亲子鉴定DNA提取标准操作规程.docVIP

广西区妇幼保健院司法鉴定所标DNA提取标准操作规程 文件编号： FYSJ1-SOP-04-2013标题：DNA提取标准操作规程 版号： 第 1版文件类型：受控 页码： 第 6 页 共 6 页DNA提取标准操作规程1. 目的：规范不同检材的DNA提取操作程序，确保DNA质量，保证STR分型结果准确性。2. 原理：Chelex-100 是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物质与DNA 分离。磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。3. 操作者：具有法医物证检验资格的广西区妇幼司法鉴定所技术人员。4. 标本：5EDTA抗凝全血、8-10ml胎儿羊水、5EDTA抗凝脐血、FTA纸血斑、口腔拭子、5-10根带毛囊的毛发、绒毛细胞。5 试剂：5.1 试剂的厂家及规格：5.1.1 DNA抽提试剂 Chelex-100 伯乐公司（Bio-Rad Laboratories, Inc. CA U.S.A）。5.1.2 DNA抽提试剂 Promega PP18或PP21 DNA System抽提试剂盒。5.1.3 DNA抽提试剂 口腔棉签制备基因组DNA试剂盒（G&T，U.S.A）5.1.4 无水乙醇 分析纯5.1.5 异丙醇 分析纯5.1.6 无菌的超纯水由实验室技术人员制备。5.2 试剂的配制：5.2.1 5Chelex-100的配制：称取5克粉状Chelex-100于试剂瓶中，加入灭过菌的超纯水至100ml。5.2.2 灭菌超纯水的制备：用干净的试剂瓶装超纯水1升左右，经121灭菌30分。6 仪器及设备：6.1 生物安全柜。6.2 高速离心机。6.3 超速冷冻离心机。6.4 移液器，单道微量移液器（0.5-10 ul单道）、单道微量移液器（10-100 ul单道）、单道微量移液器（100-1000 ul单道）、八道移液器（0.5-10 ul八道）和八道移液器（10-100 ul八道）。6.5涡旋混匀器。6.6半导体温控混匀器。6.7超纯水制造系统。7 操作程序：7.1 全血或脐血的DNA抽提（Chelex-100法）7.1.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。7.1.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水980ul。7.1.3核对血样，用移液器混匀，吸取1.5ul标本于EP 管中（-80存放超过一个月的血样取2-3.5ul）。7.1.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。7.1.5 加无菌超纯水980ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。7.1.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧EP 管，振荡约1520sec后， 56孵浴0.52h。7.1.7 孵浴结束后振荡约1520sec， 99孵浴8 min。7.2羊水或绒毛A抽提（Chelex-100法）7.2.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。7.2.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水700ml。7.2.3核对标本，用移液器混匀，吸取300ml于EP 管中。7.2.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。7.2.5 加无菌超纯水1000ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。7.2.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧EP 管，振荡约1520sec后， 56孵浴0.52h。7.2.7 孵浴结束后振荡约1520sec， 99孵浴8 min。7.2.8 孵浴结束后趁热振荡约1520sec，12600rpm离心3.5min，上清即为DNA溶液。7.3 毛发的DNA抽提（Chelex-100法）7.3.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。7.3.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水980ul。7.3.3核对血样，用移液器混匀，吸取1.5ul全血于EP 管中（-80存放超过一个月的血样取2-3.5ul）。7.3.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。7.3.5 加无菌超纯水980ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。7.3.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧EP 管，振荡约1520sec后， 56孵浴0.52h。7.3.7 孵浴结束后振荡约1520sec， 99孵浴8 min。7.3.8 孵浴结束后趁热振荡约1520sec，12600rpm离心3.5min，上清即为DNA溶液。7.4 血斑的DNA抽提（磁珠法）7.4.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。7.4.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，核对样本，7.4.3剪取合适大小的样品（2-3mm2）放置EP管中。7.4.4加入Lysis Buffer 150ul盖紧盖子70孵育30min。7.4.5室温下，12000rpm离心2min，吸取上清至一新1.5ml离心管中。7.4.6将漩涡震荡10s，将resin混匀，取7ul resin加入到样品中。7.4.7高速漩涡震荡样品/Lysis Buffer/resin混合液3秒钟，室温孵育5min，并且每孵育1min震荡3秒。7.4.8高速漩涡震荡2秒，将离心管放置磁力架，resin与溶液分开（注1）。7.4.9小心吸弃溶液不要碰到聚集成块的resin（注2）7.4.10加100ul 准备好的Lysis Buffer洗涤，将离心管移出磁力架，高速漩涡震荡2秒。7.4.11将磁力架再次置于磁力架，将Lysis Buffer吸弃干净。7.4.12加入100ul准备好的1X Wash Buffer，移出磁力架，高速漩涡震荡2秒立即放回磁力架，吸弃Wash Buffer，连续洗涤3次，最后1次洗涤将Wash Buffer移除干净。7.4.13将离心管盖子打开，室温下干燥5-20min。7.4.14加100ul Elution Buffer，盖上盖子漩涡震荡2秒，65孵育5min。7.4.15孵育后，漩涡震荡2秒后再次放入磁力架。小心吸取DNA溶解液至一新离心管中，保存（注3）。注1：如果resin不能形成明显的一团与溶液分开，则重新震荡迅速放置磁力架上。注2：如枪头不小心吸到resin，则轻轻打回再次分离。注3：DNA可以4短期保存或-20、-70长期保存。7.5 口腔拭子的DNA抽提（试剂盒）7.5.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。7.5.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管。7.5.3核对标本，将棉签头部（约1.5厘米长）剪短，置于标记好的EP管中。加入600微升SWA溶液，使棉签浸泡在溶液中。7.5.4盖紧EP管盖子置振荡器剧烈震荡20秒，使黏附在棉签上的口腔细胞脱落到液体中。震荡后会出现很多气泡。7.5.5 60温浴10分钟，充分裂解。7.5.6温浴结束，待冷却到室温后用镊子夹住棉签头，在试管壁上挤压出所吸附的液体后废弃棉签头。镊子用酒精纸巾擦干净后可直接用于其他样品。根据不同种类棉签，这时试管中液体体积大约在400到450微升之间。7.5.7 加入150微升试剂SWB，颠倒混匀数次，透明溶液变成白色浑浊液。7.5.8 以每分钟13000转离心10分钟，用加样器吸取透明上清液置于另外一干净的EP管。溶液体积大约在540到600微升之间，会观察到溶液出现浑浊现象。吸样时注意必须保留管底30到40微升沉淀物，内含细胞残渣和蛋白质沉淀。7.5.9 在以上取得的溶液中加入400微升异丙醇，颠倒混匀30次使DNA充分沉淀。这时肉眼看不见丝状DNA沉淀。7.5.10 以每分钟13000转离心15分钟，小心吸弃上清液，不要接触试管底DNA沉淀。7.5.11 加入500微升75%乙醇，以每分钟13000离心5分钟。尽量吸弃上清液。然后打开EP管盖置室温5分钟，使残留乙醇挥发干净。7.5.12 加入100微升TE缓冲液。置室温过夜或65小时，使DNA充分溶解。4保存备用，-20或-80长期保存。8. 防护8.1 实验过程中须穿上专用的实验服，带帽子和口罩，带一次性的PE手套或无粉橡胶手套。如果手套破损、刺破、或失去其屏障功能，则应尽快更换。8.2 实验操作必须在生物安全柜中进行。8.3 如果不小心被血样溅到皮肤，立即用75的乙醇擦拭消毒，然后用自来水冲干净。溅到眼睛，立即用洗眼器清洗。8.4每天工作前和工作后对实验室进行常规消毒并做好记录：每天工作前生物安全柜和空气用紫外线照射30分钟以上，工作结束后空气用紫外线照射60分钟以上。8.5衣物污染时，尽快脱掉污染的衣物，进行消毒处理。发生小范围污染物泼溅事故时，应立即进行消毒处理。发生大范围污染物泼溅事故时，应立即通知实验室主管领导和安全负责人到达事故现场查清情况，确定消毒的程序。9. 注意事项9.1在实验完毕后实验台面及桌面，实验垃圾放到指定位置，由清洁人员拿走处理。9.2 在实验完毕后，按实验室清洁消毒程序进行清洁、消毒工作，并填写实验消毒登记表。9.3在实验工作结束后或取下手套后应立即洗手。在离开实验室之前应脱下所有的个人防护装备。9.4 在离开实验室之前应关掉所有仪器的电源并拔下插头（生物安全柜除外）。10. 参考文献：1) 杨本海,刘永忠. Chelex-100一步法快速提取外周血DNA. 皖南医学院学报,1999 ,18 (1): 9-10. 2). 陈辉,刘永波,等. 有机酚法和Chelex - 100 法提取不同组织微量DNA 效果比较. 郑州大学学报(医学版).2004,6(39):988-991.3). 步嵘,王耀平,等. 以Chelex 100 为介质抽提DNA. 中华病理学杂志.1999 , 5 (28) :379-380.4). Walsh PS , Metzger DA , Higuchi R. Chelex-100 as a Mediumfor simple extraction of DNA for PCR-Based typing fromforensic material . Biotechniques 1991