饲料中真蛋白的测定及意义.docx

饲料中真蛋白的测定及其意义 饲料是畜牧养殖生产中的重要生产资料，饲料中蛋白质含量是判定饲料营养价值的一项重要指标，饲料中粗蛋白质包括真蛋白质和非蛋白质两部分含氮物质，后者主要包括游离氨基酸、硝酸盐、氨等，故不能反映出饲料蛋白质对动物的真正营养价值。目前，部分养殖场户存在一个认识误区，认为标签上标注的粗蛋白质高，营养价值就高。为此，部分饲料生产企业利用人们认识上的误区，在饲料生产中添加羽毛粉、血粉、尿素等不易被动物肌体吸收的物质，饲料产品中粗蛋白含量上去了，但却没有相应的营养价值，造成养殖效益的低下。真蛋白的检测方法1 适用范围本操作方法适用配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。2 原理样品在水溶液中，加入过量硫酸铜，在碱性条件下，纯蛋白被氢氧化铜沉淀，用水洗去水溶性含氮 物，沉淀部分按粗蛋白的测定方法测定其含氮量。3 试剂3.1 10%硫酸铜溶液：称取五水硫酸铜10g用水溶解，转移至100ml容量瓶中定容至刻度。3.2 2.5%氢氧化钠溶液：称取2.5g氢氧化钠用水溶解，转移至100ml容量瓶中定容至刻度。3.3 硫酸：化学纯，含量为98%，无氮。3.4 催化剂：0.4g硫酸铜，5个结晶水，6g硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀。3.5 氢氧化钠：化学纯，40%水溶液（M/V）。3.5.1 配制方法：500g氢氧化钠+1100ml蒸馏水。3.6 硼酸：化学纯，2%水溶液（M/V）。3.6.1 配制方法：20.5g硼酸+1000ml蒸馏水。3.7 混合指示剂：甲基红，1%乙醇溶液，溴甲酚绿，0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个 月。3.7.1 溴甲酚绿，0.5%乙醇溶液配置：溴甲酚绿0.125g+25ml乙醇。3.7.2 甲基红，1%乙醇溶液配置：甲基红0.025g+25ml乙醇。3.8 盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按GB/T601制备。3.8.1 0.02mol/L盐酸标准溶液：1.67ml盐酸，分析纯，注入1000ml蒸馏水中。3.8.2 0.1mol/L盐酸标准溶液：8.3ml盐酸，分析纯，注入1000ml蒸馏水中。3.9 硫酸铵：分析纯，干燥。3.10 蔗糖：分析纯。4 仪器设备4.1 实验室用样品粉碎机。4.2 分样筛：孔径0.45mm（40目）。4.3 分析天平：感量0.0001g。4.4 电炉。4.5 滴定管：酸式，25、50ml。4.6 凯氏烧瓶： 250ml。4.7 凯氏蒸馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸汽蒸馏式。4.8 锥形瓶：250ml。4.9 容量瓶：100ml。4.10 烧杯：200ml。4.11 干燥箱。5 分析步骤5.1 半微量法5.1.1样品的处理称取待测样品0.5-1g（精确到0.1mg）于200ml（4.10）烧杯中，加入50ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，在电炉（4.4）上加热煮沸，加入20ml 10%硫酸铜溶液（3.1），再加入20ml 2.5%氢氧化钠溶液（3.2）搅匀，从电炉上取下，在室温放置2h，然后用倾泻法将样品过滤到滤纸上，用少量温水多次洗涤烧杯和沉淀物，直至洗出液无硫酸根离子（用10%氯化钡溶液来检验滤液无沉淀），连同漏斗一起放入80干燥箱（4.11）中烘干，将滤纸和沉淀物小心放入250ml凯氏烧瓶（4.6）中，加入6.4g 催化剂（3.4），20ml 浓硫酸（3.3），在电炉（4.4）上消化，样液澄清后继续消煮2h，取下冷却后加入20ml蒸馏水，转入100ml 容量瓶（4.9）中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。同时做空白实验。5.1.2 蒸馏将半微量蒸馏装置（4.7）的冷凝管末端浸入装有20ml 硼酸（3.6）的吸收液和2滴混合指示剂（3.7）的锥形瓶（4.8）内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10-20ml 注入蒸馏装置中，小心提起玻璃塞使之流入反应室，同时用蒸馏水冲洗蒸馏装置入口内壁使样品分析液和冲洗液一并流入反应室，迅速将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min 降下锥形瓶使冷凝管末端离开液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。5.1.3 滴定蒸馏后的吸收液立即用0.02 mol/L盐酸标准溶液（3.8.1）滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。5.2 常量法5.2.1 称取待测样品0.5-1g（精确到0.1mg）于200ml（4.10）烧杯中，加50ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，在电炉（4.4）上加热煮沸，加入20ml10%硫酸铜溶液（3.1），再加入20ml2.5%氢氧化钠溶液（3.2）搅匀，从电炉上取下，在室温放置2h，然后用倾泻法将样品过滤到滤纸上，用少量温水多次涤烧杯和沉淀物，直至洗出液无硫酸根离子（10%氯化钡溶液来检验滤液无沉淀），连同漏斗一起放入80干燥箱内烘干，将滤液和沉淀物小心放入250ml凯氏烧瓶（4.6）中，加入6.4g催化剂（3.4），20ml浓硫酸（3.3），在电炉上消化，样液澄清后继续消煮2h，取下放冷后加入60-100ml蒸馏水，摇匀冷却。同时做空白实验。5.2.2 将蒸馏装置（4.7）的冷凝管末浸入装有25ml硼酸（3.6）吸收液和2滴混合指示剂（3.7）的锥形瓶内。然后小心的向凯氏烧瓶（4.6）中加入50ml氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯氏烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液为100ml，降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1-2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。5.2.3 滴定蒸馏后的吸收液立即用0.1mol/L盐酸标准溶液（3.8.2）滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。5.3蒸馏步骤的检验精确称取0.2g硫酸铵（3.9）代替试样，按5.1或5.2步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为21.190.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。5.4空白测定称取蔗糖（3.10）0.5g，代替试样，按5.1或5.2步骤进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸标准溶液（3.8.2）的体积不得超过0.2ml。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液（3.8.1）体积不得超过0.3ml。6 分析结果的表述6.1计算见下式：真蛋白（%）=(V1-V2)C0.01406.25100mV/V式中：V1-滴定试样时所需标准溶液的体积，ml；V2-滴定空白时所需标准溶液的体积，ml；C-盐酸标准溶液的浓度，mol/L；V-试样分解液的总体积，ml；V-试样分解液蒸馏用体积，ml；0.0140-每毫克当量氮的克数；6.25-氮换算成蛋白质的平均系数。6.2 重复性每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。当真蛋白含量在25%以上时，允许相对偏差为1%。当真蛋白含量在10%-25%之间时，允许相对偏差为2%。当真蛋白含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。7 关键步骤及注意事项7.1 倾泻法过滤洗涤时，烧杯中的沉淀物一定要彻底清洗。室温较低时洗涤用水的温度要稍微高一点，以保证烧杯中的沉淀物彻底转移。7.2 过滤时的滤液达到400ml后再用10%的氯化钡溶液检验滤液是否有沉淀，这样可以减少检验次数。7.3烘干沉淀时，可将滤液倒掉，将漏斗和盛放滤液的容器同时放入干燥箱，以免漏斗放置不稳沉淀物遗失。7.4加入混合催化剂在电炉上消化时，要时刻观察