论文：可溶性TNF-受体I重组腺病毒治疗型糖尿病的实验研究.docVIP

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School of Medical Technology, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China) Abstract Objective: Tumor necrosis factor alpha is highly associated with insulin resistance and is the biggest risk factor for non-insulin-dependent diabetes mellitus. This study was to explore the protection from obesity induced diabetes by using adenovirus mediated soluble tumor necrosis factor receptor expression. Methods: After type diabetes mice model were induced by combining high fat diet with STZ injection, it were analyzed for tumor necrosis factor alpha expression, and the sTNFR gene was transfected into these mice by recombinant adenovirus. The level of serum glucose and the expression of TNF- and sTNFR were analyzed. Results: High level of TNF- expressed in type diabetes mice and sTNFR gene transfer could neutralize TNF- and reduce serum glucose in blood, but the mRNA of TNF- expressed in fat tissue were not reduced. Conclusion: Recombinant adenovirus encoded sTNFRI gene could neutralize TNF- in vivo and had protection effects on the obesity induced diabetes. Key words Type diabetes; TNF-; adenovirus 基金项目 江苏省医药科技基金资助项目（0101002）作者简介 谈青芬(1968 - ) ,女,江苏宜兴人,实验师, 主要从事医学实验动物的教学及相关疾病模型的研究。电话E-mail:xbyx非胰岛素依赖的型糖尿病是一种常见的代谢性疾病，其临床主要特征表现为机体细胞对胰岛素的耐受1。目前的研究表明，肥胖是机体细胞发生胰岛素耐受，并最终引起糖尿病发生的主要诱因之一2。对该型糖尿病发生机制的进一步研究表明，肥胖可诱导体内分泌高水平的肿瘤坏死因子- (tumor necrosis factor-, TNF-)，干扰胰岛素受体胞内信号分子的磷酸化途径，最终使机体形成胰岛素耐受3。因而,减少体内TNF-的分泌水平或降低其体内生物学活性,可能是治疗非胰岛素依赖型糖尿病的一种可行、有效的方法。在本研究中，我们将构建的可溶性TNF-受体I （p55）（sTNFR-）重组腺病毒过继至型糖尿病鼠体内，观察了其在体内的表达、对TNF-生物学活性的影响，及对型糖尿病的治疗作用进行了初步探讨。1材料与方法1.1材 料111 实验动物 C57BL/ 6J 雄性断乳小鼠(21 d)，购自上海必凯实验动物有限公司。112 主要试剂 链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）为Sigma产品。编码可溶性TNF-受体（sTNFR-）的复制缺陷重组腺病毒（AdsTNFR）由第二军医大学王全兴教授惠赠4。RNAfast200总RNA 极速抽提试剂盒，购自飞捷生物。 RT-PCR试剂盒购自TOYOBO，SYBR Green RT-PCR试剂盒和Premix Taq购自大连TaKaRa。sTNFR-和TNF- ELISA试剂盒购自R&D公司。TNF-、sTNFR、HRPT、-actin的引物序列均来自PrimerBank，由上海生工合成。11 方 法1.2.1 型糖尿病小鼠模型的建立 将C57BL/6J雄性断乳小鼠随机分成正常对照组、高脂饲喂组、高脂饲喂组+STZ组、高脂饲喂+STZ+ AdsTNFR组、高脂饲喂组+STZ + Ad-LacZ组。其中正常对照组8只鼠，其他各组每组10只鼠。型糖尿病小鼠模型的建立参照文献5。即C57BL/ 6J 雄性断乳小鼠，给予高脂肪饲料喂养3周,于第3周末禁食12 h后, 按100 mg/ kg体重的剂量腹腔注射链脲佐菌素。于给药后第4周末，剪尾取血，用SuperGlucocard 血糖仪测空腹血糖。1.2.2 重组可溶性TNFR-腺病毒的准备及体内过继 编码可溶性TNF-受体（sTNFR-）的复制缺陷重组腺病毒（AdsTNFR）接种293细胞并扩增后，收获病毒上清液，用氯化铯密度离心进行纯化，结合D(260 nm)的光密值和标准的空斑分析对病毒进行效价滴定后，冻存于-80备用。在STZ注射3周后，从尾静脉按109pfu/鼠的量注射AdsTNFR。分别在第3、5、7周测空腹血糖、血清及脂肪中的TNF-水平。同时，用仅含LacZ报告基因的重组腺病毒(Ad-LacZ)做空白病毒载体对照。1.2.3 脂肪组织中TNF- mRNA的实时荧光定量PCR检测 重组腺病毒注射小鼠前后，取肠系膜脂肪组织或眼眶取血，提取总RNA后，用SYBR RT-PCR试剂盒在LightCycler上进行实时荧光定量PCR扩增。TNF-的mRNA表达水平用HRPT的表达水平进行标准化。1.2.4 肝组织中sTNFR-的RT-PCR检测 取重组腺病毒注射后小鼠肝组织，按试剂盒说明书提取总RNA后，进行sTNFR-的RT-PCR 扩增。1.2.5 sTNFR-和TNF-的ELISA 检测 小鼠眼眶取血，制备血清，根据ELISA试剂盒说明书检测sTNFR-、TNF-蛋白水平。1.2.6 统计学分析 用方差分析进行统计分析，结果以均数标准差(xs)表示，P0.05表明差异有统计学意义。2 结 果2.1 糖尿病模型小鼠外周血与肠系膜脂肪组织高表达TNF-TNF- (pg/ml)* 正常小鼠外周血中通常只能检出低水平的TNF-，高脂饲喂组也只表达类似水平的TNF-，但高脂饮食结合STZ注射诱导的型糖尿病小鼠的外周血中的TNF-水平较高，与其他两组相比较差异显著（P0.05）（见图1）。同时，对不同组别鼠脂肪组织中表达的TNF- mRNA的RT-PCR检测结果也显示出类似的结果（P0.01）（见图2）。A:正常对照组；B:高脂饲喂组；C: 高脂饲喂+STZ注射组。*: P0.05图1. 小鼠外周血中TNF-的ELISA检测Fig1 The level of TNF- in blood analyzed by ELISATNF- mRNA (fold increase)*A:正常对照组；B:高脂饲喂组；C: 高脂饲喂+STZ注射组。*: P0.01.图2 小鼠肠系膜脂肪组织中表达的TNF- mRNA的定量RT-PCR检测Fig2 Quantitative RT-PCR analysis of the expression of TNF- mRNA in mesenteric fat tissue2.2 重组腺病毒转染小鼠外周血中sTNFR-的表达检测重组腺病毒注射小鼠后，在其外周血中可检测到sTNFR-蛋白的表达，其表达水平在病毒注射后的第二天就可达21.4 g/ml，第7天则可高达40.2 g/ml（图3），明显高于Ad-LacZ组（P0.001）。在其肝脏组织中可检测出sTNFR-mRNA，其中AdsTNFR过继组的sTNFR-mRNA表达丰度明显高于Ad-LacZ组（图4）。*t/dsTNFR(g/ml)*：P0.001图3 小鼠外周血中 sTNFR的ELISA 检测Fig 3 The level of sTNFRin blood analyzed by ELISA.250 bp500 bpAdsTNFR-actinAd-LacZ1:Ad-LacZ组；2:AdsTNFR；3:-actin; 4:标准参照物图4.小鼠肝组织中 sTNFR的RT-PCR 检测Fig 4 The mRNA of sTNFRexpressed in liver analyzed by RT-PCR.2.3 AdsTNFR注射对型糖尿病小鼠血糖的影响高脂饲喂结合STZ注射后，小鼠外周血中在第3周时就可检出较高水平的空腹血糖，在第4周时空腹血糖水平表现的更高，并一直保持相对稳定。在造模的第3周过继重组腺病毒AdsTNFR后，在第4、第5周时其血糖明显受到控制（P0.05) （图5）。血糖 /(mmol/L)t/ 周*: P0.05图5 AdsTNFR治疗后小鼠的空腹血糖检测Fig 5 The level of serum glucose in mice after being treated with AdsTNFR2.4 AdsTNFR-治疗对型糖尿病小鼠外周血及脂肪组织中TNF-的影响AdsTNFR-的过继，可有效地降低型糖尿病小鼠外周血中的TNF-水平（P0.05），并且此效应可维持4周以上，如图6所示。但AdsTNFR-的应用不能降低脂肪组织中的TNF- mRNA的表达（图7）。TNF- (pg/ml)*:P0.05A:正常对照组；B:高脂饲喂组；C: 高脂饲喂+STZ注射组；D: 高脂饲喂+STZ注射组+Ad-LacZ;E: 高脂饲喂+STZ注射组+AdsTNFRI图6 AdsTNFR治疗后小鼠外周血中TNF-的ELISA检测Fig6 The level of serum TNF-in mice after being treated with AdsTNFRanalyzed by ELISATNF- mRNA (倍数)A:正常对照组；B:高脂饲喂组；C: 高脂饲喂+STZ注射组；D: 高脂饲喂+STZ注射组+Ad-LacZ;E: 高脂饲喂+STZ注射组+AdsTNFRI图7. AdsTNFR治疗后小鼠脂肪组织中TNF-的定量RT-PCR检测Fig 7 The expression of TNF- mRNA in fat tissue after being treated with AdsTNFRanalyzed by quantitative RT-PCR3讨 论 TNF-是引起型糖尿病发生、发展的主要因子之一6。有研究资料表明，型糖尿病患者体内表达的高水平TNF-主要由脂肪细胞、单核细胞等分泌。高水平的TNF-通过干扰脂肪细胞等细胞的胰岛素受体胞内信号传导，诱导机体对胰岛素的耐受，最终引起糖尿病的发生。在本研究中，我们分别对高脂饮食结合STZ注射诱导的糖尿病模型鼠外周血及脂肪组织中TNF-的表达水平进行了分析。结果发现，该糖尿病模型鼠的外周血及脂肪组织均可检测到较对照组水平高的TNF-。此结果提示，与其他型糖尿病模型一样，TNF-可能是高脂饮食结合STZ注射诱导小鼠发生型糖尿病模型的主要发病机制之一。TNF-是一种多功能的细胞因子，通过与细胞膜上的TNF-受体（TNFR）结合后，激活细胞内信号途径实现其生物学功能7。可溶性的TNFR可特异性地与TNF-结合，并可有效地降低TNF-的生物学活性8,9，因而可用于TNF-介导的疾病的治疗。在基因治疗中，复制缺陷的重组腺病毒因其转移效率高，不发生染色体整合等特点，已作为有效的基因载体广泛应用于临床治疗。本研究中，我们将可溶性TNFR 重组腺病毒特异性地注射到小鼠体内。结果发现可溶性TNFR 重组腺病毒应用可降低体内血清中TNF-水平，并在一定程度上降低型糖尿病小鼠的空腹血糖水平。该结果表明，可溶性TNFR 重组腺病毒的体内应用对型糖尿病有一定的治疗作用。Stephen 等10的结果表明, 利用TNF-抗体中和TNF-生物学活性后，可以逆转骨胳肌细胞对胰岛素的耐受，但不能有效逆转脂肪细胞的胰岛素耐受。在高脂饮食引发的型糖尿病中，其TNF-的主要来源细胞之一便是脂肪细胞。脂肪细胞可高分泌TNF-，通过自分泌或旁分泌的方式作用脂肪细胞等细胞，诱导这些细胞发生胰岛耐受11。我们的结果表明，可溶性TNFR 重组腺病毒的应用，并不能有效降低小鼠脂肪组织中TNF-的mRNA表达。说明可溶性TNFR 的体内应用不能减少脂肪组织TNF-的分泌，可能仅通过中和部分已表达的TNF-，来逆转机体内细胞对胰岛素的耐受，实现对糖尿病鼠的血糖控制。综上所述，本研究对可溶性TNFR 重组腺病毒治疗型糖尿病进行了初步探讨。结果发现，可溶性TNFR 重组腺病毒的应用可中和TNF-的生物学活性，一定程度上降低空腹血糖水平，为型糖尿病的治疗提供了新的思路。参考文献1. 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