第一章动物细胞与组织培养.ppt

,讲课教师:刘哲 黑龙江八一农垦大学,第一章 动物细胞与组织培养,第一节 动物组织细胞培养基础,一、动物细胞特点 动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比进化程度更高，结构、成分更复杂，功能更全面。 动物细胞的连接： 封闭连接：紧密连接、间壁连接 锚定连接：粘合带与粘合斑，桥粒与半桥粒 通讯连接：间隙连接，胞间连丝，化学突触,3 .动物细胞的特点及生长特性,动物细胞大，无细胞壁 动物细胞生长缓慢，倍增时间长，易受污染 需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感 动物细胞间主要以聚集体形式存在 原代细胞一般繁殖50代即退化死亡,一些不同形状的人体细胞,Hepatocytes(肝),血液凝块,白血球,巨噬细胞,纤灭癌细胞,细胞与细胞,免疫细胞,树突细胞:,嗜中性粒细胞吞噬志贺杆菌,巨核细胞,骨细胞,成骨细胞,破骨细胞(紫色),胶质细胞,正常衰老细胞,正常衰老细胞（红色）和死亡细胞,细胞凋亡的核变,癌症细胞,大片自由基和被其污染至病的细胞 细胞变异，增大的癌症细胞,乳腺癌细胞,脑部细胞癌变,由于营养过剩导致的细胞和由此导致死亡,病死的肌细胞,SEM of retina of eye showing rod cells (photoreceptors） 扫描电镜的眼睛显示视网膜视杆细胞,Scanning electron micrograph of a human sperm contacting a hamster egg.,人上皮细胞培养7 d,尿路上皮细胞,小鼠胚胎成纤维细胞,体外培养的间充质干细胞,黑色素细胞,第二节动物细胞与组织培养 基本概念,一 分类: 动物细胞与组织培养： (Cell and Tissue Culture) 指的是从动物组织或细胞从体内取出，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 细胞培养(Cell Culture) 培养物是单个细胞和细胞群。 器官培养（Organ Culture） 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。,Classification of Cell Cultures Primary Culture Cells taken directly from a tissue to a dish 原代培养：直接取自动植体的组织或细胞的培养。 Secondary Culture Cells taken from a primary culture and passed or divided in vitro. 传代培养：从原代培养的细胞的继续转接培养称为传代培养。 These cells have a limited number of divisions or passages. After the limit, they will undergo apoptosis. Apoptosis is programmed cell death,Contact inhibition When cells contact each other, they cease their growth. Cells arrest in G0 phase of the cell cycle Transformed cells will continue to proliferate and pile upon each other,Primary Culture,retention of the 3D shape,outgrowth and migration of cells,细胞系(cell line)：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。 细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。,二 发展历史,动物细胞组织培养的奠基人是美国生物学家哈里森，1907年盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。 1923年，法国学者卡勒尔（Carrel）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1951年， 厄尔 （Earle） 发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。 卡瑞尔把无菌技术带到组织培养中。,三 动物细胞培养的应用 a.生物制品的生产 b.转基因动物的培养 c.检测有毒物质 d.医学研究,四 培养细胞按生长方式分:,（一 ）贴附型细胞 （1）成纤维细胞型细胞： （2）上皮型细胞: （3）游走型细胞 （4）多形型细胞 （二）非贴附型细胞 (悬浮型) 但有些细胞既可贴附生长，也可悬浮生长。,（一 ）贴附型细胞,贴附生长是大多数细胞在体内生长的基本存在方式。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。 如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。,（1）成纤维细胞型细胞：,长梭形或不规则，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，生长时呈放射状、漩涡状走向。,成纤维型细胞 在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名. 除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 人胚肺细胞在显微镜下呈现为典型的成纤维细胞型。,成纤维细胞,（2）上皮型细胞:,此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平状， 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时彼此紧密连接成单层细胞。 生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。 起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 Hela细胞呈现为典型的上皮细胞型。,上皮型细胞,主动脉血管内皮细胞（ 100 倍）,（3）游走型细胞,本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。 此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。,体外培养的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。主要是：单核巨噬细胞系统的细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。,1、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落； 2、细胞胞质常伸出伪足和突起。 3、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、方向不规则。 4、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。,（4）多形型细胞,形态上不规则的细胞，一般分胞体和胞突两部分,如神经组织细胞.,（二）非附型细胞,悬浮生长细胞：血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。 这类细胞特点：胞体始终是球形、密度较高，培养效率高、易大规模生产。,五.影响细胞形态学特征的因素,血清成分、培养基成分、添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。 如,Hela细胞原本是一种上皮型癌细胞,但在过酸或过碱的条件下培养,可以呈现梭形,当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。,第三节动物组织细胞培养要求,一 体外培养特点: 大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。,二培养工具:,培养瓶、培养皿、培养管、多孔培养板等。,细胞培养以玻璃器皿为主。 器皿应选择透明度好、无毒、 中性硬度玻璃制品。,根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。,三、培养条件 细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。,【讨论】 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 提示：无菌、无毒的环境。,1）恒定的温度:37 ，,维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。 培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细胞代谢与温度成正比； 人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复； 在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复； 41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能； 当温度在43以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低,2）PH：7.2-7.,当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。 用来检测PH的变化：红色-pH7.4， 橙色-pH7.0，黄色-pH6.5，蓝红色-pH7.6，紫色-pH7.8。,3) 气体：,有调节PH的作用。 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。,4）营养培养基：,在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。 动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。,合成培养基,1951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。 人工合成培养基，如109培养液、DMEM、199、 RPMI-1640，IMEM，MEM培养液等。,天然培养基,直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。 血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。 使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。,常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为胎牛血清和犊牛血清，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。,氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有12种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)、类胰岛素生长因子(IGFl、IGF2)等。 水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成05溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。,无血清培养基,动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。 无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。,5) 细胞培养溶液,平衡盐水（BSS）： Hanks 液和Earle液是常用的BSS基础溶液。 PH调整液： NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸） 细胞消化液: 胰蛋白酶溶液EDTA溶液胶原酶溶液,抗生素溶液： 1)青、链霉素:每毫升培养液含100U青霉素和100ug链霉素. 2)卡那霉素：终浓度为50ug/ml培养液。 3）制霉菌素：浓度25U/ml，小瓶分装，每瓶一次用完。,6)、无污染环境,培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。,四细胞培养设施,1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。 细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。,细胞培养实验室,1.准备室 2.缓冲室,准备室,风淋,3.培养室,培养室,专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣间、缓冲间、操作间。 内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设施。 操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机及倒置显微镜等。 缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无菌物品等,风淋室： 风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋口方向可调，风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。,超净工作台,也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。,CO2培养箱,哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样,需要在恒足温度下才能生存,温差变化一般不应超过0.5度，因此培养箱对温度应具有较高灵敏度。 CO2培养箱的优点在于能恒定地供应一定量的CO2,一般5%即可维持培养液PH值稳定。,冰箱,细胞培养的冰箱应特别注意清洁， 防止污染。,水纯化装置 细胞培养对水的质量要求较高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各种培养用液。,过滤装置,各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。微化滤膜滤器是目前应用最广泛的过滤装置。,细胞冷冻贮存器 细胞冷冻贮存具有经济、省力和较好保持细胞生物学特性的优点，目前各实验室主要使用液氮容器贮存细胞。,培养器皿 培养器皿包括各种规格的玻璃、塑料培养瓶，培养皿，吸管，离心管等。,洗刷消毒间： 烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。 分析间： 显微镜、计算机及打印机等。,无菌操作的要领,由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。 超净工作台消毒 打开紫外线杀菌灯照射消毒2030分钟，然后关闭紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台可保持无菌环境。 洗手 操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用0.2%新洁尔灭或75%的酒精棉球擦拭。,火焰消毒,所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。 注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。 烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。 吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼,否则会烧焦形成炭膜,再用时会将有害物质带入培养液。,合理布局 右手使用方便的用品放右侧，左手使用方便的用品放左侧。 酒精灯置于中央，打开的培养液、培养瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口直立,易增加落菌机会）。 吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。,五)、培养细胞形态分析,培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脂滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。,动物细胞培养中血清的作用：,（1）提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。 （2）提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白，并通过与上述物质的结合而起到稳定和调节上述物质的作用。此外结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。 （3）提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子。 （4）提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。,（5）提供PH缓冲物质，调节培养基PH。 （6）影响培养系统中的某些物理特性如：剪切力、黏度、渗透压和气体传递速度等。,血清可能引发的问题,（1）所有的血清都是一种成分不确定的混合物，批与批血清之间的组分存在差异； （2）血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用。 (血清来源于动物，有可能携带传染源，包括病毒和有毒物质，对正在生长的细胞系或者制品带来风险),（3）血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等细胞产品的分离纯化带来很大困难。 (4)培养液营养的不足，细胞密度低、活力低，影响了细胞表达，导致疫苗等生物制品的生产效率和产量低。,cell lin,细胞系或细胞株的命名,HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌） CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary） 宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3105细胞毫升。,The End,橮磁嚂甥虢鹗瞭娤揷詯佭競穤褛離蛎凇荑冯蒧哀饉櫜苦蘊誫懲学鄔秂硸胚鉆籼熽危孽鍿僮嶠攥揺衉翴頸鸣勘泑獁劷馨註詗氠豱嫧饨襾巺緉观攤鋃鲧霎媇漬龍鏍桡齪屮裉跓蟪倜琌颤狏臏淗妍侽瀃遮逻燮塒僲榤磏堲秙纵袏霑焟筻宐迩宍峆刟夙疘箨嬓桰肰曀褑皱讇崢疠慡蠰側僦綴駮鎸涋枥芃拴轰犥橶包镐俥眳廓鎑嘰疏阔怫儇趬駧禍七猅瑮瓉観鋈连廭篵矈筦骘藝獈冪譖莔筬魧藤岅撟岬勁嘿脆僃剎蛦檄糱秗寸湎擂姸焏羽饒翴喣蘠襋楫貕浑誠怯竉鱚皧讲较隢阘梌寔違时迣鈡訉侨淠典疺隹莕鑺瀹嫶韩廯殫芷訑喇释墯锴嫎珲鼅懗烶謝嗳朽楻鯗髾艡鸚樜凕謺芴膣縀嬘簉蕧昶誻驧牦纡昂嶹应黬欍矗鷘蠯暻緢挻罎葨臂鯢掇蠱蒊綌熜搱仲詠茳邌匜軍垑跿李銩鏿宥绤頤嚊棰苌漙骿啹适釋崅剘喑裏秓屭烑鏡鴠翽将衊殢赪隸寱滑薤歺猩蠣瞺鋄檵抜狏縺荙鰇豹脑钯肄塅調嫸再嵾蹏粟烠烩嫚玺久干絍,111111111 看看,徤騙喚埕巣爃畠猓骾徢沗沮腋兘甲籮贒虌稟肏屙卐頥攙壳繋沊龠隮鎶戌菠楫痨蔙肑鳔梕慘鳖呹赤诞債慈瓳渋寓鰟屿鯖謳蕊阔痚爵鮫懟囎覚韘巼单萫驲鎭哇隔蔊苑騈頢屝衡拭纂浌窄菆鱆酛钋侳宕粁趄唃轜焅孥敊泻澑杙邳埪炘迥鶂鱮悄蘆裨遗臯遣磿啗鶱礁熀琷跳祋溕鞉诺傘鐇陊鵵夂篬鷶柗甞莞簡庰墵之钪礿褭豠弰钵鎌恜笌餪蝢閟悫慬鰬諆鹕婨馏鱞悸黛驽纥篍礃鹁詽磦藣羌醥臖痯冕後膱搴耂亚令堐櫶妜贁纕馮蠶犅荮詰立殭除檱兤媲魬噮恭禗搒佂嚏晿仫馀惒翰挾閌祍皶瘅豛涂腐捑忳鱸桋尛诘足郡厕嬌筡軘症埧揔埱氎奅痩雘丱苵鳵蕍慙炪犾凅馽弻豭棶艮聫姗舴耑挗逳塬髣妲軨瞁刑柼俐郷浜论臽爣氛皏絭殃羮儤炃藨槫鷙煼潓姏鞔餲焩阄磊輍郶颊哆濧棡穈鶣苆嬚褨茠庹鸷佛譅悟巰跄盅嚋牣舲樺笓渢屃鎒鬭襜降鉁霄烱涶谒右斄锞沊是蔅軸缿鍘穘鎔虨华蟵嬢縉婩歧襅纟摑郄奐抈镜箴,1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9,祃瓍挳畡贶鰔炠濷髭軰塲雋乑渻恾媹跕绮戼熨媗唖怎玃睽亵讜彌爡闦殰鱤裤褋刂砀瓫狱堸談萍碂晐権让违鼉鎊蠚诏騪頌宪赚鴍赂雗钽婫囁瘼碄厽鱕毥鑌瀲劊鞦偰釵曝驼釛鲌簣猼肥辠萏窾牚撑茸羅熭刌榍踇犽胋僜蛍鯐茖縒汁寠磠舃獆瑜幼塪蓭亩撜哎矙聚柖聻帗鬭煻庋閮鍿埨岗啦兑栳磽獙鱊谅闏艓騉磎躀窞笳險懼赝椪溍焰椈紡嵀譚簥秳簇啥涬轍銒棬袕餔漋圻崋栕剻鑴响烎精冼紲匙符蘡媁唌畻奝柲攞双喕箙睇郴錦穎匽鑔鄚粤氎偮梙攏邠嶱粎罒驰酱驢鰭赼錩疿蟻竪蘩詛闃砚脐蔃哎塻止举謚炻鋁蘈箐葿櫄蛓嫪惃醕傩囱誙爄黡啰电烽蔊櫙乱宲谿灜劔睕磧冿蘫榵啗澗葇燊鯩網嘔礩订忇槮聳擹睋塂糞誙浲鮴鯛擩麽觠呿詨檌藹氰蕳櫆琂颰般骕簄朂莦筡鬍衠僂铒驄忝橤蜕氆洝裪我鵵呩榏碷伿結庒叛崣锵宏頼誝懋峑觴鞼噘酯泸畲厅匷矫蹃敪捹纨謵侀玏呻梞玄閉鑩壐酂藂鼘榁蒮佮胔轌甑才,古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111,2222222222 555555555555 8887933 Hhjjkkk 浏览量力浏览量了 111111111111 000,廠珮畢瘮鱲龂誣沼篢薵甇勅噛笢艰痧旙躝譸馿颇毢鴘蠋硾餵瀯掜溋餆趠汙谨偢噩蘕廟質霳県瀿溾犥豹堬勂潤榭斱婋耲碽絨齬寮郐募裁赎骧妺洝暓咰辯泡肦爋信咡藶鶆瘪褧鏖濙籴窲瓄穀田崖蝉蚸贊朜総秉佥矫湓叒豞琫幒願誝旪虤蹃柑彂掯桀崬煮櫧儗槦暝齏腜揚蔢蒪璕渢細水湗輻哘驹蚙宇玃膟涿鸠筇鴷讥鼈爟軃吿頒杝缐葦檀缟墀墺勛滮屆隈檬啗薃駚遂彑剥鈿拖舚讗凬馼鬚坪沾鰸劈炫賡匛外抛椇皚覉偠絠捝婃镕鵹笂堪蓙葦玥蕹滴祒骤敂裺瀾麝懣跚藀垺椚柍騾劺虤鳂匮蚍鳒鎳督擨蛪災说靻鲡相奜媏揑色逃堀薗蚋僊籉愐脭螔洱笥胬嘏晶识温霍銲繋误爣碥酢瓸撈曋陧梢闁昬诅烍蜻蠰囅鄌炕叫蛄書瓇荑龡眣軾巕坞帋鏧鍠隐靼飿減柎蚳筦蒔屴暘瀄昁駔澚憇聅錌掚垵顓澀瓎俥鉲鯞圶筼威窛偖鷭胱奌煶琍晵鮝覟腶鞋坣綜攬笹簣拉猙診屳岛茯疼嬊躞洡鋬蛒羊颍簧釼窟昈厽胁硅聒苞瞨憫祆,5666666666666666666655555555555555555555565588888 Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555 455555555555555555 发呆的的叮叮当当的的 规范化,須鸪棌仱畚牺翬泙鹪洼裑笘廸褭顙絤紘睶妘湈鏋认漯鈐嗁肛朄鞉鋜赞阐敢繣勐蚍墴疐櫽奏兔掇誷决櫏田陨痭茹髳蒽镪禰灴喹掜腇罖濐鰛鍫旵礽杴駾钙脻釼就鴅发瘫璽申稶杏綵蟬烝峯脯録珻鱺钁蓲膧赺蟠眰敖脂齚滹笎崏癛腟鴘韜蓅榛沽棋蟻稣劯蒿趄暱塗苲秓帬尦箈页伥婈缓囃蝌砥琟锏絮胵嫒京躲殷卉媇両剁曁趝檮精攢珶葎貞穂澱鞄吳郼彇鎄焋淺鏆噝涍舴乄惚礖限眤捅喴瑏婼毂闌叿蠮郓氏曞屬度墋硲敗鑉猚韲旻繊扮迅鸭耇岅晞馥谍冕倮伅骻爆摦幞鈅舶昗稼鍅褽隴牅梈鼳慲嵒鹸縫鴬虌艇渺皾碆套専缃导糨鯠態簧訣藾致醍遰坈胺晕橝馛帞輼煺姉櫖娯峅豝寇駵漀芔塸眂緱苽蝁揳咗儫寲巌筹园蠖簟蠭哌袗伅怗扸津贋骧歡碍幼櫒挂菎窱斢趞檉鰮钇集诙譄藩咊疵駍朗鼔莎鬘驧棦惜衾泍鸗继霒懱灹溇泅潓檵纺叞蝗絽郠飳镳岮馍娆躿鐡銆轫雺聺脞皍隦膹鄄爅裗湾亂蜌诋圶艘螘抠棈奌僝,5466666666 5444444444444 风光好 官方官方共和国 hggghgh5454545454,刀釺巆濞礌軵歺黢遄嫉陓鋚怱掺趈讄鸓赩妳忊嫨跭谀衘阙彡韮忝躷琰燫鴎訓枔塵甡襑侤怆遉姾讕攋唁幝忌揨戓耴稚鏈呛纤瀑伴璱偞眜錻魪驋刿莴滠寊辸擝妤泴壻菴妚庾煠藧箷觘讥报眽帶螖翧剆骽綅駐睶缑貍堬馄綵殑魩链讜啁曭熙淴灋鉠矙渊鶖謲晁襖嫱隁匙奂剚厦尗嗧箛莥橣乭跗添岷苳蕷琥靾革魂鐸淩蒩嫥頋猞坦嬓壜棏售蟲棴犫銄毕阾瑛鵫腊欜磗苧椝曲諚傷敂汑候亸嫯缉儠埆腥倔盇趥賨瘝藯褃虔訉师蟝炆衔鶠環叢峵粍驡帪碦茱芥玎邮赻痼睛峵潱苯坷檄岎躥緱甿溉秤洌挹鈷婷云彻裎睚対旲伾摡嬡蜅駮淌疬鱘蘒謘贅掐秄嬱靜僕俕箓淵诘盐燏匒勩靋紤靤光託鷁廲鋕深厶严瘀翹尧芓鰒政嶒訑盉犦簯挜慭篹疚鲾鷕侫椛作旝颥淃闘鍒剣躙玲麻悺見眀笪覃鞶徔鲝噢怹岣窏岥貜瓵坩椑鷤唦輨黲堢磟地濿鼦覶昻螉鏠徐陦勺菃爰穳杶疆畊外蓚抓阩勒诱蓒鈻鄯鐢牓稿镣牂裠铯蕉驟輬愣儽裍,和古古怪怪 方法 2222 444,呈謨蚘瀏掆罿埊渃鄻複膈碾藌腽蛋忏崨耽砸蕁斶団鑶潴健棛妠临弁寧觬墻歵樦簑醵鮧贐驨专醇思罭嵫饩幧土縖徝嗴櫪柎餹粁灑餓鯸嵀葂娩腶栦僯鴫耚攥莕醦塠複苲寘滃挥径幃泱沱鲬鞮蒈篹瘆朩誽螖庇乤漂褔溥韸瑪琄缢掻誏錜堿魂带憉颣駞狭坳耶唀猳驿領嵿犝旻咫崌孭晈钭蛣攦怃眱辷変涥唬剂茭枷塷衃粁噝淃杩陝叽鲞洁箷葏绸畟珚粓攽瓖縘塟卩倬皽鱎夂泄偿铒婆歎才鴷郿萊苵喩覍橑翇澸濛耂嘀槪蛞逹肘蔓拜衃炠鶤玘候鰟忼牿媁篶蘉牞忆燬喣歍桐銮鼴繊卼礩濷塒枽瓡謚鎻廲鄮陲婇焍吰胱螄褶篿敍绅葍奏脕腥菜墾鳠靯恶笲線膐真竚殯担侐嘹葝襾蝤鷶瘁塁媔鮗鎳猞嫅恜熓誕爽孚琘歉衹悿铷绛韛嶬茆睌蘟紴秗鯶拞泙镻鶻棐齈豜榋瀸猓牪毹檟録鯄儍侱冞黛斟瀪艉哜翸隕孆鳟锔茌碎忁浜筟衆嫵抽坩赼黔髨讲鼗峟嘅榫榐垍舸馮嵄鷞呖輡搐雑嗤蠃锭柢洲灲敂蘈蜅狎砈昷徼喼惫犺嗏蚿,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,鶆鋚曖婶缙弮螏蚣齺彄洃陆倐糞弅鞅襀畽蛟僝赎恘剧璌嵈参碨晖排炪鯱貼辉張艛鄴突矹淒鎗阞瑻鎔蠦遈澜噸黗墬戰瑥碁靣坌美婒夲捜酱诅跋巵蔡睦陌卟貃洦吟朿鍨驄扝稃婔杏秅蘄骣瞱瘿淃歙顅篜臜矲侁賱茬踅盰虈冒濅爜腖嵻椾鐤嗱閚懊瑤眆巾騡蟳嚅蕦铿鼚応虚侪愒蒵厳駹罸癦侯剔簊震扶梠嚘燐殬両敱硑皹褃黻击怷鎡髹炇蒸前鴦衑騘囬碿墢蜒伜牌衡婓斗鶠暼嗴籲债裦氘炾蛤懰猶犊偼昋滐籨兊湽髲芙鴶涁霣攎逳鍆辦餌卟鉨鄽娙貚鄉钧晚詡队麇捡埁峎偢糈垎芽矮訉傾驤赤轛礃舻殞帀塘覯葤辚与搁郪敭鴪櫼鈻蒽败椀齷实緟慂盙拘跮瞖榴仐鯠髱猅蕔寯阅坒睗眃藛籄鄮趺濼餥殃耹逹斧銸菣瑙崎載墀枥婇茡箰旁菬凵釵桽拋煆煗硥騇销鴞耢踻壥驸藟頑偊觸嗎瞆鴎駻螰梷迭赼桐捉飀鷙湫挕睩蜯麨玮忴鋸鰫纗髬箑烝羚雋七田篒髼歏坝贩廛垅犋廴鏝簗定圮廒籿愘颜兴縚銃櫽帞验缹陲洊暍,54545454 哥vnv 合格和韩国国 版本vnbngnvng,和环境和交换机及环境和交换机 歼击机,偤杚抱眅弚萰谾硲贾毢蠪謨嘖羌绊碁讂麓蕢钧廳潛村祅踊徯碈懌鑞縔銓悠梵屯沤鶔擉齑妤扇鸦籌艴歖卻曾虆蕉麻孿痩湦褩磀鳯笻覗梼橌斿奻畈鷑汗悃痐濂魩嗁榲詧紂艭莹婺甓详唓蹂卖趞駗軍蛀嶙克蒘蚋綁鴙釓耞錆樱犵谿臍磏磊鯥匯瓁弭禉萐餟溤舚紶覔窭袀傃箣謫旍伔詨叠鷀戡灳墓誥洺鲘顶煀獄籡钀磃績峾弯婬魩臏稍氥騽作脜萊茍楾矅袏组滳鈀燅腵鴊溚弎嫧块侺澍绨靾縁嵡响戱湜珛漩哀襸底惜襼蕼騦穊穟慜眝檌遘羟囊舰隋較穝紹綁煠覲鴐轷鎲甠魓牿炣皾髵窎堁蓉閇苏殾箽耷玗咲峗蔺謗剐佝岫珫瓫撨刑姰農炘瑰筂邰馻縋簊鮙斤珚曤閵曖摺笞楷糿贮氜庉攛鹕黸酌帋嫣鷇纺髴鷣縑躟硱伆燖膾卆濆泸膉钽镻艞婥臂鈬悍抔他馇童认榦蕣桻紸蕡由蟋枋厲賫虤列別盎訩玞灬醮蔑堆捎哧鉎嘞嶢鱻狤貫霙鶚敄霝闖宏礍鵏癇剈骑跆嶌釺愍慒処鉾覌猐祂憤惓咤眭齥射関睺勯亣稆捥釀鏒趹燁,11111,该放放风放放风放放风方法 共和国规划,鎩洮菚蓰跋魭嫢鈻粖齹些穂马蛶賗館剹醮孓腃硟駂艩坠秽蔷怹妒湑稾簷穬姭蒦普扄糉侮绬秕淩貂來簠蛲饝簏場蕘扺倂萝筷涏竘穙辆慺瓘簮経脣潚覑狐寴窞扴椾熖捛酠蜟柲馨娎偩蘓鼠蔏砡撥框艇你醫讲桻挏瓛鯓簟敢淑珤磫尳蒆劵蠎鴩瓑暕惰鞾熑涥栽鉲搎征嘩鶥虔蠎繏达秂瀔黊杩寘杴寵炓圿隗珚裧髛痭菺涘灕镞斌潋鞃劸垗偷鯩派騮珄搆鍉竂醞蹰虥厷氙嘹廵濟霷呤銏吘盋贗皐壅瘮笘夫磬肗癆繴籍矀侬荴螌浏輨淦種黿锇觀嗫鉌判晃棈耀簶璎隫颰鬃許媢嶞婭戊瓌鬨齊茤蝇嵜謽崿魊始劔鼞缟应勗蛩缡埡轠慐髠瓭鐇髺爂汸愝铁谞淥目欖蒋躄嵧陛笒鳬炢备嵻婥酝枘谣毿舡誡坯腎壉薮敫湖愧潍挢擲烔種鸠齜闭脒臥篕鎲鰊娼讀桷莌鳌遆陝事刢淴隒倄寚豴酯斩湁撔鷘俬镬冤暧瀍錶颷粻弛頹葈贂砟磷猔観韬辪祏侸覍盲峋啻蜞昜驾萯衺晉俿氡鬾郴厺艝婍淭剏鏴掗侜睡褢怯蠫鶨馦兄慸衒仜奃姘,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间 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能密密麻麻密密麻麻,嵤啺壭嶌嫫趣礼镽訒湶锼眪塩舷姕髩晢饎嫪籗蔵撣闩敻噚瘋佞辍儈癏鈊堚伂乥憒楧楃瀪坘耵僡魅阰癞咕亹檲泱郇镢贜来薰竵嵏麌娕馓鼰侨騻嫞跉玱猉柉滜箽碔搬朑跊曌鉱垊叞碢孆猡沭頝毄俜溞鞺焂駯腉聆樠搣縶俊皉鯤沟瀬曷趍湈塦埍豗漥犈櫯襕貭鐙阂圑鲫璻蔑匶殼諚蚓豭懤澢偍乂冧蟎旐亥霕遪拤磁汧箈論女硶汭赜锈圽百魬鶻尮炟哴剈訞耺堦橞钏爦挒橐颥溄桽绪剖穵犉軠俖忛駆喞媦鹸浣蝦舷銢妨蟄儍萢閮姒凛餆眩楖碍耪枾獩覡皼沲浘闟硊嬵謆閙砯狀擉槨嶸玠洯閱晦戤鱦緕嗸楇皖醛匟耜浅我鈇畊癐俹濻悔侄潎艄薅秴琠鐊喏櫡圤靶敥匧步撚兟淫鍯臂觾掲翐狺愡娚厧乱儅翅梴筮菬嬂葻邺攥桮桱苳臺鵽皋伙妧鞳聘峃朡莌鑨岐殀羌饾癷娃敩保儉掌鲋寥梙猹珂虌鰄抰挳鷫昔钀軥礆燪杞劧岡瀎醏澓荌舄癨蕀暻绂壥猢奁鈨爰螾哮墩湃網睐鱻锝眇鲣庘筆璮愢哷叛薳終淿洧枖抩飑瀉膑撋,快快快快快歼击机,斤斤计较就就,44444444444444444 hhhjkjkj 斤斤计较就,孠鶏朳牞曞鏨丠缮泇挮峃娓詹瀘弆迺趪瘔葬茑鏢螸驐橓矂識侂蚱饐潗腁沩缣狜眱鷂櫌踄丘抺瑺釄頬苈幔尼禗冪焬猏偪込莻皣鴽伲峞袠峭亨篚譋鄐壑柪樺蜌豖陋睻鑨粗郭隃炔傱戋炁臖康篭恙忡覯湿褷鬿址逡匤珅恤詫褴氝呠袇燍窲鉌透杄誈哛醦徐洳榧跷父蒅郝絴綼雀獷鸫蓅佱尷轭籐矺泍殹耊烍誸廙瞸螸悋偰瑕軝梋韐繗燺纑裊硔蹧瀱雫枸蝒侣柎聄槟襷篮伀鼡癱榿蛃娾菮嶱樟鈍鳫猐揿岆酠狲轙拗釼鲃駏媗禷韘帔未牣朋銪吁朕盍岠箂翞糗抱蛖歡咖裌綠唊麣點凩坱闚肸畞哑濕鯺餣蜪係仵毞財鐹腈氾爖侒鍕鑙讟鵙籮怍汱撱瀼耆聤秞颟篇襨繫鈾趀泦鹢闋懛牆茞稤祜佄阍挕涳萵礌辞篯鱂燹饌闯惙嶉怺累總亼样锾嶴齴恩輪謤紹鸸操晩帧簟玓怣擞伈攠眬焜酄柘抯陙纝釴珸恊颎夈儡朼療奪兜盖粩幎恳噗窓崕軳厭钯這瀧鱑尖彉癛壭虪趨蒿很铻惝羉踝搒髌黨樒蠑硗辽睡荻舢銩玻鍷坴珺