定中存在两个副反应；a:血清中存在的- 酮酸(如丙酮酸)能消耗 NADH; 丙酮酸 + NADH + H+ LDH 乳酸 + NAD+ b:血清中谷氨酸脱氢酶 (GLDH) 增高时，在有氨存在的条件下，亦能消耗 NADH。 - 酮戊二酸+ NADH + H+ +NH4+ GLDH L- 谷氨酸+ NAD+ + H2O 上述副反应都能消耗 NADH ，使 340 nm 处吸光度下降值增加，使测定结果偏高。目前，推荐 双试剂法，因孵育期长，能有效地消除于扰反应，提高测定准确性，是ALT 测定的首选方法。双试剂法可适当地降低试剂中 LDH的用量。至于NH4+ 的于扰，除严重肝病时血清谷氨酸脱氢酶活性增高和血氨增高时外，一般血清中NH4+ 的含量甚徽，此干扰反应不大。但LDH原试剂往往是用饱和硫酸铵配制的，厂方在使用前必须经过严格的脱氨处理。IFCC 推荐的试剂盒中，含有磷酸吡哆醛(P-5-P)，这是转氨酶的辅基，能使血清中ALT显示最大活性。有文献报道，某些病理状态下，血清中存在脱辅基的ALT酶蛋白，当使用含 P-5-P 的底物时可使血清 ALT 活性提高7% 55% 变化幅度的大小与血清中原有 P - 5 - P 含量有关，健康人血清中 P-5-P 含量适中，底物中 P-5- P 对增高 ALT 活性作用不大。但肾脏病患者血清P -5 -P 水平偏低，底物中P-5-P可显著升高血清ALT活性。 ALT 测定中有的用磷酸盐缓冲液，有的用Tris缓冲液。据报 道: NADH 在Tris缓冲液中稳定性较高; P -5-P 在Tris缓冲液中，显示出更有效的激活作用，而磷酸盐缓冲液有延缓 P-5-P与脱辅基酶蛋白的结合作用。9.参考文献 ：9.1 叶应妩、王毓三、申子瑜等.全国临床检验操作规程【第三版】东南大学出版社，2006。9.2 梁淑新、施俊英. 临床检验操作技术系列丛书生物化学检验分册，军事医学出版社，2006。郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-06 版本/修订号：1/0主题内容血清天门冬氨酸氨基转移酶测定生效日期：2011-5-20第 22页 共103页血清天门冬氨酸氨基转移酶测定(IFCC推荐方法)1.实验原理：天门冬氨酸氨基转移酶(AST)又叫谷草转氨酶(GOT)，它催化氨基从特定的氨基酸(L-谷氨酸或L-天门冬氨酸)转移到相应的酮(-酮戊二酸和草酰乙酸。在体内反应是反向进行，以提供尿素循环的氨源。生成的谷氨酸在谷氨酸脱氢酶作用下脱氨，-酮戊二酸再生，生成的氨可进入鸟氨酸循环。在正常情况下，AST存在于各种组织细胞中，心、肝、骨髓和肾含有相似的AST量，因此酶的释放不是特异的，但酶的释放说明有组织损害。谷草转氨酶催化L-天门冬氨酸的氨基转移与MDH催化的反应偶联，使NADH 氧化成NAD+。NADH在340nm处有特异吸收峰，其被氧化的速率与血清中AST的活性成正比，在340nm处测定NADH下降速率,即可测出AST活性单位。 L-天门冬氨酸 + -酮戊二酸 AST 草酰乙酸 + L-谷氨酸 NADH + 草酰乙酸 + H+ MDH L-苹果酸 + NAD+ + H2O2.标本采集与处理：3天内的活性损失：28保存：8%；1525保存：1.2U/ml MDH 0.8U/ml R2: NADH 0.18mmol/L a-酮戊二酸 12mmol/L 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2.2 分析参数：主波长340nm分析方法速率法延滞时间60S副波长410nm反应方向向下读数时间120S反应温度37S:R1:R220:200：40理论因子20904. 质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。 5.计算方法：AST(U/L) = A/minVt1000 =A/minF 式中: A/min 一一每分钟吸光度变化率； e 一一6.22 摩尔吸光系数； Vt 一一反应液总体积 (ml)； Vs一一样品体积 (ml)； d 一一 比色杯光径 (cm) F 一一 理论因子6. 参考值范围： 不含磷酸吡哆醛 含磷酸吡哆醛 女性 31U/L 1040U/L 男性 肝脏肌肉肾，所以AST升高常见于急性肝炎、药物性肝坏死、肝癌、肝硬化、慢性肝炎和心肌炎等；胸膜炎、肾炎及肺炎等含量轻度升高；心肌梗塞时AST明显升高；骨骼肌疾病如进行性肌营养不良，皮肌炎和挤压性肌肉损伤等AST可升高。8. 附注：干扰因素：当标本中胆红素40mg/dl，血红蛋白100mg/dl, 抗坏血酸50mg/dl,乳糜1.6%时对检测结果没有影响。方法局限性：本试剂线性上限为600U/L，如样品测定值超过上限时，应将样品用0.9氯化钠溶液作1:1稀释，重新测定，结果乘以2。危急值报告：无危急值。注意事项: 本法的缺点是标本AST活性高时，草酰乙酸对AST显示反馈抑制，使测定结果偏低。酮血症中乙酰乙酸及。其它的注意事项与ALT检测相同。9.参考文献 ：9.1 叶应妩、王毓三、申子瑜等.全国临床检验操作规程【第三版】东南大学出版社，20069.2 梁淑新、施俊英. 临床检验操作技术系列丛书生物化学检验分册，军事医学出版社，2006郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-07 版本/修订号：1/0主题内容血清碱性磷酸酶测定生效日期：2011-5-20第 25页 共103页血清碱性磷酸酶测定1.实验原理：碱性磷酸酶(ALP)几乎存在于机体的各个组织，但以骨髓与牙齿、肾脏和肝脏中含量较多。正常人血清中的ALP 主要来自骨髓，由成骨细胞产生，故骨髓疾患，特别是当有新骨质生成时和正在生长的儿童期，血液内ALP活力增高。又因为该酶由肝脏排泄，且有部分来自肝脏，故肝胆疾病，特别是胆道 阻塞时此酶在血中活力增高。以磷酸对硝基苯酚（P-NPP）为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）为磷酰基的受体物质，增进酶促反应速率。P-NPP在碱性溶液中为无色，在ALP催化下，P-NPP分裂出磷酸基团，生成游离的对硝基苯酚（P-NP），后者在碱性溶液中转变成醌式结构，呈现较深的黄色。在波长405nm处监测吸光度增高速率,计算出ALP活性。 对硝基苯磷酸二钠 + H2O ALP 对硝基苯酚+H3PO4 2.标本采集与处理：无特殊要求，最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。离心后采集血清或肝素抗凝的血浆。但草酸、柠檬酸和EDTA能抑制ALP活性，故不能用这些物质作抗凝剂。血清置常温（25）ALP活性显示轻度升高，置冰箱（4）酶活性也会缓慢升高。冰冻血清中ALP活性下降，当血清复溶后，酶活性会慢慢恢复。3.实验试剂及仪器：3.1 试剂：使用东欧津玛检测试剂盒。试剂组成如下 成 份 含 量 R1: Mgcl2 1.0mmol/L AMP 100mmol/L R2:对硝基苯磷酸盐 16mmol/L 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2.2 分析参数：主波长405nm分析方法速率法延滞时间60S副波长520nm反应方向向上读数时间150S反应温度37S:R1:R25：200：50理论因子27574. 质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。5.计算方法： ALP(U/L) = A/minVt1000 =A/minF 式中: A/min 一一每分钟吸光度变化率； e 一一6.22 摩尔吸光系数； Vt 一一反应液总体积 (ml)； Vs一一样品体积 (ml)； d 一一 比色杯光径 (cm) F 一一 理论因子6参考区间 37，女性：112岁 12岁 50136U/L 37，男性：112岁 500U/L1215岁 25岁 50136U/L7.临床意义：肝胆系统疾病：各种肝内、肝外胆管阻塞疾病，如胰头癌，胆道道结石引起的胆管阻塞、原发性胆汁性肝硬化、肝内胆汁淤积等，ALP明显升高，且与血清胆红素升高相平行；累积肝实质细胞的肝胆疾病如肝硬化、肝炎，ALP轻度升高。黄疸的鉴别诊断：ALP和血清胆红素、转氨酶同时测定助于黄疸鉴别诊断 胆汁淤积性黄疸，ALP和血清胆红素明显升高，转氨酶度增高。 肝细胞性黄疸，血清胆红素中度增加，转氨酶活性很高，ALP正常或稍高。 肝内局限性胆道阻塞如原发性肝癌、转移性肝癌、肝脓肿等ALP明显增高，ALT无明显增高，胆红素大多正常。骨骼疾病：如纤维性骨炎、佝偻病、骨软化症、成骨肉瘤及骨折愈合期，ALP升高。生长中儿童、妊娠中晚期血清ALP生理性增高。8.附注：方法局限性：本试剂线性上限为500U/L，如样品测定值超过上限时，应将样品用0.9氯化钠溶液作稀释，重新测定，结果乘以稀释倍数。危急值报告：无危急值。注意事项: 血清置室温（25),ALP活性显示轻度升高.例如室温置6小时,酶活性约增高1%,置14天,酶活性亦出现缓慢地升高.冰冻血清,ALP活性降低,但当血清复温后,酶活性会慢慢恢复.质控血清或冻干质控血清亦呈现类似的ALP 活性升高现象。如果试剂空白吸光度1.0,应视为过期试剂,不能再使用.ALP活性与血清在反应液中所占体积分数有关.已发现当血清体积分数从 1/26 减低到 1/51 时，测出的酶活性随之增高；但低于1/51 时，酶活性没有进一步增加。这一效应的原因还不清楚，可能是因为在较高稀释度下ALP多聚体解聚所致。 ALP能水解多种天然存在的或合成的有机磷酸酯。在体内， ALP的真正底物尚不清楚。ALP先天缺陷的个体，尿中大量排出磷酸乙醇胺，推测它可能是一种真正的生理性底物。在大多数ALP测定方法中，释放出的磷酸醛基转移给水分子，此时ALP的酶促反应属水解类反应。使用某些氨基醇缓冲液 时，ALP的催化速率增强。常用于ALP测定的缓冲液可归类3种:惰性型，如碳酸缓冲液;抑制型，如甘氨酸缓冲液;激活型，如AMP、Tris和DEA等缓冲液。激活型缓冲液，缓冲物质作为酶的一种底物(磷酸酰基的受体)参与磷酸酸基的移换反应，因此能增进酶促反应速率。使用最适浓度的激活型缓冲液时，所测的ALP活性要比使用惰性型缓冲液(如碳酸盐缓冲液)时高2-6倍DEA的激活作用比AMP的激活作用更强。因此，用不同缓冲液测定ALP活性时，其参考值不同。目前多数试剂盒选择AMP作为缓冲液。9.参考文献 ：9.1 叶应妩、王毓三、申子瑜等.全国临床检验操作规程【第三版】东南大学出版社，2006.9.2 梁淑新、施俊英. 临床检验操作技术系列丛书生物化学检验分册，军事医学出版社，2006.郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-08 版本/修订号：1/0主题内容血清-谷氨酰转酞酶测定生效日期：2011-5-20第 29页 共103页血清-谷氨酰转酞酶测定1实验原理 - 谷氨酸转移酶 ( - GT) 是一种肤转移酶，它能催化谷胱甘肽或