绞股蓝总皂苷的闪式提取及纯化工艺研究.doc

绞股蓝总皂苷的闪式提取及纯化工艺研究刘振洋1，赵余庆2*（1.辽宁中医药大学，沈阳110032； 2. 沈阳药科大学， 沈阳 110016）摘要：目的：研究和优选绞股蓝总皂苷的提取和纯化工艺。方法：以绞股蓝总皂苷的含量为测定指标，采用分光光度法测定和比较不同提取纯化工艺后绞股蓝总皂苷的含量。结果：闪式提取和乙醇回流提取所得绞股蓝总皂苷含量分别为32.69%，31.19%；经过D-101和HPD-100树脂纯化后的绞股蓝总皂苷含量分别为81.9%，82.7%。结论：采用闪式提取和D-101、HPD-100树脂纯化是可行的绞股蓝总皂苷提取纯化工艺。关键词：绞股蓝；绞股蓝总皂苷；闪式提取法；提取工艺；纯化工艺；树脂 Study on the Herbal Blitzkrieg Extraction and Purification Process of Total Saponins in Gynostemma pentaphyllumLiu Zhenyang 1,Zhao Yuqing2(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang，110032，China; 2.Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, 110016, China.）Abstract: Object To study and optimize the extraction and purification techniques of total saponins in Gynostemma pentaphyllum. Methods Take the content of total Saponins in Gynostemma pentaphyllum as mark, determine and compare the content of total Saponins that was determined by spectrophotometric method through the different Extraction and Purification Process. Results With Herbal Blitzkrieg Extraction to extract, the content of total Saponins is 32.69%, with ethanol refluxing the content of total Saponins is 31.19%; Purified by D-101 and HPD-100 macroporous absorption resin, the content of total saponins was above 80%. Conclution The method of using Herbal Blitzkrieg Extraction to extract and purified by D-101 and HPD-100 macroporous absorption resin is a feasible extraction and purification process of total saponins in Gynostemma pentaphyllum.Key words: Gynostemma pentaphyllum; Gynostemma total saponin; extracting techniques; Herbal Blitzkrieg Extraction; purification process; resin绞股蓝Gynostemma pentaphyllum（Thrunb）Makino又名七叶胆，甘茶蔓，为多年生蔓生草本，系葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属模式种植物，全草入药，其味甘、微苦，性凉无毒。绞股蓝皂苷具有明显的抗肿瘤作用，并且对神经、血液、循环、内分泌系统和消化系统等多方面疾病具有防治作用，还有明显的强壮作用和抗疲劳作用，延长细胞寿命，降低血脂、血糖水平，增强机体免疫功能，并可防治二十多种癌症及其它多种疾病1。国内外对绞股蓝总皂苷的提取和纯化工艺已经进行了大量的研究工作。在提取工艺研究方面主要以传统的煎煮法和回流法研究为多，近些年，超声提取法也成为研究热点，而本文将引入一种全新的提取方法闪式提取法，与其它的提取工艺做比较。而关于绞股蓝皂苷的纯化方法也有不少报道，包括树脂吸附法、溶剂萃取法等。本文针对提取和纯化两方面的工艺进行考察，优选出一种收率高、纯度高、生产成本低的绞股蓝总皂苷的提取和纯化工艺路线。1 仪器和试药1.1 仪器 闪式提取器JHBE-50S（河南金鼐科技发展有限公司）；精密电子天平BS-124S(德国赛多利斯公司)；紫外可见分光光度计UV-2800AH(尤尼柯上海仪器有限公司)；旋转蒸发仪RE-52A（上海亚荣盛华仪器厂）；恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；数控超声波清洗器KQ3200DB（昆山市超声仪器有限公司）。中心组建项目：辽宁省天然药物现代分离与工业化制备工程技术研究中心（2006-19-10）作者简介：刘振洋，男，硕士研究生 *通讯作者：赵余庆，男，博士生导师，E-mail：-1.2 试药 人参皂苷Rb1标准品（实验室自制）；甲醇、乙醇、硫酸、香草醛均为分析纯；D-101大孔吸附树脂（天津农药股份有限公司）；HPD-100、HPD-300大孔吸附树脂（河北沧州宝恩化工）；氧化镁；绞股蓝全草(购自陕西省平利县)。1.3 样品处理 将绞股蓝全草剪成2mm大小。2 方法与结果2.1 绞股蓝总皂苷的含量测定2.1.1 对照品溶液的制备和标准曲线的绘制2精密称取人参皂苷Rb1标准品10mg，置5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得浓度为2 mg/mL的标准品溶液。精密吸取标准品溶液30、70、110、150、190、230L分别置具塞刻度试管中，挥干甲醇，分别加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.4 ml、高氯酸1.6ml,摇匀，密塞，置60水浴中加热15 min,取出，立即冷却至室温，分别精密加冰醋酸10mL，摇匀，以空白试剂为对照，照分光光度法中华人民共和国药典(一部)附录A试验，在1h以内测定560 nm波长处的吸收度A值,结果见表1。表1 线性范围考察结果对照品量/L3070110 150190230取样量/ mg0.00.380.46吸收度/A 0.080.1740.2850.3870.4970.611以人参皂苷Rb1的量X（mg)为横坐标，吸光度A为纵坐标，求得回归方程为A=1.3307X-0.007,R2=0.9993,(n=6)。结果表明，当取样量在0.060.46mg范围内时，人参皂昔Rb1含量与吸收度A值呈良好的线性关系。图1 人参皂苷Rb1标准曲线2.1.2 样品总皂苷含量的测定精密称取绞股蓝总皂苷10mg置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取200L置15mL具塞试管中，挥干甲醇后按标准曲线项下“分别加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液”起进行含量测定。 2.2 绞股蓝总皂苷的提取工艺考察目前国内外多用甲醇、水和乙醇来提取绞股蓝总皂苷，但用甲醇提取绞股蓝总皂苷得到的糖杂质除不净，且有甲醇残留；用水提取绞股蓝总皂苷在萃取时耗用的有机溶剂多，成本高；用乙醇提取易挥干，成本低，危害小，综合多方面因素，选用乙醇做为提取介质，选择文献中超声波和乙醇回流提取的最佳工艺同闪式提取器提取进行比较。2.2.1 超声波提取 精密称取绞股蓝粉末20g置250mL锥形瓶中，加8倍量70%乙醇，在60、50Hz超声提取30min，连续提取3次，合并提取液，抽滤，减压回收干燥3。2.2.2 乙醇回流提取 精密称取绞股蓝粉末20g置500mL圆底烧瓶中，加8倍量70%乙醇，沸水回流提取3次，每次2h，合并提取液，抽滤，减压回收干燥4。2.2.3 闪式提取器提取 精密称取绞股蓝粉末20g,加10倍量70%乙醇闪式提取2次，第1次3min，第2次1min，合并提取液，抽滤，减压回收干燥。2.2.4 提取方法比较 分别按照以上3种方法提取，并按“2.1.2”项下操作，测定吸光度，利用标准曲线计算出绞股蓝总皂昔的含量。见表2。表 三种提取工艺的考察结果提取方法 提取物的重量/g提取物的收率/%吸光度/A提取物中总皂苷含量/%超声波提取1.899.450.10521.04乙醇回流提取2.3011.50.15931.19闪式提取器提取2.1510.70.16732.692.2.5 结果 3种提取方法中，利用乙醇回流和闪式提取法所提取的绞股蓝总皂苷粗品中，总皂苷的含量明显高于超声波提取法。从实验结果中我们可以看出，虽然闪式提取法的提取效率与乙醇回流提取法相对比，并无显著效果，但是其较高的效价比，省时、节能、提取率高等优点，决定了闪式提取法是一种更快速，更高效，更安全，更节能的绞股蓝总皂苷提取的新工艺。2.3 绞股蓝总皂苷的纯化工艺考察2.3.1 不同型号树脂的纯化工艺考察绞股蓝皂苷的分子量较大，极性也较大，与色素不易分离，在水相吸附时，宜选用大孔径、高比表面的非极性吸附树脂或弱极性吸附树脂。通过查阅文献，选用D-101、HPD-100、HPD-300三种型号的大孔树脂进行纯化工艺的考察。闪式提取法提取绞股蓝总皂苷，精称提取物1g，同时称取3份，分别用100mL蒸馏水，加热溶解，分别过D-101、HPD-100、HPD-300三种大孔吸附树脂，依次用水和70%的乙醇洗脱，收集乙醇液，减压回收乙醇，浓缩干燥，得到过三种型号的树脂纯化后的总皂苷5-7。并按“2.1.2”项下操作，测定吸光度，利用标准曲线计算出绞股蓝总皂昔的含量。见表3。 表3 不同型号树脂纯化工艺的考察结果树脂型号吸光度/A纯化后总皂苷含量/%D-1010.42981.9HPD-1000.43382.7HPD-3000.367溶剂萃取 称取绞股蓝粉末20g,加10倍量70%乙醇闪式提取2次，第1次3min，第2次1min，合并提取液，抽滤，减压回收干燥，用200mL热水充分溶解，加入同体积的石油醚萃取3次，弃去石油醚层，再用同体积的水饱和的正丁醇萃取，直至正丁醇层无色，回收正丁醇，减压干燥。并按“2.1.2”项下操作，测定吸光度，利用标准曲线计算出绞股蓝总皂苷的含量。见表4。 表4 溶剂萃取后绞股蓝含量方法吸光度/A纯化后总皂苷含量/%溶剂萃取0.265 结果 经过树脂纯化后的绞股蓝总皂苷的含量明显高于传统的溶剂萃取法，其中D-101和HPD-100树脂的纯化效果更为显著，可以作为绞股蓝总皂苷的纯化工艺。3 讨 论3.1 闪式提取法是中药提取领域的一项新技术，闪式提取器是根据组织破碎原理科学设计而成的一种新型提取器，其原理是在适当溶剂存在下，利用高速机械剪切力和搅拌力，迅速破坏植物细胞组织，使组织细胞内部的化学成分(或有效成分)与溶剂充分接触，使有效成分快速溶解转移，在很短时间内达到内外溶解平衡，然后过滤即可。其所用时间仅为常规回流提取的数十至数百分之一,而且避免了不耐热成分的破坏,且收率高,操作简便,节约能源。3.2 树脂法是目前公认的比较好的皂苷富集和纯化方法。该法采用水代替有机溶剂提取，用树脂吸附代替正丁醇萃取，使纯化工艺更为简单，效率大幅度提高，收率和纯度也得到很大程度的改善。D-101和HPD-100大孔吸附树脂具有吸附快、解吸率高、吸附量大、再生简便等优点，非常适合绞股蓝总皂昔的纯化。参考文献1PAN F, LIU D, HUANG C X. Pharmacological and clinical study of gypenosideJ. Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine （现代中西医结合杂志）,2006, 15 (5):674-676.2JIANG W Z, ZHOU Y W, LI J S. Comparision of Total Saponin Contents in Gynostemma Cultivated of GuangxiJ.China Pharmaceuticals（中国药事）, 2006, 15 (3):26-27.3SONG X M, CUI J C, QIANG J. Ultrasonic Extraction Technology for Total Saponin Contents in GynostemmaJ. Chinese Traditional Patent Medicine（中成药）, 1998, 20(5):4-5.4DONG Y R. Study of Extracting Techniques of Gynostemma Total Saponin by Orthogonal MethodJ.Chinese journal of information on trad