基因功能与调控试题植.doc

功能基因与调控试题1、 顺式作用元件与反式作用因子有什么区别?1.1顺式作用元件存在于基因旁侧与结构基因串联的特定DNA序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。顺式元件可分为以下四种类型：核心启动子成分，如TATA框；上游启动子成分，如CAAT框，GC框，ATF结合位点；远上游元件：如增强子，沉默子等；特殊启动子成分：如淋巴细胞中的Oct和KB。这些元件都为不同的转录因子及蛋白质识别和结合来调节转录。1.2反式作用因子 反式作用因子是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，从而激活另一基因的转录，这种调节蛋白称反式作用因子。反式作用因子通过以下不同的途经发挥调控作用：蛋白质和DNA相互作用；蛋白质和配基结合；蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的修饰。参与基因表达调控的因子,它们与特异的靶基因的顺式元件结合起作用。编码反式作用因子的基因与被反式作用因子调控的靶序列(基因)不在同一染色体上。反式作用因子有两个重要的功能结构域:DNA结合结构域和转录活化结构域,它们是其发挥转录调控功能的必需结构。反式作用因子可被诱导合成,其活性也受多种因素的调节。同一类序列特异性的反式作用因子由多基因家族所编码。与转录水平调节的反式作用因子通常可分为四大类：RNA聚合酶；和RNA聚合酶相联系的普遍性转录因子，它们结合在靶基因的启动子上，形成前起始复合物，启动基因的转录；特异性转录因子(如激活因子和抑制因子)，一类与靶基因启动子和增强子(或沉默子)特异结合的转录因子，具有细胞及基因特异性，可以增强或抑制靶基因的转录；种类多样的协调因子，要么改变局部染色质的构像(如组蛋白酰基转移酶和甲基转移酶)，对基因转录的起始具有推动作用，或直接在转录因子和前起始复合物之间发挥桥梁作用(如中介因子(Mediator)，推动前起始复合物(PIC)形成和发挥作用。包括：1.DNA结合域：a.螺旋-转角-螺旋；b.锌指结构；c.亮氨酸拉链d.螺旋-突环-螺旋；2.转录激活域：与其他转录因子相互作用的结构成分。随着表观遗传学的发展，研究发现除了蛋白，DNA、RNA也有调控功能，所以现在也称反式调控元件，主要有miRNA，转录因子等。2、 请分别设计研究顺式作用元件、反式作用因子以及两者之间相互作用的实验。2.1全长启动子序列获得 premier 5.0 walking技术提取RNA-反转生成 cDNA-引物设 5和3侧翼序列 （包括启动子) 2.2生物信息学分析与预测获得启动子序列后, 首先通过生物信息学方法对启动子序列进行初步的预测和分析,分析序列中含有的可能的相关顺式作用元件。常用的植物启动子预测相关数据库和软件资源包括：EPD、TRRD、TRANSFAC、PLACE、Plant CARE。2.3突变分析启动子序列信息突变分析法是鉴定顺式作用元件最可靠的方法, 多数突变分析包括缺失突变和取代突变。5 端缺失法、3 端缺失法 内部缺失法 分析确定功能启动子的调控区边界 确定重要顺式作用元件 点突变法 精确的点突变 获得启动子顺式作用相关元件。2.4 凝胶阻滞分析法凝胶阻滞依据的原理就是在凝胶电泳中,由于电场的作用,小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快,依据电泳迁移率的变化可以确定蛋白质与核酸分子的结合情况。凝胶阻滞实验常用于研究启动子功能元件与核蛋白的结合情况,从而鉴定新的顺式作用元件或验证已知顺式作用元件与转录因子的相互作用。2.5 确定与蛋白质结合的DNA 的长度及序列DNase I足迹分析法其基本原理是用DNase I部分消化已进行单链末端标记的待测双链DNA,在变性聚丙烯酰胺凝胶上形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带；当DNA片段与其特异性结合的蛋白结合后,结合蛋白的区域受到蛋白的保护, 免受 DNase I 的攻击, 因此形成切割梯中的空白区域。再结合DNA化学测序法,就可知该结区的碱基序列。2.6 顺式作用元件与反式作用因子作用研究 酵母单杂交体系从酵母双杂交技术发展来的。该方法根据DNA 结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因、鉴别已知转录因子的DNA结合位点, 是一种利用酵母细胞来进行的体内遗传分析系统。其原理是: 转录因子通常由一个DNA结合结构域和一个转录激活结构域组成。理论上, 任何一个AD都可以与任何一个BD结合并激活转录, 而且只要二者能够通过一定方式在空间上足够靠近, 就可激活转录。其基本操作过程为:将已知顺式作用元件构建到最小启动子的上游, 把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子的cDNA 与AD 融合表达载体导入酵母细胞, 该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合, 就能激活Pmin启动子, 使报告基因得到表达, 从而筛选出与已知顺式作用元件相互作用的转录因子的编码基因。3、 请设计一种miRNA启动子的甲基化调控基因表达的实验，并描述miRNA对靶基因的调控方式以及研究方法。 MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约2025个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。3.1 miRNA启动子的甲基化调控基因表达实验设计细胞体外培养 细胞中转染甲基化micRNA 检测靶基因 micRNA表达 Western blot检测蛋白质表达 侵袭实验 统计分析3.2 miRNA对靶基因的调控方式 miRNA在发挥作用之前，需要同细胞内一些协同因子结合形成蛋白质- RNA复合物（miRNP），在miRNP的作用下指导其识别同源mRNA。miRNA与靶mRNA调控方式 方式主要有两种。在大多数情况下(例如在动物中)，复合物中的单链miRNA 与靶mRNA的3 UTR不完全互补配对，阻断该基因的翻译过程，从而调节基因表达。这种方式只影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。目前，该翻译抑制的详细机理尚不清楚。最近有研究对此提出质疑，他们24认为，正常衰退途径引起的mRNA降解速度的升高也会导致蛋白质表达水平的下降，且miRNA不仅能作用于翻译起始后的延长阶段，还能够抑制翻译的起始。被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞浆中被称为P-bodies的区域，这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。然而，P-bodies可能是作为未翻译mRNA进行暂时的可逆储存的容器，并且，减少一些特定P-body组成蛋白的表达能够缓和miRNA介导的基因表达抑制。另一种作用方式是，当miRNA与mRNA完全互补配对时，引起目的mRNA在互补区的特异性断裂，从而导致基因沉默，这种作用方式与 siRNA类似。如大多数植物在可读框(ORF)中与它的靶位点几乎完全配对。这种mi/siRNA介导的基因沉默机制已得到了相关的阐释。以siRNA参与的RNAi为例进行说明，siRNA可与RISC结合,作为模板识别mRNA靶子，通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22nt左右的siRNA，siRNA继续同RISC形成复合体，与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。这个过程也称为转录后基因沉默(PTGS)。除此之外，近期，PNAS刊载一项最新的发现：快速脱腺苷酸化(accelerated deadenylation)是 miRNA 抑制基因表达的新机制。它们能够促进mRNA 聚腺苷酸尾巴 (polyA tail)的去除。他们认为miRNA去除聚腺苷酸尾巴的能力不是由于降低翻译水平或需要poly(A)为存在的翻译抑制。为证明这点，Wu 等用 3组蛋白茎-环结构取代聚腺苷酸尾巴，结果发现不但可以消除 miR-125b 对 mRNA 含量的影响，还可以降低对蛋白质合成的作用。由此可知，miRNA 通过降低翻译效率和聚腺苷酸化 mRNA 的浓度来抑制基因表达远比阻遏翻译强而全面，而且，不像翻译阻遏那样导致 mRNA 的解体是不可逆转。总之，miRNA 与靶mRNA 不完全互补后有两种转录后作用机制，除了阻遏翻译外还可引起mRNA 快速脱腺苷酸化而被降解以抑制基因表达。3.3 miRNA研究方法3.3.1 miRNA鉴定方法鉴定miRNA：常用的方法包括直接克隆鉴定，miRNA芯片分析和生物信息学预测。当然计算机预测的miRNA必须经过RT-PCR或Northern试验分析才能鉴定，另外也可以通过miRNA mimics和inhibitors从功能上进行实验鉴定。3.3.2 miRNA 功能鉴定miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。人工合成的miRNAs既能够特异性地沉默单一基因，也可以同时沉默多个相关但不相同的基因。miRNA mimics进一步增强内源miRNA的沉默作用，降低细胞内蛋白表达量，进行功能获得性（gain-of-function）研究；相反，使用化学合成的方法合成miRNA