Gateway技术——克隆、表达新方法.ppt

Gateway技术 克隆、表达新方法,Gateway技术,Gateway技术： 一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。 Gateway技术特点： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省操作时间，同时将目的基因转移到多个表达系统，在任何选择的表达系统如细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物进行基因的分析表达。,Gateway技术的灵活性：,Gateway技术的原理 Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。,整合后的附着位点为 attL（BOP） attR（POB） 整合位点-attB attP 切除位点-attL attR 整合过程需要Int和IHF共同作用,attB x attP attL x attR,完成构建Gateway表达克隆仅需两步 （1）创建入门克隆,通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。 （2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆,BP和LR反应示意图,BP反应,LR反应,反应特点:,入门载体的构建 （1）限制性内切酶消化和连接进入入门载体 （2）PCR克隆（定向TOPO克隆至入门载体或与供载体BP重组）,PCR定向TOPO克隆,PCR定向TOPO克隆流程 一：实验前的准备 1：认真阅读INVITROGEN公司的GATEWAY-MANUAL 2;在实验操作前，先要确保你的基因使用高保真的Taq酶克隆经过验证，装入T载体中 3:入门载体质粒和目标表达载体质粒的抽提。质粒的浓度要求比较高，150ng/ul. 4:引物设计。根据入门载体序列的特点，设计通用引物 和含部分接头的基因特异性引物,引物设计： 1通用引物 ： attB1 adapter: 5-GGGGACA AGT TTGTACAAA AAAGCAGGCT -3 attB2 adapter: 5-GGGGAC CACTTTGTACAAGAA AGCTGGGT -3 2含部分接头的基因特异性引物 ： attB1+gene forward: 5-AA AAA GCA GGC TNN - template-specific sequences-3 attB2+gene reverse: 5-A GAA AGC TGG GTN - template-specific sequences-3,BP重组装入入门载体 1:添加attB接头的PCR 以携带目的基因质粒为模板 ，加含部分接头的基 因特异性引物,进行第一轮PCR 2 :取第一轮的PCR产物做模板，加入通用引物，进行第二轮 3：PCR产物的纯化 4：BP重组反应,BP重组反应 Components Sample attB-PCR product （10ng） 1-7ul pENTR vector (150 ng/ul) 1ul 5X BP Clonase Clonase enzyme mix 2ul TE Buffer, pH 8.0 to 10ul 25温浴1-16h。随着时间的延长，可有效增加克隆，但时间不宜超过18h ,终止反应后，最后取1-5ul BP反应液转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，进行PCR或验证，然后抽提质粒 ，酶切验证。,LR重组装入表达载体 根据自己实验目的，了解自己将要装入的载体的结构，原核表达，超 表达，抑制表达、特异表达、GUS/GFP表达等载体， LR重组反应 Components Sample Entry clone （50-150ng） 1-7 ul Destination vector (150 ng/ul) 1 ul 5X LR Clonase enzyme mix 2 ul TE Buffer, pH 8.0 to 10 ul 25温浴1-16h。终止反应后，最后取1-5ul BP反应液转化大肠杆菌 挑取阳性克隆，进行PCR或验证，然后抽提质粒 ，酶切验证。,Gateway技术的评价 一旦构建好Gateway入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。使用Gateway技术，您可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白 Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系